Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Le tecniche di microiniezione di embrioni hanno aperto la strada allo sviluppo di numerosi strumenti di controllo dei vettori basati sulla genetica. Sebbene numerose specie di insetti abbiano protocolli già ben sviluppati, Culex quinquefasciatus rimane relativamente poco studiato. Questo protocollo di microiniezione è stato specificamente progettato per adattarsi ai tratti biologici unici di Culex quinquefasciatus, tra cui la raccolta degli ovuli, la separazione delle zattere di uova e le procedure post-iniezione.

Questo metodo può essere adattato a qualsiasi specie di Culex di interesse e può essere utilizzato per studiare la funzione genica o per generare tecnologie di controllo genetiche per le specie Culex. Inizia separando le uova dalle zattere. Usa una pinza o un pennello per premere sulla zattera e separare le singole uova.

Allinea le uova su una sottile striscia di nastro biadesivo posta sulla parte superiore di un vetrino, facendo uno sforzo per puntare il lato anteriore di ogni uovo nella stessa direzione. Preparare la miscela di alocarburi mescolando delicatamente i reagenti alocarburi con acqua e incubando la miscela a 25 gradi Celsius per una notte. Coprire le uova allineate con la miscela di olio alocarbonico.

Per generare gli aghi per le microiniezioni, posizionare un vetro capillare alluminosilicato in un estrattore per aghi, seguendo le istruzioni del produttore. Imposta il calore a 560, la velocità a 100, il ritardo a 70, la trazione a 97 e la pressione a 500. Quindi attivare l'estrattore dell'ago.

Toccare delicatamente la punta dell'ago estratto sulla piastra abrasiva diamantata rotante per circa 10 secondi con un angolo di 50 gradi per smussare la punta dell'ago. Incorporare aghi tirati e smussati in linee di argilla da modellista in una capsula di Petri. Preparare la miscela per iniezione costituita da reagenti per la modificazione del genoma e conservarla in ghiaccio.

Utilizzare la punta di un microloader per caricare due microlitri di miscela per iniezione nell'ago per iniezione. Posizionare l'ago per iniezione riempito in un micromanipolatore collegato a un microiniettore elettronico e posizionare il vetrino con gli ovuli allineati sul tavolino di un microscopio composto. Usando il micromanipolatore, allinea l'ago per mirare all'estremità posteriore dell'embrione con un angolo di 25-35 gradi.

Inserire con cautela l'ago nell'embrione e iniettare la miscela in una quantità di circa il 10% del volume dell'embrione. Iniettare 20 ovuli alla volta, quindi interrompere ed eseguire le procedure di recupero degli embrioni. Entro 20 minuti dall'iniezione, rimuovere con cura l'olio di alocarburi dalle uova spazzolandole leggermente con un pennello pulito.

Sollevate le uova con il pennello e mettetele in una tazza di acqua distillata doppia, avendo cura di mantenere le uova in superficie. Nei prossimi sette giorni, controllate quotidianamente le uova per verificarne la schiusa e seguite le normali procedure di allevamento larvale. Esamina le zanzare iniettate per i fenotipi mutanti utilizzando uno stereoscopio.

Questo metodo è stato utilizzato per generare con successo mutazioni somatiche e germinali di un gene critico per lo sviluppo della pigmentazione oculare scura. Le mutazioni somatiche generate da CRISPR-Cas9 sono state valutate mediante screening per la perdita di pigmentazione negli occhi allo stadio pupillare degli individui iniettati. Le mutazioni somatiche erano generalmente presenti come fenotipi a mosaico, in cui alcune ma non tutte le cellule hanno il fenotipo mutante.

I tassi di mutazione germinale sono stati determinati incrociando individui G zero a mosaico e punteggi per prole completamente con occhi bianchi. Questi esperimenti hanno portato a un tasso di sopravvivenza embrionale dal 64 all'82%, un tasso di mutagenesi somatica dal 37 al 57% e un tasso di mutagenesi germinale superiore al 61%. Multiplexando gli sgRNA per colpire più loci nello stesso gene, i tassi di mutagenesi somatica e germinale sono aumentati fino all'86%. Inoltre, per molte generazioni, sono stati mantenuti con successo in laboratorio stock omozigoti vitali di mutanti bianchi.

Per ottimizzare i tassi di sopravvivenza e mutagenesi, tutti i materiali, compreso l'olio di alocarburi, il fluido per iniezione e gli aghi, devono essere adeguatamente preparati prima di tentare le microiniezioni. Ciò consentirà un processo di microiniezione più snello e mirato.