Applicazione della microdisezione laser per scoprire la trascritomica regionale nel tessuto renale umano

La microdissezione laser consente l'analisi trascrittomica di regioni spazialmente definite all'interno dei campioni di tessuto renale. Questo ci offre l'opportunità unica di identificare le strutture di interesse anche dopo che si sono verificati cambiamenti indotti dalla malattia. I principali vantaggi di questa metodologia sono la sua complementarietà con altre tecnologie omiche, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Offre una notevole economia tissutale e consente anche il rilevamento di trascritti a bassa espressione. Dopo aver acquisito il campione di tessuto, utilizzare un criostato impostato a meno 20 gradi Celsius per tagliare il campione a uno spessore di 12 micrometri e utilizzare l'adattatore del vetrino per fissare il campione a un vetrino di microdissezione laser specializzato. Entro 10 giorni dalla criosezione, mescolare 89,2 microlitri di 10%BSA senza RNasi in PBS con quattro microlitri di falloidina FITC, 1,5 microlitri di DAPI, due microlitri dell'anticorpo di interesse direttamente coniugato ad Alexa Fluor 546 e 3,3 microlitri di inibitore della RNasi.

Lavare il vetrino a meno 20 gradi Celsius 100% acetone per un minuto e posizionare il vetrino in una camera di umidità. Lavare la parte superiore del vetrino due volte con PBS fresco senza RNasi per 30 secondi per lavaggio, seguiti da due lavaggi di 30 secondi con il 10% di BSA in PBS privo di RNasi. Dopo l'ultimo lavaggio, trattare il campione con la soluzione anticorpale preparata per cinque minuti a temperatura ambiente prima di lavare altre due volte con il 10% di BSA in PBS privo di RNasi.

Dopo il secondo lavaggio, asciugare il vetrino all'aria per cinque minuti in una cappa di coltura tissutale prima di caricare il vetrino sulla piattaforma di taglio per microdissezione laser. Installare sul dispositivo provette di raccolta per microcentrifuga autoclavate da 500 microlitri, adatte per il lavoro di PCR, contenenti 50 microlitri di tampone di estrazione da un kit di isolamento dell'RNA. Dopo il caricamento, identificare le regioni di interesse all'interno del campione in base alla colorazione, alla morfologia e alla posizione.

Utilizzare l'immunofluorescenza per delineare almeno 500.000 micrometri quadrati di interesse. Quindi avviare la microdissezione laser per asportare la regione utilizzando una potenza laser superiore a 40. Al termine del processo di microdissezione laser, tappare le provette di raccolta della microcentrifuga e agitare energicamente le provette per assicurarsi che il contenuto si muova dai tappi al fondo delle provette.

Dopo la centrifugazione, incubare le provette in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 30 minuti prima di centrifugare nuovamente le provette. Quindi trasferire i surnatanti in nuovi tubi da 500 microlitri da una temperatura di meno 80 gradi Celsius. L'identificazione dei sottosegmenti tubulari nel rene viene effettuata attraverso la colorazione anticorpale di marcatori tubulari unici, oltre alla morfologia cellulare e ai punti di riferimento strutturali.

La marcatura a fluorescenza in combinazione con le caratteristiche morfologiche del tessuto e il posizionamento spaziale delle strutture dell'immagine facilita la visualizzazione dei sottosegmenti renali con un alto grado di sicurezza. In questa analisi rappresentativa di sequenziamento a valle, il tasso di successo nel soddisfare l'input minimo dell'area di dissezione è stato superiore al 90%, con conseguente elevata quantità totale di mRNA disponibile per il rilevamento genico. In questa analisi, il 100% dei campioni ha raggiunto la soglia minima di rilevamento di almeno 10.000 geni.

Dopo la microdissezione laser, l'analisi dell'arricchimento dell'espressione genica di marcatori noti può essere confrontata con quella di altri compartimenti. In questa analisi, è stato identificato un marcatore per ciascun sottosegmento attraverso la trascrittomica regionale di microdissezione laser che ha anche prodotto una specifica colorazione immunoistochimica del corrispondente sottosegmento del nefrone. È importante notare che la microdissezione laser si basa molto sull'esperienza dell'utente per identificare con precisione le strutture di interesse da sezionare.

Questa tecnica consente lo studio di specifiche firme di espressione genica regionale che possono essere utilizzate per valutare potenziali percorsi coinvolti nella progressione della malattia, nonché la biologia dei tessuti sani.