Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare singoli tipi di cellule neurali dal tessuto cerebrale per analisi successive. Questo viene ottenuto dissociando innanzitutto il tessuto nervoso in una sospensione di singole cellule. Nel secondo passaggio, la mielina viene rimossa dalla sospensione e quindi le cellule vengono marcate con anticorpi specifici per il tipo cellulare.

Nell'ultimo passaggio, le singole popolazioni cellulari vengono separate mediante citometria a flusso. In definitiva, questo metodo di isolamento specifico per tipo cellulare permetterà agli utenti di analizzare le variazioni nell'espressione genica o proteica o le modifiche epigenetiche in maniera specifica per tipo cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come quali tipi cellulari esprimono determinati recettori, quali esprimono determinate proteine e quali presentano specifiche modifiche epigenetiche, al fine di comprendere meglio i meccanismi specifici per tipo cellulare nel cervello.

Iniziare la dissociazione neurale utilizzando lame di rasoio sterili per tritare ogni campione prelevato dai tessuti cerebrali adulti in piccoli pezzi da 30 a 400 milligrammi sul coperchio di una piastra per colture a sei pozzetti. Successivamente, immergere il tessuto in un millilitro di HBSS privo di calcio e magnesio ed utilizzare una pipetta per trasferire i campioni in provette da centrifuga sterili da due millilitri una volta raccolti tutti i tessuti. Centrifugare i campioni ed aspirare i soprannatanti.

Aggiungere 1.900 microlitri di enzima caldo. Mescolare una volta e incubare i campioni per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, invertendo il tubo diverse volte ogni cinque minuti per risospendere i frammenti di tessuto sedimentati.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 30 microlitri di enzima appena preparato. Mescolare due volte ogni campione e capovolgere delicatamente i tubi. Quindi, utilizzando una pipetta pistone etichettata con il numero uno, dissociare ogni campione con 30 movimenti su e giù.

Avendo cura di evitare la formazione di bolle. Incubare i campioni per altri 15 minuti a 37 gradi Celsius, con inversione ogni cinque minuti, seguita dalla dissociazione dei campioni mediante pipetta di pestello numero due, come appena dimostrato.

Quindi passare alla pipetta numero tre, ripetere la dissociazione e incubare i campioni per altri 10 minuti. Nel bagnomaria, capovolgere ogni cinque minuti; al termine dell'incubazione, filtrare le sospensioni cellulari singole attraverso filtri cellulari da 80 micron in provette Falcon da 15 millilitri. Dopo aver filtrato l'ultimo campione, lavare ogni filtro con 10 millilitri di HBSS privo di calcio e magnesio per arrestare le reazioni enzimatiche, centrifugare le provette ed aspirare i soprannatanti per eliminare la mielina dalle cellule.

Sospendere completamente i pellet in 400 microlitri di buffer per la rimozione della mielina e aggiungere la quantità appropriata di microsferette per la rimozione della mielina in ogni provetta. Pipettare le soluzioni su e giù fino a quando le cellule e le microsferette non siano completamente miscelate. Incubare quindi il campione a quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, lavare ogni campione in cinque millilitri di tampone per la rimozione della mielina mentre le cellule sono in centrifugazione; posizionare una colonna per ogni campione nel campo magnetico di un separatore magnetico e posizionare un filtro pulito da 80 micron sopra ciascuna colonna. Risciacquare ogni filtro e colonna con un millilitro di tampone per la rimozione della mielina per tre volte, raccogliendo tutto il flusso in uscita in un contenitore per rifiuti. Dopo l'ultimo risciacquo, posizionare tubi rotondi in polistirene da cinque millilitri direttamente al di sotto di ogni colonna per raccogliere l'eluito.

Quindi aspirare il sopranatante dai campioni e risospendere i pellet in 500 microlitri di buffer per la rimozione della mielina. Applicare immediatamente le sospensioni cellulari sulle colonne, raccogliendo le cellule nei tubi sottostanti. Risciacquare quindi ogni filtro e colonna quattro volte con un millilitro di buffer per la rimozione della mielina per ogni lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare le cellule ed aspirare i soprannatanti per colorare le cellule da ordinare mediante citometria a flusso. Vortexare ogni campione per circa due secondi per dissociare i pellet e trasferire un microlitro di cellule da ogni tubo in tubi individuali. Per i controlli di colorazione, aggiungere immediatamente cinque microlitri di bloccante FC a ciascun tubo, inclusi i controlli di colorazione.

Quindi vortexare nuovamente i campioni e incubarli a quattro gradi Celsius. Dopo cinque minuti, aggiungere 100 microlitri del cocktail di anticorpi primari appropriato. Coprire i tubi per proteggere gli anticorpi dalla luce e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Al termine dell'incubazione, lavare i campioni in due millilitri di buffer di lavaggio, quindi aspirare i soprannatanti ed etichettare ogni campione con 100 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato. Coprire le provette e posizionarle a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, lavare i campioni in due millilitri di buffer di lavaggio, centrifugare i campioni e quindi aspirare il liquido.

Supernatanti Resus, sospendere i pellet in 250 microlitri di PBS sterile ed eseguire il sorting delle cellule; qui vengono mostrate popolazioni rappresentative di cellule neurali ottenute mediante sorting a flusso da un singolo ippocampo maschile. Le cellule sono state inizialmente selezionate tra tutti gli eventi possibili in base alle loro proprietà di scattering anteriore e laterale. Successivamente, le cellule singole (singoletti) sono state selezionate rispetto a doppietti o aggregati cellulari più grandi in base alle dimensioni, al fine di consentire un sorting accurato dei singoli tipi cellulari. Le cellule singole sono state quindi separate in popolazioni di cellule CD11B positive e CD11B negative, con un ulteriore sorting delle cellule CD11B negative in cellule positive per GT1 e TH1. È stato quindi utilizzato un programma di analisi per determinare il numero totale di eventi in ciascuna popolazione, nonché la percentuale rispetto alle popolazioni parentali, al fine di confermare la purezza delle cellule ordinate.

In questo esempio specifico, l'espressione genica relativa di geni specifici per diversi tipi cellulari è stata analizzata mediante PCR in tempo reale. Come previsto, questi dati hanno confermato la purezza delle cellule ordinate, nonché identificato alcune differenze interessanti tra le diverse regioni cerebrali analizzate. Dopo aver confermato la purezza dell'ordinamento, si può misurare l'espressione di altri geni di interesse per determinare il tipo cellulare specifico in cui vengono espressi, oppure se la loro espressione risulta modificata in seguito a un trattamento in maniera specifica per il tipo cellulare.

Ad esempio, qui è stata analizzata l'espressione della calbindina, una proteina legante il calcio spesso utilizzata per identificare i neuroni nell'ippocampo e nel cervelletto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare specifici tipi cellulari neurali di interesse, come il neurone mostrato qui, utilizzando opportuni anticorpi specifici per le superfici cellulari.