Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

In questo studio forniamo una descrizione dettagliata della microdissezione laser applicata al profilo del trascrittoma RNA di aree silenziate e non silenziate del disco alare di Drosophila. Questo approccio richiede come materiale biologico dischi immaginali di Drosophila dissecati manualmente e come principale strumentazione un microdissettore laser. Utilizziamo il sistema LI A-L-L-M-D 6,000 e una macchina per PCR in tempo reale.

Abbiamo utilizzato un BioRad iq. I cinque piccoli strumenti necessari sono una piastra concava, un pennello, pinzette per microdissezione, un vetrino per goccia sospesa, insetti pings montati su aghi di siringa, un telaio metallico con membrana pet e piccole provette di plastica. Questo metodo comprende i seguenti passaggi.

Passaggio uno: incrociare due linee transgeniche oph adeguate per attivare un silenziamento genico localizzato e specifico nella progenie, sfruttando il sistema GAL4-UAS. Passaggio due: trattare i telai di dissezione. Passaggio tre: allestire il microdissettore laser.

Passaggio quattro, raccogliere manualmente i dischi immaginali delle ali dalla progenie larvale dell'incrocio genetico. Passaggio cinque, eseguire la microdissezione laser di aree specifiche dei dischi immaginali marcati con GFP. Passaggio sei, il profilo di trascrizione di aree equivalenti di regioni silenziate e non silenziate del disco permetterà di determinare gli effetti indotti dal silenziamento del gene di interesse.

Il profilo della trascrizione in vivo del gene X richiederà l'estrazione di RNA dalle aree microdissezionate, il controllo dell'accuratezza della dissezione manuale, la valutazione dell'espressione di GFP nei due campioni mediante R-T-P-C-R, la quantificazione dell'espressione dei potenziali bersagli del gene silenziato nei due campioni mediante R-T-P-C-R in tempo reale o eseguendo un'analisi con microarray. Ora maggiori dettagli su ciascun passaggio.

Il primo passaggio, l'incrocio genetico. L'incrocio genetico coinvolge ceppi transgenici GAL4-UAS ed è finalizzato all'ottenimento di dischi immaginali silenziati nella progenie larvale. Il sistema versatile GAL4 consente di attivare un silenziamento genico specifico e localizzato mediante interferenza dell'RNA.

Un ceppo introduce nell'incrocio il transgene driver che esprime GAL4 secondo un particolare modello temporale o spaziale e un reporter A-U-A-S-G-F-P che consente la visualizzazione del dominio di espressione di GAL4. Il secondo ceppo introduce un transgene risponditore UAS che esprime un RNA di silenziamento a forcina, in grado di bersagliare specificamente il gene X una volta espresso nella cellula.

Questo RNA viene scisso per generare RNA interferenti piccoli, in grado di silenziare specificamente il gene X selezionato nella progenie di questo incrocio. Il transgene di silenziamento sotto controllo UAS viene trascritto solo nelle cellule che esprimono la proteina GAL4, inducendo così un silenziamento del gene X limitato a livello spaziale. Tra la varietà di applicazioni possibili, ci siamo concentrati sul profilo dei trascritti di RNA nel disco alare sottoposto a silenziamento mediante il driver GAL4 Grailed, che indirizza il silenziamento specifico nel compartimento posteriore.

La regione silente è contrassegnata dall'espressione del transgene U-A-S-G-F-P. Nel compartimento posteriore. Verranno innescati due eventi: l'espressione di GGFP e il silenziamento del gene x.

Passaggio due, trattamento dei telai di dissezione per inibire l'attività delle RNAsi. Lavare le lamelle e gli strumenti di dissezione con acqua DEPC per almeno un'ora a temperatura ambiente e lasciarli asciugare in una camera sterile. Per inibire l'attività delle RNAsi, utilizzare una provetta da 50 ml nuova di zecca già priva di RNAsi, riempita con acqua DEPC, nella quale inserire pinzette, una lamella con goccia sospesa e un telaio per animali.

Entrambi necessari per la microdissezione. Chiudere il tubo, capovolgerlo e lasciarlo reagire per almeno un'ora. A temperatura ambiente, un'ora dopo, trasferire l'acqua DEPC in un altro tubo utilizzando la pinzetta.

Tenere le lamelle all'interno del tubo in modo che non cadano. Quindi lasciare asciugare le lamelle all'interno del tubo. Passaggio tre, preparazione per la microdissezione.

Per prima cosa, accendere tutti i dispositivi necessari: la lampadina a fluorescenza, il microscopio e il software per la microdissezione. Una finestra di avviso ricorderà di accendere anche il laser. Procedere in tal senso e lasciare riscaldare il laser mentre si completa la configurazione della microdissezione.

Ora è il momento di preparare i pozzetti in cui raccogliere il tessuto tagliato. L'apparecchiatura per il taglio laser Leica LMD 6,000 consente il caricamento di fino a quattro tubi per raccogliere campioni diversi. Per il nostro scopo, abbiamo bisogno soltanto di due tubi.

Uno, per raccogliere il tessuto silenziato GFP positivo, l'altro per raccogliere il tessuto unile GFP negativo con un micro piastrino. Riempire entrambi i tappi dei tubi con 20 microlitri di soluzione di tri reagente per preservare l'RNA. Ora il microdissettore è pronto per l'uso. Passaggio quattro: dissezione manuale dei dischi per l'immagine delle ali da larve joof.

Isolare i dischi alari dalla progenie larvale ottenuta come descritto in precedenza, assicurandosi che altri tessuti non contaminino i dischi. Per raggiungere questo obiettivo, l'approccio di dissezione è piuttosto diverso da quello comunemente usato per raccogliere l'intero gruppo di dischi originali. Innanzitutto, lavare la larva in soluzione di Ringer per rimuovere il mezzo aderente. Successivamente, trasferirla su un vetrino con goccia sospesa e tagliare la testa, tirando immediatamente verso il basso la bocca.

Utilizzando ora i pinzetti per insetti, dissezionare con attenzione i tessuti circostanti. Il contorno rosso indica i dischi immaginali dell'ala da raccogliere. Mantenere i dischi privi di tessuto aderente in modo rapido e delicato. Trasferire ogni disco alare isolato su un supporto per dissezione per il taglio immediato.

Questa procedura deve essere ripetuta fino a raggiungere un numero totale di cento dischi alari. Passaggio cinque: microdissezione laser di aree specifiche dei dischi alari marcati con GFP. Una volta che il disco alare originale si trova sulla membrana, è possibile procedere con il taglio.

Posizionare il vetrino sul suo supporto e fissare il supporto sulla piastra motorizzata. Cercare il disco alare originale utilizzando il LMD 6,000 come microscopio comune. Mettere a fuoco e impostare il taglio.

Disegnare un'area ovale che si adatti su entrambi i lati del disco, quella positiva per GFP e l'altra. Selezionare il tappo del tubo in cui si desidera raccogliere la parte positiva per GFP. Premere il pulsante Avvia taglio.

Il microdissettore procede al taglio del tessuto con la velocità e la potenza impostate in precedenza selezionando la funzione di movimento e taglio. È possibile affinare manualmente il taglio finché la porzione di tessuto non selezionata non cade. L'animazione 3D mostra cosa accade sotto il microdissettore: un laser viene focalizzato sul tessuto effettuando un taglio lungo il perimetro selezionato.

Una volta effettuato il taglio, il frammento di tessuto cade nel tappo del tubo selezionato e di conseguenza nel tri Reagent. Dopo il primo taglio, spostare l'area di taglio sull'altro lato del disco alare per tagliare una regione equivalente negativa per GFP. Prima di procedere con il nuovo taglio, assicurarsi di selezionare un tappo di tubo diverso per mantenere separati i tessuti positivi per GFP da quelli negativi.

Premere il pulsante di avvio del taglio dopo il taglio automatico. Procedere quindi a perfezionare manualmente il taglio come mostrato dall'animazione 3D prima del secondo taglio. La fase motorizzata sposta il tappo del tubo selezionato sotto l'area di taglio.

Il fascio laser viene focalizzato sul tessuto tagliato lungo il perimetro selezionato e, una volta completato il taglio, il frammento di tessuto cade nel tappo del tubo selezionato contenente il reagente Tri. Per raccogliere una quantità sufficiente di materiale, abbiamo ripetuto la procedura su cento dischi alari immaginali. Dopo aver raccolto i campioni, rimuovere i tubi.

Questo è un passaggio delicato che potrebbe farvi perdere tutto il lavoro svolto fino a ora. Procedete quindi con attenzione. Chiudete il tappo al contrario e proseguite con l'esperimento.

Questo è quello con tessuto positivo per GFP. Questo è l'altro con tessuto negativo per GFP. Passo sei, profilazione della trascrizione.

Centrifugare i tubi per staccare il liquido dal coperchio e aggiungere il reagente Try fino a un millilitro. Eseguire l'estrazione dell'RNA seguendo il protocollo standard del reagente Try da cento aree di circa 5.000 micrometri quadrati ciascuna. Il nostro rendimento è stato di 1,5 microgrammi di RNA.

Utilizziamo il tre superscritto in vitrogeno per sintetizzare CD NA con esameri casuali. L'accuratezza della dissezione manuale è stata controllata verificando l'espressione di GFP nei due campioni mediante R-T-P-C-R. Come mostrato nel gel con R-T-P-C-R quantitativa.

Abbiamo valutato i livelli di espressione del gene silenziato X insieme a quelli di possibili bersagli putativi della via regolatoria mediata dal gene X. Questo diagramma mostra un esempio dei livelli di espressione del gene X e di uno dei suoi bersagli putativi. Indichiamo tali geni come geni Y rispetto ai loro livelli di espressione basali nei compartimenti anteriore e posteriore dei dischi alari non solidificati.

L'attività del gene X selezionato è risultata ridotta al 40% dopo il silenziamento. Al contrario, uno dei suoi bersagli putativi, il gene Y, è risultato significativamente sovraespresso, con un aumento di sette volte, portandoci a validare l'ipotesi secondo cui è regolato negativamente dal gene X. Concludiamo che l'approccio sperimentale sopra descritto può essere applicato con successo alla validazione di bersagli putativi in diverse vie di regolazione.