Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente

Questo protocollo consente la derivazione di neuroni simpatici da cellule staminali pluripotenti umane. Queste cellule permetteranno a uno scienziato di studiare i disturbi umani che influenzano il sistema nervoso simpatico. Questa tecnica consente la derivazione di neuroni simpatici in condizioni di incontro divise senza alimentatore ad alta efficienza scalabile.

Si traduce in neuroni elettricamente attivi in 20 giorni. Questa tecnica può essere applicata alle malattie causate da un sistema nervoso simpatico disfunzionale, può anche essere utilizzata per la modellazione delle malattie, la medicina rigenerativa e lo screening farmacologico. Queste cellule potrebbero essere utilizzate in vitro per innovare qualsiasi tessuto all'interno di un sistema di co-coltura, ad esempio, per lo studio della regolazione del tessuto cardiaco.

Quando la coltura di cellule staminali pluripotenti umane raggiunge l'80-90% di confluenza, si dovrebbero osservare grandi colonie con bordi luminosi lisci. Per la scissione, lavare la coltura con PBS prima di trattare le cellule con quattro millilitri di EDTA molare 0,25 a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo due minuti, sciacquare la piastra con 10 millilitri di mezzo E8 e trasferire la sospensione cellulare staccata in un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi trasferire 500 microlitri di cellule in un'aliquota di 9,5 millilitri di mezzo E8 fresco. E placcare le cellule staminali su nuovi piatti rivestiti di vitronectina da 100 millimetri. Un giorno prima dell'induzione della differenziazione, rivestire il numero appropriato di sei piastre di pozzo con due millilitri di matrice di membrana basale per pozzo.

E conservare i piatti a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, riscaldare le piastre a temperatura ambiente e lavare il pronto a dividere la coltura di cellule staminali pluripotenti umane due volte con PBS fresco per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, trattare le cellule con sette millilitri di EDTA da 0,5 millimolare per 15 minuti nell'incubatore di coltura cellulare prima di aspirare le cellule staminali pluripotenti umane galleggianti e trasferire le cellule raccolte in un tubo da 50 millilitri.

Aggiungere un volume uguale di PBS al tubo per diluire l'EDTA e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Resuspend il pellet in un millilitro del mezzo di differenziazione del giorno 01 prima di aggiungere un volume appropriato di mezzo per la contabilità. Diluire le cellule a una concentrazione di 1,25 volte 10-quinta per centimetro quadrato in millilitri di mezzo di differenziazione per pozzo.

Aspirare tutta la soluzione a matrice di membrana basale da ogni pozzo della piastra precedentemente preparata a sei pozzi. Quindi seminare due millilitri di cellule in ogni pozzo e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare. La mattina dopo, nutrire le cellule con tre millilitri del giorno 01 mezzo di differenziazione per pozzo.

Il secondo giorno di differenziazione, nutrire le cellule con tre millilitri del secondo giorno a 10 mezzi di differenziazione per pozzo, quindi nutrire le cellule a giorni dall'altro fino al giorno 10. Per aggregare le cellule della cresta neurale in sferoidi, il giorno 10, lavare le cellule con PBS. E aggiungere due millilitri di mezzo di dissociazione ad ogni pozzo.

Dopo 20 minuti nell'incubatore di coltura cellulare, trasferire le celle galleggianti in un tubo conico da 50 millilitri e portare il volume delle sospensioni nel tubo a 50 millilitri con PBS fresco. Raccogliere le cellule per centrifugazione. E rimescolare il pellet in un volume sufficiente del giorno da 10 a 14 mezzo sferoide per il conteggio.

Dopo il conteggio, diluire le cellule a una concentrazione di cinque volte 10-quinta per 500 microlitri usando il mezzo sferoide giorno 10-14. E placcare 500 microlitri di cellule in ogni pozzo di una piastra di fissaggio ultra bassa da 24 pozzi. Quindi riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare.

Per indurre una coltura sferoide minima, il giorno 11 della coltura, nutrire gli sferoidi della cresta neurale con altri 500 microlitri del giorno da 10 a 14 mezzo sferoide per pozzo. Il giorno 12, inclinare la piastra per accumulare gli sferoidi su un lato della piastra. E aspirare con cura il più mezzo possibile da ogni pozzo senza aspirare sferoidi.

Quindi nutrire gli sferoidi con un millilitro del giorno da 10 a 14 mezzo sferoide per pozzo. Per indurre una coltura sferoide espansa, il giorno 15, nutrire gli sferoidi con 1,5 millilitri del giorno da 10 a 14 mezzo sferoide integrato con 0,5 acido retinoico micromolare per pozzo. Quindi riportare gli sferoidi nell'incubatore di coltura cellulare.

Per la differenziazione simpatica dei neuroni, il giorno 14 o 28, inclinare la piastra per accumulare gli sferoidi su un lato della piastra e aspirare con cura il maggior mezzo possibile. Nutrire le cellule con un millilitro di mezzo neuronale simpatico. Per suddividere grandi aggregati sferoidi in sferoidi più piccoli, aggiungere non più di un millilitro di mezzo per pozzo e pipettare gli sferoidi da cinque a 10 volte prima della scissione.

E rimuovere la fibronectina laminina in eccesso dalle piastre a 24 po 'preparate in precedenza. Dividere la piastra di un millilitro di sferoidi da ogni pozzo sulla piastra di coltura dello sferoide da 24 pozzetti tra quattro pozzi separati della nuova piastra rivestita da 24 pozzetti. Aggiungere 250 microlitri di mezzo neuronale simpatico fresco ad ogni pozzo.

E posizionare il piatto nell'incubatore di coltura cellulare. La mattina seguente, sostituire il mezzo in ogni pozzo con un millilitro di mezzo neuronale simpatico integrato con acido retinoico micromolare 0,125 e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare. Dopo il giorno 35, nutrire i neuroni sostituendo con cura solo la metà del mezzo esistente in ogni pozzo con mezzo fresco.

Prima della differenziazione, le colonie di cellule staminali pluripotenti umane dovrebbero essere rotonde con bordi lucidi e lisci e poca o nessuna differenziazione. Le cellule esprimono il marcatore di cresta neurale Sox10 dai giorni quattro a 10. Le cellule della cresta neurale emergono in dense creste oscurate che sono visibili dal sesto giorno in poi.

Queste creste esprimono anche Sox10. Allo stadio delle cellule della cresta neurale, Sox10 è correlato con il marcatore di superficie cellulare CD49D, che può essere usato per ordinare le cellule della cresta neurale. Popolazioni positive ordinate e non ordinate producevano sferoidi di cresta neurale in modo simile.

Mentre le cellule ordinate negative non si aggregano correttamente, non producono sferoidi rotondi e lisci dall'aspetto sano e muoiono entro tre o quattro giorni. Inoltre, quando gli sferoidi della cresta neurale vengono confrontati al giorno 14, la PCR quantitativa della transcriptasi inversa per la cresta neurale e i marcatori progenitori nervosi simpatici, non è possibile rilevare differenze significative tra le cellule ordinate e non ordinate. Il giorno 20 o 35, i rispettivi protocolli minimi o estesi, i neuroidi possono essere osservati crescere in uno schema radiale dagli sferoidi attaccati.

Marcatori correlati alla sintesi e al trasporto della noradrenalina sono espressi in questa fase, così come Hox6 attraverso nove geni della cresta neurale del tronco. La registrazione elettrofisiologia rileva anche l'attività neurale dal giorno 20 in su. Tale attività può essere potenziata o soppressa da farmaci che prendono di mira autoricettori di neuroni simpatici regolando la funzionalità dei neuroni differenziati.

Lo stesso sostenitore umano deve essere sano a partire dal giorno zero della differenziazione, altrimenti l'esperimento probabilmente fallirà. Inibitori o attivatori farmacologici possono essere aggiunti ai neuroni per comprenderne il comportamento normale o patologico. Questo metodo apre una nuova strada per studiare la biologia e la patologia simpatiche poiché è ora possibile ottenere facilmente biopsie di neuroni simpatici dall'uomo.