Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

Qui forniamo una descrizione approfondita della microdissezione laser applicata per ottenere un profilo di trascrizione dell'RNA confrontato delle aree silenziate e non silenziate del disco alare della drosofila. Questo approccio richiede come materiale biologico, dischi di immagini di drosofila sezionati manualmente come attrezzatura principale, un micro dissettore laser. Utilizziamo il LI A-L-L-M-D 6, 000 e una macchina per PCR in tempo reale.

Abbiamo usato un BioRad iq. Cinque piccoli strumenti necessari sono una piastra concava, un piccolo pennello, una pinza di microdissezione appesa, vetrini a goccia, ping per insetti, montati su aghi siringa, telaio metallico con membrana in PET, piccoli tubi di plastica. Questo metodo prevede i seguenti passaggi.

Primo passo per incrociare due linee transgeniche oph adatte al fine di innescare un silenziamento genico localizzato e specifico nella progenie utilizzando il sistema GAL four UAS. Fase due, trattare i fotogrammi di dissezione. Fase tre, per impostare il micro dissettore laser.

Fase quattro, raccogliere manualmente i dischi immaginali delle ali dalla progenie larvale dell'incrocio genetico. Fase cinque, eseguire la microdissezione laser di aree specifiche dei dischi immaginali marcati con GFP. Fase sei, il profilo di trascrizione di aree equivalenti di regioni silenziate e non solide del disco consentirà di stabilire gli effetti innescati dal silenziamento del gene di interesse.

Chiamalo gene X La profilazione trascrizionale in vivo richiederà l'estrazione dell'RNA dalle aree micro sezionate, il controllo dell'accuratezza della dissezione manuale, la valutazione dell'espressione di GFP nei due campioni mediante R-T-P-C-R, la quantificazione dell'espressione del putativo. Bersagli del gene del silenzio nei due campioni mediante R-T-P-C-R in tempo reale o eseguendo un'analisi di microarray. Ora maggiori dettagli su ogni passaggio.

Il primo passo, l'incrocio genetico. L'incrocio genetico coinvolge quattro ceppi transgenici di UAS GAL ed è focalizzato per ottenere dischi immaginali silenziati nella progenie larvale. Il sistema Versatile GAL four consente di attivare il silenziamento genico specifico e localizzato mediante interferenza dell'RNA.

Un ceppo introduce nell'incrocio il transgene driver che esprime GAL quattro in uno specifico modello temporale o spaziale. E il reporter A-U-A-S-G-F-P che permette la visualizzazione del dominio di espressione dei quattro GAL. Il secondo ceppo introduce un transgene responder UAS che esprime l'RNA di silenziamento a forcina, in grado di colpire specificamente il gene X una volta espresso nella cellula.

Questo RNA viene scisso per generare un piccolo RNA interferente, che è in grado di silenziare in modo specifico il gene X selezionato nella progenie di questo incrocio. Il transgene di silenziamento UAS viene trascritto solo in quelle cellule che esprimono la proteina GAL quattro, inducendo così un silenziamento spazialmente ristretto del gene X. Tra le varie applicazioni, ci siamo concentrati sul profilo del trascritto dell'RNA nel disco alare silenziato dal Grailed GAL four driver, che dirige il silenziamento specifico nel compartimento posteriore.

La regione del silenzio è contrassegnata dall'espressione del transgene U-A-S-G-F-P. Nel compartimento posteriore. Due eventi saranno innescati dall'espressione di GGFP e dal silenziamento del gene x.

Fase due, trattamento dei frame di dissezione per inibire l'attività degli RNA. Lavare i vetrini del telaio e gli strumenti di dissezione con acqua DEPC per almeno un'ora a temperatura ambiente e lasciarli asciugare in una camera sterile. Per inibire l'attività degli RNA, utilizzare una provetta nuova di zecca da 50 ml già priva di RNA, riempita con acqua DEPC con una pinza inserita nella provetta, un vetrino sospeso e un telaio per animali domestici.

Entrambi necessari per la microdissezione. Chiudere il tubo, capovolgerlo, quindi lasciarlo agire per almeno un'ora. A temperatura ambiente, un'ora dopo, spostare l'acqua DEPC in un altro tubo con la pinza.

Tenere le diapositive all'interno del tubo in modo che non cadano. Quindi lasciare asciugare i vetrini all'interno del tubo. Fase tre, configurazione microdisect.

Innanzitutto, accendi tutti i dispositivi necessari, il bulbo a fluorescenza, il microscopio e il software per la microdissezione. Una finestra di avviso ti ricorderà di accendere anche il laser. Fallo e lascia che il laser si riscaldi mentre finisci la configurazione del microdisetto.

Ora è il momento di preparare i pozzetti in cui raccogliere il tessuto. Tagliare. L'apparecchiatura di taglio laser Leica LMD 6, 000 consente il caricamento di un massimo di quattro tubi per raccogliere campioni diversi. Per il nostro scopo, abbiamo bisogno solo di due tubi.

Uno, per raccogliere il tessuto di silenzio positivo GFP, l'altro per raccogliere il tessuto unile negativo GFP con un micro pettorale. Riempire entrambi i tappi delle provette con 20 microlitri di soluzione di tri reagenti per preservare l'RNA. Ora il microdisetto è pronto per l'uso Fase quattro, dissezione manuale dei dischi di imaging delle ali da larve di joof.

Isolare i dischi alari dalla progenie larvale ottenuta come descritto in precedenza, e assicurarsi che altri tessuti non contaminino i dischi Per raggiungere questo obiettivo, l'approccio alla dissezione è molto diverso da quello comunemente usato per raccogliere la maggior parte di tutti i dischi originali. Per prima cosa, lava la larva nella soluzione di ringer per rimuovere il terreno aderente. Quindi trasferiscilo in uno scivolo a goccia sospeso e taglia la testa tirando immediatamente la bocca verso il basso.

Usando gli spilli per insetti, ora seziona con cura gli altri tessuti. Il contorno rosso mostra i dischi alari immaginali da raccogliere. Mantenere i dischi liberi dal tessuto aderente in modo rapido e delicato Trasferire ogni disco alare isolato in un telaio di dissezione per un taglio immediato.

Questa procedura deve essere ripetuta fino a raggiungere il numero totale di cento dischi alari. Quinta fase, microdissezione laser di aree specifiche dei dischi alari marcati con GFP. Una volta che il disco alare originale è sulla membrana, si può procedere con il taglio.

Posizionare il telaio sul suo supporto e fissare il supporto sul tavolino motorizzato. Cercate il disco alare originale utilizzando l'LMD 6, 000 come un comune microscopio. Concentrati su di esso e imposta il taglio.

Disegna un'area ovale che si adatti a entrambi i lati del disco, il positivo GFP e l'altro. Selezionare il tappo del tubo in cui si desidera raccogliere la parte positiva GFP. Premere il pulsante Inizia taglio.

Il micro dissettore Procede con il taglio del tessuto con la velocità e la potenza impostate in precedenza selezionando la funzione sposta e taglia. È possibile rifinire il taglio manualmente fino a quando il pezzo di tessuto non selezionato cade. L'animazione 3D mostra cosa succede sotto il microtaglio del dissettore un laser che si concentra sul tessuto effettuando un taglio lungo il perimetro selezionato.

Una volta effettuato il taglio, il pezzo di tessuto cade nel tappo della provetta selezionato e di conseguenza nel tri reagente. Dopo il primo taglio, spostare l'area di taglio sull'altro lato del disco alare per tagliare un'area negativa GFP equivalente. Prima di procedere con il nuovo taglio, assicurarsi di selezionare un tappo della provetta diverso per tenere separati i tessuti positivi alla GFP dal negativo alla GFP.

Premere il pulsante di avvio del taglio dopo il taglio automatico. Procedere alla rifinitura manuale del taglio come mostrato dall'animazione 3D prima del secondo taglio. Il tavolino motorizzato sposta il tappo del tubo selezionato sotto l'area di taglio.

Il raggio laser si concentra sul tessuto tagliato lungo il perimetro selezionato e, una volta eseguito il taglio, il pezzo di tessuto cade nel tappo della provetta selezionato contenente il reagente Tri. Per raccogliere abbastanza materiale, abbiamo ripetuto la procedura su un centinaio di dischi alari immaginali. Una volta raccolti i campioni, scaricare le provette.

Questo è un passaggio delicato che può farti perdere tutto il lavoro che hai fatto fino a quel momento. Quindi fai attenzione. Chiudi il tappo capovolto e procedi con l'esperimento.

Questo è quello con tessuto GFP positivo. Questo è l'altro con tessuto GFP negativo. Fase sei, la profilazione della trascrizione.

Girare le provette per staccare il liquido dal tappo e aggiungere il reagente Try fino a un millilitro. Eseguire l'estrazione dell'RNA seguendo il protocollo standard di prova dei reagenti da un centinaio di aree di circa 5.000 micrometri quadrati ciascuna. La nostra resa è stata di 1,5 microgrammi di RNA.

Usiamo l'apice tre in vitrogeno per sintetizzare CD NA con esagono casuale. L'accuratezza della dissezione manuale è stata controllata controllando l'espressione della GFP nei due campioni mediante R-T-P-C-R. Come mostrato nel gel con R-T-P-C-R quantitativo.

Abbiamo valutato i livelli di espressione del gene del silenzio X insieme a quelli di possibili bersagli putativi della via regolatoria mediata dal gene X. Questo diagramma mostra un esempio dei livelli di espressione del gene X e di uno dei suoi bersagli putativi. Chiamali geni Y rispetto ai loro livelli di espressione basale nei compartimenti anteriori posteriori dei dischi alari non solidi.

L'attività del gene X selezionato è risultata ridotta al 40% dopo il silenziamento. Al contrario, uno dei suoi bersagli putativi, il gene Y, è stato trovato significativamente sovraregolato con un aumento di sette volte, portandoci a convalidare l'ipotesi che fosse regolato negativamente dal gene X. Concludiamo che l'approccio sperimentale sopra descritto può essere applicato con successo alla validazione di bersagli putativi su diversi percorsi regolatori.