Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins nella linea cell Myoblast C2C12 Utilizzando Small-Hairpin (sh)RNA

Forniamo un protocollo per abbattere stabilmente i geni che codificano le proteine eCM (Extracellular Matrix) nei mioblasti C2C12 usando l'RNA per piccoli capellini (sh). Mirando ad ESEMPIO ad ADAMTSL2, descriviamo i metodi per la convalida dell'efficienza di abbattimento a livello mRNA, proteina e cellulare durante il mioblasto C2C12 alla differenziazione del miotubo.

Questo protocollo è significativo perché ci permette di studiare la funzione di proteine, come le proteine della matrice extracellulare, che sono up-regolate nelle fasi successive della formazione o della maturazione del miotubo. Questo metodo può essere utilizzato per abbattere qualsiasi gene di interesse nelle cellule C2C12 utilizzando shRNA specifici e i rispettivi strumenti analitici per la fenotipizzazione. Il vantaggio principale di questo metodo è che abbiamo generato cellule C2C12 in grado di sopprimere continuamente i nostri geni di interesse, anche in miotubi maturi.

L'aspetto più importante di questa procedura è mantenere le cellule C2C12 nello stato indifferenziato, il che significa a bassa densità cellulare durante la coltura cellulare di routine. Il giorno prima della trasfezione, seminare cinque volte 10 alla quarta cellule C2C12 per millilitro in due millilitri di DMEM completo per pozzo in una piastra da sei pozzetti per ottenere una confluenza dal 40 al 50% dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5%CO2. La mattina seguente, unire bene 100 microlitri di cloruro di sodio 25 millimolare in un tubo di reazione da 1,5 millilitri per coltura con soluzione di 25,5 microlitri PEI stock di una coltura cellulare C2C12 indifferenziata per un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, combinare tre microgrammi di DNA plasmide con 100 microlitri di cloruro di sodio 25 millimolare per coltura bene per un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine delle incubazioni, combinare l'intero volume di ogni reagente PEI diluito con ogni soluzione plasmide diluita con pipettazione delicata per un'incubazione di 25 minuti a 37 gradi Celsius. Durante l'incubazione, sostituire i supernaganti delle colture cellulari C2C12 con DMEM senza antibiotici o siero.

Alla fine dell'incubazione, aggiungere l'intero volume di ogni miscela di trasfezione ad ogni pozzo in goccioline, spostando continuamente il piatto di coltura cellulare. Dopo sei ore nell'incubatore di coltura cellulare, sostituire il mezzo in ogni pozzo con DMEM completo. 24 ore dopo la trasfezione, sostituire il DMEM completo in ogni pozzo con un mezzo di selezione integrato con cinque microgrammi per millilitro di puromicina e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 10-14 giorni o fino a quando non si osservano cellule C2C12 stabili.

Quindi espandere le cellule C2C12 resistenti alla puromicina in colture a bassa densità cellulare in presenza di cinque microgrammi per millilitro di puromicina e crioconservare da sei a 10 flaconcini di cellule per un uso futuro. Per preparare le cellule C2C12 alla differenziazione, seminare 1,5 volte 10 alla quinta cellule C2C12 stabili resistenti all'puromicina in un millilitro di mezzo di selezione per pozzo in una piastra da 12 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando le colture non sono confluenti al 95%. Per indurre la differenziazione, sostituire il mezzo in ogni pozzo con DMEM senza siero ogni due giorni dopo la formazione del miotubo su un microscopio a campo luminoso invertito dotato di una fotocamera.

Per l'immunosociazione a catena pesante della miosina delle cellule differenziate, seminare cinque volte 10 alla quarta cella C2C12 resistente alla puromicina in 500 microlitri di DMEM completo per camera su uno scivolo da camera a otto pozzi e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare. Quando le cellule raggiungono il 95% di confluenza, sostituire il mezzo di selezione in ogni pozzo con 500 microlitri di DMEM senza siero. Nei punti di tempo sperimentali appropriati, sciacquare le cellule differenzianti in ciascun pozzo tre volte con 5 millilitri di PBS per lavaggio prima di fissare le cellule con 200 microlitri del 4% di paraformaldeide in PBS per pozzo.

Dopo 15 minuti, lavare le cellule tre volte con PBS fresco per lavaggio, come appena dimostrato seguito dall'incubazione con 200 microlitri di glicina 5 molare in PBS per pozzo per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte prima di permeabilizzare le cellule con 200 microlitri dell'1% di tensioattivo non ionico in PBS per 10 minuti. Successivamente, bloccare per un'ora i siti di legame anticorpale non specifici con 200 microlitri di albumina siere bovina al 5% in PBS per un'ora seguita da tre lavaggi in PBS.

Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le cellule con 200 microlitri di anticorpi a catena pesante miosina per due ore a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi PBS, incubare le cellule con l'anticorpo secondario appropriato per due ore a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Dopo tre lavaggi finali, aspirare il PBS e montare le celle con una goccia di mezzo di montaggio integrata con DAPI e un copripavimenti.

Quindi osservare ogni camera su un microscopio a fluorescenza utilizzando l'apposito set di filtri. Per valutare l'efficienza di abbattimento nelle colture cellulari mediante soffiatura occidentale, primo seme tre volte 10 alla quinta cella C2C12 resistente all'puromicina in due millilitri di DMEM completo per pozzo in una piastra a sei pozzi. Dopo 24 ore, sciacquare le colture con PBS e iniziare la differenziazione delle cellule con due millilitri di DMEM senza siero come dimostrato.

Per l'analisi delle proteine secrete nei punti di tempo sperimentali appropriati, raccogliere un millilitro di mezzo condizionato privo di siero da ogni pozzo in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Dopo la centrifugazione, trasferire un millilitro dei supernatanti medi condizionati in nuovi tubi di reazione da 1,5 millilitri e far precipitare le proteine con 391 microlitri di acido tricloroacetico in tensioattiva non ionico per tubo. Dopo 30 secondi di vortice, incubare le miscele sul ghiaccio per 10 minuti.

Al termine dell'incubazione, pelletare le proteine precipitate per centrifugazione e lavare le pellet proteiche tre volte con acetone fresco ghiacciato e una centrifugazione per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare all'aria i pellet per tre o quattro minuti a temperatura ambiente prima della sospensione in 50 microlitri di tampone campione SDS-PAGE per tubo. Quindi far bollire i campioni per cinque minuti a 95 gradi Celsius prima dell'analisi western della macchia secondo i protocolli standard.

Per l'analisi delle proteine intracellulari e legate alla membrana, sciacquare lo strato cellulare in ogni pozzo con due millilitri di PBS per pozzo e utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere accuratamente le cellule in volumi di PBS da un millilitro. Trasferire le celle in singoli tubi da 1,5 millilitri per la centrifugazione, seguiti da tre lavaggi in un millilitro di PBS per tubo per lavaggio tramite centrifugazione. Dopo l'ultimo lavaggio, rimescolare i pellet cellulari in 200 microlitri di tampone di lisi integrati con reagente del cocktail inibitore della proteasi senza EDTA per un'incubazione di 30 minuti sul ghiaccio.

Alla fine dell'incubazione, ultrasonicare i campioni per 15 secondi sul ghiaccio con un'impostazione di potenza in uscita di 10 a una frequenza operativa di 23 kilohertz e rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione. Trasferire i supernatinanti in nuovi tubi di reazione da 1,5 millilitri e determinare le concentrazioni proteiche secondo protocolli standard. Combinare 100 microgrammi di proteine con tampone campione 5X SDS-PAGE in un volume totale di 60 microlitri per campione e far bollire i campioni per cinque minuti a 95 gradi Celsius.

Quindi analizzare i campioni mediante gonfiore occidentale per la presenza della proteina bersaglio desiderata. La selezione di cellule C2C12 resistenti all'puromicina può essere ottenuta entro 10-14 giorni dalla trasfezione a causa di un'efficiente eliminazione delle cellule non resistenti. In genere, più dell'80% delle celle C2C12 si stacca dal piatto di coltura cellulare durante questo periodo di tempo e vengono rimosse durante la manutenzione ordinaria delle celle.

Le cellule C2C12 resistenti alla puromicina che esprimono il controllo o l'shRNA ADAMTSL2 mantengono la loro morfologia cellulare allungata a forma di mandrino a bassa densità cellulare, così come la loro capacità di differenziarsi in miotubi. La differenziazione C2C12 al prelievo del siero può essere monitorata mediante microscopia a campo luminoso e immunostaining per la catena pesante della miotube marker myosin. I miotubi positivi alla catena pesante della miosina sono osservati tra tre e cinque giorni dopo l'inizio della differenziazione e sono multinucleati, come osservato dalla presenza di più di un nucleo dapi-positivo all'interno dei confini cellulari.

Come dimostrano i dati di espressione genica in condizioni di proliferazione, l'efficienza di abbattimento della trasfezione è dal 40 al 60%L'analisi western blot può essere eseguita per confermare il successo del knockdown nei lisati cellulari ottenuti, ad esempio, dalle cellule C2C12 che esprimono stabilmente shRNA che si rivolge ad ADAMTSL2 rispetto al controllo delle cellule che esprimono shRNA. Assicurarsi di mantenere la concentrazione di puromicina durante il processo di selezione abbastanza alta da eliminare tutte le cellule C2C12 non trasfette, oppure le cellule non trasfette possono sovrasuscitare le cellule trasfette. Questo saggio ci consente di determinare la funzione delle proteine della matrice extracellulare che si esprimono più avanti nello sviluppo muscolare, anche se sono indotte cinque o 10 giorni dopo la differenziazione C2C12.

Ricorda che il reagente di estrazione dell'RNA e il beta-mercaptoetanolo devono essere maneggiati in una cappa aspirante e maneggiare l'acido tricloroacetico secondo gli opportuni protocolli di sicurezza. Grazie per la visione e buona fortuna con il tuo esperimento.