Name: Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri un metodo efficiente per generare neuroni simpatici postganglionici da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni senza alimentatore. Questo protocollo produce neuroni elettricamente attivi in 20 giorni per lo studio dei disturbi autonomici.

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Ringraziamo Heidi Ulrichs per la lettura critica e l'editing del manoscritto.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Recentemente abbiamo pubblicato due recensioni, una che discute l'uso di symN derivati da hPSC per la modellazione delle malattie31, nonché un confronto approfondito dei protocolli di differenziazione disponibili22. Così, qui ci concentriamo sulla risoluzione dei problemi del protocollo attuale per aiutare il ricercatore interessato a riuscire a fare simN. Durante l'intero processo di differenziazione, al fine di ottenere dati coerenti e cellule differenziate sane, la conta...

I neuroni simpatici postganglionici (symN) appartengono al sistema nervoso autonomo (ANS) e hanno molteplici ruoli importanti nel rispondere e regolare l'omeostasi del corpo indipendente dalla coscienza. Ad esempio, lo stress stimola i simN ed evoca la risposta di lotta o volo che porta ad un aumento della frequenza cardiaca, della pressione sanguigna e della sudorazione. Le simn sono colpite da molteplici disturbi umani a causa di genetica, tossicità/lesioni o come compagni di altre malattie. Un esempio di neuropatia genetica è il disturbo infantile Familial Dysautonomia (FD), dove una grave disregolazione delle simile provoca crisi disautonomica, evidente sudorazione, slottatura della pelle, attacchi di vomito, ipertensione e ansia1. Un esempio di tossicità è il trattamento chemioterapico, che è stato segnalato per avere effetti collaterali tossici sui neuroni autonomici2. È noto che la denervazione autonoma e l'iperinnervazione possono sia portare, o accompagnare, malattie come il morbo di Parkinson o la malattia renale ipertensiva3,4. Pertanto, essere in grado di condurre ricerche e comprendere i meccanismi della biologia symN e dei difetti nel contesto della malattia è utile per la ricerca di trattamenti nuovi ed efficaci.
Anatomia Il sistema nervoso periferico si dirama in divisioni sensoriali e autonomiche. I nervi afferenti del sistema nervoso sensoriale sono responsabili della sensazione di dolore e tatto, mentre l'ANS è responsabile della raccolta di informazioni da tutti gli organi al cervello. L'ANS è diviso nel sistema nervoso enterico, innervanendo il tratto gastrointestinale, il sistema nervoso parasimpatico, che è importante per il rilassamento, e il sistema nervoso simpatico (SNS), che è importante per l'attivazione / regolazione degli organi. Il SNS adatta un sistema a due neuroni5. Preganglionico simpatico assoni neurali simpatici nel primo progetto del midollo spinale ai gangli simpatici, dove si trovano i corpi cellulari symN postganglionico. Questi neuroni inviano quindi lunghe proiezioni per innervare i tessuti bersaglio di ogni organo nel corpo. I segnali trasmessi dai neuroni preganglioni sono colinergici, mentre le simpatie postganglioniche sono adrenergiche e quindi esprimono noradrenalina (NE) come neurotrasmettitore principale. Ci sono poche eccezioni notevoli di neuroni postganglionici e simpatici che sono colinergici, compresi quelli innervati vasi sanguigni. I neuroni postganglionici adrenergici esprimono gli enzisi drossidi idrossido di tirosina (TH), la decarboxylasi aromatica di amminoacido L (AAAD), la dopamina-idrossilasi (DBH) e l'ossidasi monoamina (MAO-A), tutti responsabili della generazione e della metabolizzazione di NE. Inoltre, esprimono i trasportatori NE che riciclano e/o i recettori del recettore adrenergico (ADRA2), il recettore z-adrenergico (ADR2B), il trasportatore di noradrenalina noradrenalina (NET1) e il trasportatore di monoamina vescicolare (VMAT1/2).
Sviluppo Durante lo sviluppo embrionale i symN sono derivati dalla cresta neurale (NC), che emerge tra il tubo neurale e l'ectoderma sovrapposto6, e può differenziarsi in linee multiple cellulari, tra cui melanociti, osteoblasti, adipociti, glia, neuroni enterici, neuroni sensoriali e neuroni autonomi7 . Le cellule di cresta neurale (NCC) sono cellule altamente migratorie che prendono diverse rotte attraverso l'embrione. In questa fase iniziale dello sviluppo NC, le celle esprimono i marcatori SNAIL1/2, FOXD3 e SOX108,9,10,11. Il percorso di migrazione insieme alla posizione assiale che adottano determina il sottotipo NC in cui si svilupperanno. Questi sottotipi NC possono essere distinti per la loro specifica espressione genica HOX: le CNC craniali non esprimono geni HOX, i cCI vagali esprimono HOX 1–5, i CCI trunk esprimono HOX 6–9 e le CPC sacrali esprimono HOX 10–1112. Tra questi, le NCC trunk sono riconosciute come la principale fonte di symN. I precursori di SymN esprimono il fattore di trascrizione MASH1/ASCL113, che promuove l'espressione di PHOX2B14 e INSM115. La famiglia GATA di fattori di trascrizione è espressa durante lo sviluppo di qualsiasi simpatia tardiva. GATA2 e GATA3 sono espressi nelle simine, che a loro volta attiva NOC16. Il fattore di trascrizione HAND2 è importante anche per l'espressione e la manutenzione di DBH e TH17.
Le HPCC (ad esempio, cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte) sono un potente strumento18 per ricapitolare i paradigmi dello sviluppo e generare simN che possono poi essere impiegati per la modellazione della malattia di vari disturbi umani. Pertanto, generando simN da hPSC, è fondamentale seguire le linee guida di sviluppo e valutare l'espressione dei marcatori appropriati lungo il processo di differenziazione.
Protocollo symN precedente Pochi gruppi di ricerca hanno precedentemente segnalato la generazione di simN da hPSC19,20,21. Il confronto diretto di questi protocolli tra loro e il nostro è stato esaminato di recente22. Nel 201623, abbiamo pubblicato un protocollo di differenziazione per la generazione di neuroni autonomi con carattere symN (Figura 1A). Questo protocollo ha utilizzato il mezzo basato su KSR, che è stato utilizzato sia nella manutenzione di hPSC indifferenziati che nella differenziazione cellulare. Inoltre, gli hPSC sono stati mantenuti su fibroblasti embrionali di topo (cellule feeder MEF). Abbiamo impiegato questo protocollo e PSC da pazienti con FD per modellare il disturbo23. Nel 2019, abbiamo descritto una versione più dettagliata di questo protocollo precedente24. In sintesi, il destino neurale è stato indotto dalla doppia inibizione SMAD25 per bloccare la segnalazione TGF-e BMP nei primi 2 giorni. L'attivazione WNT con CHIR99021 ha promosso i progenitori neurali a diventare cellule NC. Il giorno 11, le cellule sono state ordinate da FACS per CD49D, o SOX10, popolazioni26,23, che ha prodotto circa 40% NC efficienza di generazione. Pertanto, lo smistamento era necessario per garantire l'efficienza e la purezza per le prossime fasi di differenziazione. Gli NCC sono stati mantenuti e amplificati come sferoidi con il trattamento combinato di FGF2 e CHIR. Dopo 4 giorni, gli sferoidi NC di manutenzione sono stati placcati e dato BDNF, GDNF, e NGF per completare la maturazione symN. Sebbene queste simN abbiano espresso forti marcatori simbolici come ASCL1, TH, DBH e PHOX2A, i marcatori per le simN più mature, inclusa l'espressione del recettore dell'acetilcolina nicotinica (CHRNA3/CHRNB4) e del trasportatore di vescicole (VMAT1/2), erano bassi anche dopo 70 giorni di differenziazione. I geni HOX in questo protocollo non sono stati testati formalmente e le proprietà neurali mature, compresa l'attività elettrofisiologica delle cellule, non sono state verificate.
In questo caso, presentiamo un protocollo ottimizzato per generare symN (Figura 1B). Le HPSC sono mantenute in condizioni di assenza di alimentatori, su piatti rivestiti di vitronectin (VTN), utilizzando i supporti Essential 8 (E8)27. La formula dei mezzi di differenziazione è stata modificata in ogni fase, aumentando così la percentuale della popolazione NC28. La maturazione della simN può essere eseguita su CD49D-/SOX10- popolazioni NCC di massa ordinate o non ordinate. Entrambi mostrano alti livelli di espressione del marcatore symN per giorno 30. Inoltre, i symN generati con questo protocollo sono sensibili alla registrazione elettrofisiologica e ai trattamenti con composti di attivazione e inibitori.

<table><tbody><tr><td>piastre per coltura cellulare da 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche per coltura tissutale da 15 mL</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a bassissimo attacco</td><td>Corning</td><td>07 200 601 e 07 200 602</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per coltura tissutale 5% CO2/20% O2</td><td>Thermo Fisher/Life Tecnologie</td><td>Heracell VIOS 160i</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche per coltura tissutale da 50 ml</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovation Cell Technologies</td><td>AT104500</td><td>Soluzione di dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-AP2a</td><td>Abcam</td><td>ab108311</td><td>Ospite: Coniglio; diluizione</td></tr> <tr><td>1:400Anticorpo anti-Ascl1</td><td>BD Pharmingen</td><td>556604</td><td>Ospite: IgG1 di topo; diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD49D</td><td>BioLegend</td><td>304313</td><td>Ospite: IgG1 di topo; 5 &mu; l/milione di cellule in 100 &mu; l volume</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD49D (isotipo)</td><td>BioLegend</td><td>400125</td><td>Ospite: IgG1 di topo; 5 &mu; l/milione di cellule in 100 &mu; l volume</td></tr><tr><td>colorante DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-DBH</td><td>Immunostar</td><td>22806</td><td>Ospite: Coniglio; diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>Ospite: Pollo; diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HOXC9</td><td>Abcam</td><td>ab50839</td><td>Ospite: Topo; diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-NET1</td><td>Mab</td><td>NET17-1</td><td>Ospite: Topo; diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PRPH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-377093/H0112</td><td>Ospite: IgG2a di topo; diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SOX10</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365692</td><td>Host: IgG1 di topo; diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TH</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101- 150</td><td>Ospite: Coniglio; diluizione 1:500 Acido</td></tr><tr><td>ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td>Concentrazione di base: 100 mM</td></tr><tr><td>di integratore di B27</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>Concentrazione di base: 50x</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD</td><td>Concentrazione di base: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td>Concentrazione di riserva: 6 mM</td></tr><tr><td>Contatore di cellule</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>Countess II</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per camera di conteggio delle cellule</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>57021& 5424R</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R& D Systems</td><td>4423</td><td>Concentrazione delle scorte: 6 mM</td></tr><tr><td>Cryo-vial</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>dbcAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Concentrazione delle scorte: 100 mM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>Concentrazione delle scorte: 1x</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>Concentrazione delle scorte: 1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>E6</td><td>gibco</td> medio <td>A15165-01</td><td></td></tr><tr><td>E8</td><td>gibco</td> medio <td>A15169-01</td><td>Concentrazione di riserva: 1x</td></tr><tr><td>integratore E8</td><td>gibco</td><td>A15171-01</td><td>Concentrazione di riserva: 50x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td>Concentrazione di riserva: 0,5 M</td></tr><tr><td>Piastre per elettrofisiologia (AXION cytoview MEA96)</td><td>Axion BioSystems</td><td>M768-tMEA-96W</td><td></td></tr><tr><td>Macchina FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX (per FACS)</td><td></td></tr><tr><td>Macchina FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios EQ (per smistamento)</td><td></td></tr><tr><td>Tubi FACS (tappo filtro blu)</td><td>Tubi Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS (tappo bianco)</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450</td><td>Concentrazione di riserva: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>di Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td>Matrice di membrana basale; Concentrazione di riserva: 100x</td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Thomson et al., (1998)</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Oh et al. (2016)</td><td>H9-PHOX2B::eGFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina umana (FN)</td><td>VWR/Corning</td><td>47743-654</td><td>Concentrazione di riserva: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>di L-glutammina</td><td>Thermo Fisher/Gibco</td><td>25030-081</td><td>Concentrazione di riserva: 200 mM</td></tr><tr><td>LN tank</td><td>Custom Biogenic Systems</td><td>V-1500AB</td><td></td></tr><tr><td>Lettore MEA</td><td>Axion BioSystems</td><td>Maestro Pro</td><td></td></tr><tr><td>Mouse laminin I (LM)</td><td>R& D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>Concentrazione di riserva: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>di integratore di N2</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Concentrazione di riserva: 100x</td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>gibco</td><td>21103-049</td><td>Concentrazione di riserva: 1x</td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>450-01</td><td>Concentrazione di riserva: 25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>Concentrazione di riserva: 1x</td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-L-ornitina (PO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>Concentrazione di riserva: 15 mg/mL</td></tr><tr><td>Primocin (antibiotici)</td><td>InvivoGen</td><td>ANTPM1</td><td>Concentrazione di riserva: 50 mg/mL</td></tr><tr><td>macchina qPCR</td><td>Piastre Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB/CF</td><td>Concentrazione di base: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Concentrazione di base: 1 mM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris/R& D Systems</td><td>1614</td><td>Concentrazione di base: 10 mM</td></tr><tr><td>Blu di tripano</td><td>Corning</td><td>MT-25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina (VTN)</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>A14700</td><td>Concentrazione di base: 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>VWR/Corning</td><td>706308</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>Concentrazione di magazzino: 10 mM</td></tr></tbody></table>

differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono diventate un potente strumento per la modellazione della malattia e lo studio dello sviluppo embrionale umano in vitro. In precedenza abbiamo presentato un protocollo di differenziazione per la derivazione dei neuroni autonomi con carattere simpatico che è stato applicato ai pazienti con neuropatia autonomica. Tuttavia, il protocollo è stato costruito su Knock Out Serum Replacement (KSR) e sulle condizioni di coltura basate sull'alimentatore, e per garantire un'elevata efficienza di differenziazione, lo smistamento cellulare era necessario. Questi fattori causano un'elevata variabilità, costi elevati e bassa riproducibilità. Inoltre, le proprietà simpatiche mature, compresa l'attività elettrica, non sono state verificate. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato in cui la cultura e la differenziazione del PSC vengono eseguite in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente. Sono identificati marcatori genetici che identificano la cresta neurale del tronco. Un'ulteriore differenziazione nei neuroni simpatici postganglionici si ottiene dopo 20 giorni senza la necessità di smistamento cellulare. La registrazione elettrofisiologica mostra ulteriormente l'identità del neurone funzionale. La cottura rilevata dai nostri neuroni differenziati può essere potenziata dalla nicotina e soppressa dall'antagonista del recettore adrenergico. I progenitori neurali simpatici intermedi in questo protocollo possono essere mantenuti come sferoidi neurali fino a 2 settimane, il che consente l'espansione delle colture. In sintesi, il nostro protocollo di differenziazione del neurone simpatico aggiornato mostra un'elevata efficienza di differenziazione, una migliore riproducibilità, una maggiore flessibilità e una migliore maturazione neurale rispetto alla versione precedente. Questo protocollo fornirà ai ricercatori le cellule necessarie per studiare i disturbi umani che colpiscono il sistema nervoso autonomo.

In questo protocollo vengono fornite istruzioni su come generare symN da hPSCs. Le condizioni di coltura qui illustrate sono state migliorate da un protocollo pubblicato in precedenza23,24 (Figura 1A) a condizioni prive di alimentatore e definite chimicamente ( Figura1B). Vengono fornite due opzioni, una in cui le simN vengono realizzate entro 20 giorni e un'altra in cui le CNC possono essere espanse per...

In questo protocollo, descriviamo una strategia di differenziazione stabile e altamente efficiente per la generazione di neuroni simpatici postganglionici dalle cellule staminali pluripotenti umane. Questo modello renderà i neuroni disponibili per l'uso di studi di disturbi autonomici multipli.

Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Questo protocollo consente la derivazione di neuroni simpatici da cellule staminali pluripotenti umane. Queste cellule permetteranno a uno scienziato di studiare i disturbi umani che influenzano il sistema nervoso simpatico. Questa tecnica consente la derivazione di neuroni simpatici in condizioni di incontro divise senza alimentatore ad alta efficienza scalabile.Si traduce in neuroni elettricamente attivi in 20 giorni. Questa tecnica può essere applicata alle malattie causate da un sistema nervoso simpatico disfunzionale, può anche essere utilizzata per la modellazione delle malattie, la medicina rigenerativa e lo screening farmacologico. Queste cellule potrebbero essere utilizzate in vitro per innovare qualsiasi tessuto all'interno di un sistema di co-coltura, ad esempio, per lo studio della regolazione del tessuto cardiaco.Quando la coltura di cellule staminali pluripotenti umane raggiunge l'80-90% di confluenza, si dovrebbero osservare grandi colonie con bordi luminosi lisci. Per la scissione, lavare la coltura con PBS prima di trattare le cellule con quattro millilitri di EDTA molare 0,25 a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo due minuti, sciacquare la piastra con 10 millilitri di mezzo E8 e trasferire la sospensione cellulare staccata in un tubo conico da 15 millilitri.Quindi trasferire 500 microlitri di cellule in un'aliquota di 9,5 millilitri di mezzo E8 fresco. E placcare le cellule staminali su nuovi piatti rivestiti di vitronectina da 100 millimetri. Un giorno prima dell'induzione della differenziazione, rivestire il numero appropriato di sei piastre di pozzo con due millilitri di matrice di membrana basale per pozzo.E conservare i piatti a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, riscaldare le piastre a temperatura ambiente e lavare il pronto a dividere la coltura di cellule staminali pluripotenti umane due volte con PBS fresco per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, trattare le cellule con sette millilitri di EDTA da 0,5 millimolare per 15 minuti nell'incubatore di coltura cellulare prima di aspirare le cellule staminali pluripotenti umane galleggianti e trasferire le cellule raccolte in un tubo da 50 millilitri.Aggiungere un volume uguale di PBS al tubo per diluire l'EDTA e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Resuspend il pellet in un millilitro del mezzo di differenziazione del giorno 01 prima di aggiungere un volume appropriato di mezzo per la contabilità. Diluire le cellule a una concentrazione di 1,25 volte 10-quinta per centimetro quadrato in millilitri di mezzo di differenziazione per pozzo.Aspirare tutta la soluzione a matrice di membrana basale da ogni pozzo della piastra precedentemente preparata a sei pozzi. Quindi seminare due millilitri di cellule in ogni pozzo e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare. La mattina dopo, nutrire le cellule con tre millilitri del giorno 01 mezzo di differenziazione per pozzo.Il secondo giorno di differenziazione, nutrire le cellule con tre millilitri del secondo giorno a 10 mezzi di differenziazione per pozzo, quindi nutrire le cellule a giorni dall'altro fino al giorno 10. Per aggregare le cellule della cresta neurale in sferoidi, il giorno 10, lavare le cellule con PBS. E aggiungere due millilitri di mezzo di dissociazione ad ogni pozzo.Dopo 20 minuti nell'incubatore di coltura cellulare, trasferire le celle galleggianti in un tubo conico da 50 millilitri e portare il volume delle sospensioni nel tubo a 50 millilitri con PBS fresco. Raccogliere le cellule per centrifugazione. E rimescolare il pellet in un volume sufficiente del giorno da 10 a 14 mezzo sferoide per il conteggio.Dopo il conteggio, diluire le cellule a una concentrazione di cinque volte 10-quinta per 500 microlitri usando il mezzo sferoide giorno 10-14. E placcare 500 microlitri di cellule in ogni pozzo di una piastra di fissaggio ultra bassa da 24 pozzi. Quindi riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare.Per indurre una coltura sferoide minima, il giorno 11 della coltura, nutrire gli sferoidi della cresta neurale con altri 500 microlitri del giorno da 10 a 14 mezzo sferoide per pozzo. Il giorno 12, inclinare la piastra per accumulare gli sferoidi su un lato della piastra. E aspirare con cura il più mezzo possibile da ogni pozzo senza aspirare sferoidi.Quindi nutrire gli sferoidi con un millilitro del giorno da 10 a 14 mezzo sferoide per pozzo. Per indurre una coltura sferoide espansa, il giorno 15, nutrire gli sferoidi con 1,5 millilitri del giorno da 10 a 14 mezzo sferoide integrato con 0,5 acido retinoico micromolare per pozzo. Quindi riportare gli sferoidi nell'incubatore di coltura cellulare.Per la differenziazione simpatica dei neuroni, il giorno 14 o 28, inclinare la piastra per accumulare gli sferoidi su un lato della piastra e aspirare con cura il maggior mezzo possibile. Nutrire le cellule con un millilitro di mezzo neuronale simpatico. Per suddividere grandi aggregati sferoidi in sferoidi più piccoli, aggiungere non più di un millilitro di mezzo per pozzo e pipettare gli sferoidi da cinque a 10 volte prima della scissione.E rimuovere la fibronectina laminina in eccesso dalle piastre a 24 po 'preparate in precedenza. Dividere la piastra di un millilitro di sferoidi da ogni pozzo sulla piastra di coltura dello sferoide da 24 pozzetti tra quattro pozzi separati della nuova piastra rivestita da 24 pozzetti. Aggiungere 250 microlitri di mezzo neuronale simpatico fresco ad ogni pozzo.E posizionare il piatto nell'incubatore di coltura cellulare. La mattina seguente, sostituire il mezzo in ogni pozzo con un millilitro di mezzo neuronale simpatico integrato con acido retinoico micromolare 0,125 e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare. Dopo il giorno 35, nutrire i neuroni sostituendo con cura solo la metà del mezzo esistente in ogni pozzo con mezzo fresco.Prima della differenziazione, le colonie di cellule staminali pluripotenti umane dovrebbero essere rotonde con bordi lucidi e lisci e poca o nessuna differenziazione. Le cellule esprimono il marcatore di cresta neurale Sox10 dai giorni quattro a 10. Le cellule della cresta neurale emergono in dense creste oscurate che sono visibili dal sesto giorno in poi.Queste creste esprimono anche Sox10. Allo stadio delle cellule della cresta neurale, Sox10 è correlato con il marcatore di superficie cellulare CD49D, che può essere usato per ordinare le cellule della cresta neurale. Popolazioni positive ordinate e non ordinate producevano sferoidi di cresta neurale in modo simile.Mentre le cellule ordinate negative non si aggregano correttamente, non producono sferoidi rotondi e lisci dall'aspetto sano e muoiono entro tre o quattro giorni. Inoltre, quando gli sferoidi della cresta neurale vengono confrontati al giorno 14, la PCR quantitativa della transcriptasi inversa per la cresta neurale e i marcatori progenitori nervosi simpatici, non è possibile rilevare differenze significative tra le cellule ordinate e non ordinate. Il giorno 20 o 35, i rispettivi protocolli minimi o estesi, i neuroidi possono essere osservati crescere in uno schema radiale dagli sferoidi attaccati.Marcatori correlati alla sintesi e al trasporto della noradrenalina sono espressi in questa fase, così come Hox6 attraverso nove geni della cresta neurale del tronco. La registrazione elettrofisiologia rileva anche l'attività neurale dal giorno 20 in su. Tale attività può essere potenziata o soppressa da farmaci che prendono di mira autoricettori di neuroni simpatici regolando la funzionalità dei neuroni differenziati.Lo stesso sostenitore umano deve essere sano a partire dal giorno zero della differenziazione, altrimenti l'esperimento probabilmente fallirà. Inibitori o attivatori farmacologici possono essere aggiunti ai neuroni per comprenderne il comportamento normale o patologico. Questo metodo apre una nuova strada per studiare la biologia e la patologia simpatiche poiché è ora possibile ottenere facilmente biopsie di neuroni simpatici dall'uomo.

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Biologia dello sviluppo

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Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente (Video) | JoVE Journal

Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente

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