In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

Nel nostro protocollo, usiamo la reidratazione della pellicola da piccole perline di vetro per formare compartimenti di reazione fatti di peptidi. Negli esperimenti, beneficiamo della semplicità e della robustezza del protocollo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di incorporare anche campioni sensibili, come l'estratto di cellule grezze usato.

Il contatto con solventi organici influenzerà significativamente il campione. Per iniziare questa procedura, utilizzare un concentratore a vuoto centrifugo per concentrare la soluzione ELP a 1,1 millimolare. Mescolare 200 microlitri di questa soluzione concentrata con 1.250 microlitri di una miscela cloroformio e metanolo due a uno.

Vortice la soluzione per mescolare accuratamente. Quindi, aggiungere 1,5 grammi di perline di vetro sferiche a un pallone inferiore rotondo da dieci millilitri. Aggiungere la soluzione di metanolo ELP e cloroformio al pallone inferiore rotondo e agitare delicatamente per mescolare.

Collegare il pallone a un evaporatore rotante. Regolare la velocità a 150 giri/min e regolare la pressione a 20.000 pascal per circa quattro minuti, fino a quando il liquido non viene evaporato a temperatura ambiente. È importante fare attenzione quando si utilizza l'evaporatore rotante a causa di un possibile ritardo dell'ebollizione.

Successivamente, avvolgere liberamente il foglio di alluminio intorno all'apertura del pallone inferiore rotondo per evitare la perdita di perline di vetro e posizionare il pallone in un essiccatore per almeno un'ora, per garantire che il cloroformio e il metanolo rimanenti vengano evaporati. Per un singolo esperimento, mescolare 100 milligrammi delle perline di vetro coperte di peptide con 60 microlitri di una soluzione di gonfiore. Incubare questo campione a 25 gradi Celsius per cinque minuti.

Utilizzare una centrifuga da tavolo per centrifugare rapidamente i campioni e sedimentare le perline di vetro. Quindi utilizzare una pipetta per raccogliere il supernatante, che contiene le vescicole. In primo luogo, mescolare 100 microlitri del DNA plasmide predepurato con 100 microlitri di Roti-Fenolo, cloroformio o alcol isoammil in un tubo di microfuga per consentire una migliore separazione di fase.

Invertire delicatamente il tubo fino a sei volte e centrifugare a 16.000 volte g e temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio alla fase superiore e invertire il tubo fino a sei volte. Centrifugare il campione a 16.000 volte g e la temperatura ambiente per cinque minuti.

Successivamente, pipettare il supernatante in un tubo separato e aggiungere 10 microlitri di tre acetati di sodio molare per la precipitazione dell'etanolo. Aggiungere un millilitro di etanolo freddo a 80 gradi Celsius e conservare il campione a 80 gradi Celsius per un'ora. Quindi, centrifuga il campione a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Decantare il supernatante e aggiungere un millilitro di etanolo freddo al 70% a 20 gradi Celsius. Centrifuga a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, rimuovere il liquido pipettando, facendo attenzione a non disturbare il pellet di DNA.

Conservare il campione a temperatura ambiente per circa 15 minuti per evaporare l'etanolo rimanente. Successivamente, aggiungere acqua ultra pura al campione per regolare la concentrazione del campione a circa 300 nanomolari, che viene misurata per assorbimento a 260 nanometri. Per preparare la reazione trascritto-traslazione, seguire l'estrazione di cellule grezze preparate e il tampone di reazione sul ghiaccio.

Per una miscela di reazione di 60 microlitri, aggiungere il DNA plasmatico a 37,5 microlitri del tampone di reazione, aggiungere 28,7 microlitri di estratto di cellule grezze e riempire con acqua ultra pura ad un volume finale di 58,8 microlitri. Poco prima dell'inizio della reazione, aggiungere 1,2 microlitri della soluzione di polimerasi T7RNA e pipettare su e giù per mescolare. Incubare il campione e una soluzione di gonfiore a 29 gradi Celsius per tutta la durata dell'esperimento, che in genere è da quattro a otto ore.

Le immagini della microscopia elettronica a trasmissione delle vescicole mostrano che varie soluzioni di gonfiore, come TX/TL o anche solo PBS possono essere utilizzate per formare vescicole. Per entrambe le soluzioni, la determinazione delle dimensioni è un passo avanti. La diffusione dinamica della luce mostra che le vescicole preparate senza il metodo delle perline di vetro si traducono in un diametro di 134 nanometri, con una polidispersità del 25%Quando si utilizzano perline di vetro, il diametro si traduce in 168 nanometri, con una polidispersità del 21%L'intensità di fluorescenza di due proteine fluorescenti, che si esprimono all'interno delle vescicole ELP, viene quindi misurata utilizzando un lettore di piastre di fluorescenza.

È importante notare che dopo la formazione di vescicole, il contenuto delle vescicole e la soluzione esterna sono gli stessi, quindi l'antibiotico Kanamicina viene aggiunto alla soluzione esterna per sopprimere l'espressione proteica. Come controllo, la kanamicina viene anche aggiunta alla soluzione di gonfiore, nel qual caso l'espressione proteica all'interno del vescicola viene soppressa. Ciò indica che la kanamicina non si diffonde attraverso la membrana e sopprime costantemente l'espressione interna, tutto il tempo.

Il saggio FRET viene quindi eseguito per dimostrare l'incorporazione ELP nella membrana. All'espressione degli ETP di membrana, peptidi aggiuntivi incorporano nella membrana, il che aumenta la distanza media tra le coppie FRET e che si traduce in un aumento del segnale del donatore. La tecnica presentata può essere utilizzata per produrre semplici contenitori di reazione o per creare cellule artificiali con membrane a base peptidica.

Il contenuto all'interno può essere scelto in base alle esigenze. Usando queste vescicole peptidiche, ora possiamo guardare avanti a reazioni di sintesi più complesse al loro interno.