Valutazione dell'espressione del complesso di istocompatibilità maggiore classe I sui neuroni ippocampali murini primari per citometria a flusso

Questo protocollo utilizza la citometria a flusso per valutare quantitativamente l'espressione extracellulare di MHC di classe 1 su neuroni primari coltivati da topi. L'immunocolorazione NC2 per l'espressione di MHC1 può anche essere eseguita per evitare una perdita di segnale dovuta a modifiche proteiche, terziarie, strutturali, permeabilizzazione o condizioni di denaturazione. Oltre a dirigere le risposte immunitarie alle infezioni, l'MHC di classe 1 modula le connessioni sinaptiche neuronali.

Tuttavia, i fattori che regolano l'espressione di MHC di classe 1 sono ancora sconosciuti. Le fasi di dissezione cerebrale embrionale richiedono pratica per essere padroneggiate. Quando si impara la tecnica, fare attenzione a praticare la dissezione senza preoccuparsi del tempo o del successivo processo di coltura.

Per isolare l'ippocampo embrionale, posizionare il primo cervello embrionale di topo prelevato sotto un microscopio a stereodissezione. E usa due paia di pinze sterili di Dumont numero 5 per pizzicare i bulbi olfattivi e per estrarre completamente le meningi. Una volta che le meningi sono state completamente rimosse, il lato superiore della corteccia si aprirà lateralmente per esporre l'ippocampo.

Usa la pinza per pizzicare l'ippocampo lontano dalla corteccia attaccata e trasferisci con cura l'ippocampo isolato in una provetta conica sterile da 15 millilitri contenente cinque millilitri di Hibernate-E Medium su ghiaccio. Quando tutti gli ippocampi sono stati raccolti in un unico tubo da 15 millilitri, sedimentare il tessuto cerebrale mediante centrifugazione. Sostituire il surnatante con 0,5 millilitri di dissociazione della papaina appena preparata per embrione e mescolare il tubo più volte per inversione.

Posizionare il tessuto a 37 gradi Celsius per 30 minuti, mescolando i campioni per inversione ogni 10 minuti prima di raccogliere nuovamente il tessuto mediante centrifugazione. Sostituire il surnatante con un volume uguale di Hibernate-E Medium fresco e utilizzare una pipetta Pasteur in vetro completamente aperta e lucidata a fuoco per triturare il tessuto 10 volte. Dopo aver lasciato riposare il tessuto per due minuti, trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.

Aggiungere un volume uguale di Hibernate-E Medium al fazzoletto e utilizzare una pipetta Pasteur in vetro semiaperto lucidato a fuoco per triturare il tessuto 10 volte. Dopo aver lasciato riposare il tessuto per altri due minuti, raccogliere il surnatante nella provetta da 50 millilitri. Aggiungere un volume uguale di Hibernate-E Medium ai tessuti e triturare il tessuto 10 volte con un quarto di pipetta Pasteur in vetro aperto lucidato a fuoco.

Dopo aver lasciato riposare il tessuto per due minuti, raccogliere il surnatante nella provetta da 50 millilitri. Raccogliere le cellule dissociate nel surnatante mediante centrifugazione. E risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno di crescita neuronale per il conteggio Diluire le cellule a una densità di placcatura finale di cinque volte 10 alla quinta cellula vitale per millilitro di mezzo di crescita neuronale e aggiungere un millilitro di cellule a ciascun pozzetto di una piastra rivestita di poli-D-lisina a 12 pozzetti.

Quindi posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari, sostituendo metà del terreno con un volume uguale di terreno fresco due volte a settimana per tutta la durata della coltura. Per valutare la capacità dei neuroni in coltura di esprimere MHC1, nel giorno appropriato della coltura, sostituire 0,5 millilitri di surnatante in ciascun pozzetto con 0,5 millilitri di terreno di crescita dei neuroni freschi integrati con 200 unità per millilitro di interferone beta per un'incubazione da sei a 72 ore nell'incubatore di coltura cellulare. Al termine dell'incubazione, lavare ogni pozzetto una volta con Neurobasal Medium freddo senza integratori prima di aggiungere 0,5 millilitri di Neurobasal Media freddo non integrato integrato con un microgrammo per millilitro di blocco FC e un microgrammo per millilitro di anticorpo anti-MHC1 coniugato a fluorescenza a ciascun pozzetto.

Dopo un'incubazione di 45 minuti a quattro gradi Celsius, proteggerlo dalla luce. Lavare ogni pozzetto una volta con Dulbeccos PBS freddo. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi a temperatura ambiente in ciascun pozzetto e agitare per rimuovere le cellule.

Confermare la dissociazione al microscopio per colture tissutali invertite e aggiungere 0,5 millilitri di tampone FACS a ciascun pozzetto. Triturare le cellule per disperdere i grumi e trasferire l'intero volume da ciascun pozzetto in singole provette per microcentrifuga da 1,7 millilitri. Raccogliere le celle per centrifugazione e risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone FACS fresco per provetta.

Trasferire ogni sospensione in pozzetti individuali di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti e aggiungere 100 microlitri di reagente fissativo a ciascun pozzetto. Triturare più volte per evitare la formazione di grumi cellulari e incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, centrifugare per raccogliere le cellule sul fondo dei pozzetti e risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone FACS fresco per pozzetto.

Dopo la centrifugazione, risospendere i pellet in 100 microlitri di reagente di permeabilizzazione integrato con anticorpo anti-nuclei neuronali coniugati a fluorescenza per pozzetto. Dopo la miscelazione, incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente con dondolo al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione per tre volte, rimettendo in sospensione i pellet in 100 microlitri di tampone FACS fresco tra una centrifugazione e l'altra.

Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 100 microlitri di coppia al 2% di formaldeide in tampone FACS con un'accurata miscelazione. I neuroni possono essere identificati attraverso il gating sequenziale degli eventi totali per escludere detriti cellulari e doppietti e dalla loro positività dei nuclei neuronali. Le cellule positive ai nuclei neuronali possono quindi essere ulteriormente analizzate per la loro positività all'MHC1.

Da questi dati, è possibile calcolare la percentuale di neuroni positivi per la colorazione MHC1 e l'intensità mediana della fluorescenza, rivelando che, ad esempio, il trattamento con interferone beta sovraregola significativamente la percentuale e l'intensità dell'espressione dei neuroni MHC1. Con lievi modifiche, questi metodi possono essere utilizzati per coltivare altre popolazioni neuronali come i neuroni corticali o per testare diversi marcatori cellulari, molecole stimolanti o modificazioni genetiche.