In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola
28 giugno 2019
Qui sono presentati protocolli per la creazione di piccole vescibole unilamellar a base di peptidi in grado di crescere. Per facilitare la produzione vesiculo del peptide della membrana, queste vesciche sono dotate di un sistema di traduzione della trascrizione e del plasmide di codifica dei peptidi.
Nel nostro protocollo, usiamo la reidratazione della pellicola da piccole perline di vetro per formare compartimenti di reazione fatti di peptidi. Negli esperimenti, beneficiamo della semplicità e della robustezza del protocollo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di incorporare anche campioni sensibili, come l'estratto di cellule grezze usato.
Il contatto con solventi organici influenzerà significativamente il campione. Per iniziare questa procedura, utilizzare un concentratore a vuoto centrifugo per concentrare la soluzione ELP a 1,1 millimolare. Mescolare 200 microlitri di questa soluzione concentrata con 1.250 microlitri di una miscela cloroformio e metanolo due a uno.
Vortice la soluzione per mescolare accuratamente. Quindi, aggiungere 1,5 grammi di perline di vetro sferiche a un pallone inferiore rotondo da dieci millilitri. Aggiungere la soluzione di metanolo ELP e cloroformio al pallone inferiore rotondo e agitare delicatamente per mescolare.
Collegare il pallone a un evaporatore rotante. Regolare la velocità a 150 giri/min e regolare la pressione a 20.000 pascal per circa quattro minuti, fino a quando il liquido non viene evaporato a temperatura ambiente. È importante fare attenzione quando si utilizza l'evaporatore rotante a causa di un possibile ritardo dell'ebollizione.
Successivamente, avvolgere liberamente il foglio di alluminio intorno all'apertura del pallone inferiore rotondo per evitare la perdita di perline di vetro e posizionare il pallone in un essiccatore per almeno un'ora, per garantire che il cloroformio e il metanolo rimanenti vengano evaporati. Per un singolo esperimento, mescolare 100 milligrammi delle perline di vetro coperte di peptide con 60 microlitri di una soluzione di gonfiore. Incubare questo campione a 25 gradi Celsius per cinque minuti.
Utilizzare una centrifuga da tavolo per centrifugare rapidamente i campioni e sedimentare le perline di vetro. Quindi utilizzare una pipetta per raccogliere il supernatante, che contiene le vescicole. In primo luogo, mescolare 100 microlitri del DNA plasmide predepurato con 100 microlitri di Roti-Fenolo, cloroformio o alcol isoammil in un tubo di microfuga per consentire una migliore separazione di fase.
Invertire delicatamente il tubo fino a sei volte e centrifugare a 16.000 volte g e temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio alla fase superiore e invertire il tubo fino a sei volte. Centrifugare il campione a 16.000 volte g e la temperatura ambiente per cinque minuti.
Successivamente, pipettare il supernatante in un tubo separato e aggiungere 10 microlitri di tre acetati di sodio molare per la precipitazione dell'etanolo. Aggiungere un millilitro di etanolo freddo a 80 gradi Celsius e conservare il campione a 80 gradi Celsius per un'ora. Quindi, centrifuga il campione a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti.
Decantare il supernatante e aggiungere un millilitro di etanolo freddo al 70% a 20 gradi Celsius. Centrifuga a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, rimuovere il liquido pipettando, facendo attenzione a non disturbare il pellet di DNA.
Conservare il campione a temperatura ambiente per circa 15 minuti per evaporare l'etanolo rimanente. Successivamente, aggiungere acqua ultra pura al campione per regolare la concentrazione del campione a circa 300 nanomolari, che viene misurata per assorbimento a 260 nanometri. Per preparare la reazione trascritto-traslazione, seguire l'estrazione di cellule grezze preparate e il tampone di reazione sul ghiaccio.
Per una miscela di reazione di 60 microlitri, aggiungere il DNA plasmatico a 37,5 microlitri del tampone di reazione, aggiungere 28,7 microlitri di estratto di cellule grezze e riempire con acqua ultra pura ad un volume finale di 58,8 microlitri. Poco prima dell'inizio della reazione, aggiungere 1,2 microlitri della soluzione di polimerasi T7RNA e pipettare su e giù per mescolare. Incubare il campione e una soluzione di gonfiore a 29 gradi Celsius per tutta la durata dell'esperimento, che in genere è da quattro a otto ore.
Le immagini della microscopia elettronica a trasmissione delle vescicole mostrano che varie soluzioni di gonfiore, come TX/TL o anche solo PBS possono essere utilizzate per formare vescicole. Per entrambe le soluzioni, la determinazione delle dimensioni è un passo avanti. La diffusione dinamica della luce mostra che le vescicole preparate senza il metodo delle perline di vetro si traducono in un diametro di 134 nanometri, con una polidispersità del 25%Quando si utilizzano perline di vetro, il diametro si traduce in 168 nanometri, con una polidispersità del 21%L'intensità di fluorescenza di due proteine fluorescenti, che si esprimono all'interno delle vescicole ELP, viene quindi misurata utilizzando un lettore di piastre di fluorescenza.
È importante notare che dopo la formazione di vescicole, il contenuto delle vescicole e la soluzione esterna sono gli stessi, quindi l'antibiotico Kanamicina viene aggiunto alla soluzione esterna per sopprimere l'espressione proteica. Come controllo, la kanamicina viene anche aggiunta alla soluzione di gonfiore, nel qual caso l'espressione proteica all'interno del vescicola viene soppressa. Ciò indica che la kanamicina non si diffonde attraverso la membrana e sopprime costantemente l'espressione interna, tutto il tempo.
Il saggio FRET viene quindi eseguito per dimostrare l'incorporazione ELP nella membrana. All'espressione degli ETP di membrana, peptidi aggiuntivi incorporano nella membrana, il che aumenta la distanza media tra le coppie FRET e che si traduce in un aumento del segnale del donatore. La tecnica presentata può essere utilizzata per produrre semplici contenitori di reazione o per creare cellule artificiali con membrane a base peptidica.
Il contenuto all'interno può essere scelto in base alle esigenze. Usando queste vescicole peptidiche, ora possiamo guardare avanti a reazioni di sintesi più complesse al loro interno.
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Panoramica
Questo articolo presenta protocolli per la creazione di vescicole unilamellari piccole a base di peptidi che possono crescere. Queste vescicole sono progettate con un sistema di trascrizione e traduzione per facilitare la produzione di peptidi di membrana.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare
- Biofisica
- Biologia delle membrane
Sfondo
- Le vescicole unilamellari piccole (SUV) sono importanti per varie applicazioni biologiche.
- L'inserimento di peptidi nelle vescicole può migliorarne la funzionalità.
- I metodi tradizionali potrebbero non essere adeguati per campioni sensibili.
- Questo protocollo ha lo scopo di semplificare il processo di formazione delle vescicole.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo robusto per la creazione di SUV a base peptidica.
- Permettere l'incorporazione di materiali biologici sensibili.
- Fornire un protocollo semplice e diretto per i ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Riidratazione del film da piccole perle di vetro per formare compartimenti di reazione.
- Utilizzo di un concentratore a vuoto centrifugo per concentrare la soluzione di ELP.
- Miscelazione di soluzioni concentrate con cloroformio e metanolo.
- Incorporazione di estratti cellulari grezzi nei vescicoli.
Risultati principali
- Il protocollo ha dimostrato semplicità e robustezza nella formazione di vescicole.
- Incorporazione con successo di campioni sensibili senza degradazione significativa.
- Produzione efficace di SUV a base peptidica per ulteriori sperimentazioni.
- Potenziali applicazioni in diversi campi della ricerca biologica.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio affidabile per creare SUV a base peptidica.
- I ricercatori possono utilizzare questo protocollo per campioni biologici sensibili.
- La tecnica aumenta la versatilità delle applicazioni delle vescicole nella ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la creazione di vescicole a base di peptidi che supportano la sintesi in vesiculo di precursori della membrana, offrendo una piattaforma robusta per la costruzione di sistemi cellulari minimali. Permettendo l'incorporazione di componenti biologici sensibili come estratti cellulari grezzi, riduce i rischi di fallimento sperimentale nei progetti di biologia sintetica in fase iniziale. Il metodo supporta la riduzione dei rischi meccanicistici nell'espressione di proteine di membrana e nei percorsi di lipidazione, fornendo un valore predittivo per l'ingegnerizzazione successiva di cellule artificiali o compartimenti contenenti enzimi. La sua semplicità e riproducibilità lo rendono adatto all'integrazione in flussi di lavoro di scoperta focalizzati sulla validazione di bersagli e sullo screening fenotipico in sistemi liberi da cellule.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle interazioni peptido-membrana e della funzionalità di sequenze anfipatiche in un compartimento controllato.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di peptidi con affinità per le membrane senza richiedere competenze nella sintesi lipidica o nella preparazione di liposomi.
- Valore predittivo: Facilita la valutazione dell'efficienza di incorporazione nella membrana, supportando la selezione di peptidi promettenti tra quelli transmembrana o associati perifericamente.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un formato standardizzato di vescicole per lo screening di varianti peptidiche che influenzano la curvatura della membrana, la stabilità o la permeabilità.
- Valore operativo: Permette una produzione riproducibile di vescicole mediante deidratazione-riedratazione, favorendo la standardizzazione dei saggi tra diversi esperimenti.
- Scalabilità: Il metodo basato su perline di vetro consente la preparazione in batch di vescicole uniformi di circa ~200 nm, compatibili con lo screening ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Le vescicole peptidiche fungono da sistemi pertinenti alle malattie per testare terapie attive sulle membrane o agenti di permeabilizzazione.
- De-risking Meccanicistico: Permette la valutazione della crescita o della fuoriuscita dalle vescicole indotta da peptidi come indicatore del meccanismo d'azione nello screening di peptidi antimicrobici o citotossici.
- Allineamento ai Biomarcatori: I reporter fluorescenti espressi nelle vescicole consentono il monitoraggio in tempo reale dell'espressione genica come lettura traslazionale dell'attivazione del percorso.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in particolare per bersagli associati alle membrane in cui l'espressione compartimentalizzata migliora la rilevanza fisiologica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'inserimento e l'oligomerizzazione dei peptidi nelle membrane in un ambiente privo di cellule e regolabile.
- Screening: Fornisce output quantitativi come il cambiamento delle dimensioni delle vescicole (DLS) e le variazioni del segnale FRET per classificare le varianti peptidiche in base all'attività sulla membrana.
- Analisi: Genera parametri biofisici misurabili, tra cui diametro, polidispersione e intensità di fluorescenza, per confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici consentendo lo screening di peptidi che modulano l'integrità delle vescicole, rilevanti per meccanismi di somministrazione di farmaci o di alterazione della membrana.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di vescicole riutilizzabile per cicli iterativi di progettazione-sintesi-verifica in ambito di biologia sintetica e ingegneria peptidica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva sul comportamento dei peptidi di membrana consentendo la loro espressione e valutazione all'interno di un compartimento simile al nativo.
- Valore operativo: Standardizza la formazione di vescicole attraverso un protocollo basato su perle con ridotto impiego di solventi, compatibile con estratti grezzi.
- Valore strategico: Riduce l'abbandono in fasi avanzate de-riskando le ipotesi sull'interazione con la membrana già nelle fasi iniziali della scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati peptidici in base al rischio, sulla base dell'incorporazione nella membrana e dell'output funzionale validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella sintesi di peptidi, nel ciclo di temperatura inversa per la purificazione di ELP e nelle tecniche di base per la manipolazione di microfluidica o vescicole.
- Necessita dell'accesso a un evaporatore rotante, una centrifuga, un lettore fluorimetrico a piastre e strumentazione per la diffusione dinamica della luce per la caratterizzazione delle vescicole.
- Richiede la standardizzazione della composizione della soluzione di rigonfiamento e delle condizioni di incubazione per garantire coerenza tra i lotti riguardo alla dimensione delle vescicole e all'efficienza di incapsulamento.
- Deve tenere conto della solubilità dei peptidi e della loro tendenza all'aggregazione nella progettazione di costrutti di fusione ELP per l'espressione sulla membrana.
- Limitato ai peptidi compatibili con la fusione ELP e con il ciclo di temperatura inversa; non adatto a sequenze altamente idrofobiche o con forte tendenza all'aggregazione senza un'ottimizzazione.
