Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i singoli tipi di cellule neurali dal tessuto cerebrale per la successiva analisi. Ciò si ottiene dissociando prima il tessuto neurale in una singola sospensione cellulare. Nella seconda fase, la mielina viene rimossa dalla sospensione e quindi le cellule vengono colorate per gli anticorpi specifici del tipo di cellula.

Nella fase finale, le singole popolazioni cellulari vengono ordinate mediante citometria a flusso. In definitiva, questo metodo di isolamento specifico del tipo di cellula consentirà agli utenti di analizzare i cambiamenti nell'espressione genica o proteica o le modifiche epigenetiche in un modo specifico del tipo di cellula. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio quali tipi di cellule esprimono determinati recettori, quali esprimono determinate proteine e quali esprimono determinate modificazioni epigenetiche in modo da poter comprendere meglio i meccanismi specifici del tipo di cellula nel cervello.

Iniziare la dissociazione neurale utilizzando lame di rasoio sterili per tagliare a cubetti ogni campione raccolto dai tessuti cerebrali adulti in piccoli pezzi da 30 a 400 milligrammi sul coperchio di una piastra di coltura a sei pozzetti. Quindi immergere il tessuto in un millilitro di HBSS privo di calcio e magnesio e utilizzare una pipetta per trasferire i campioni in provette da centrifuga sterili da due millilitri quando tutti i tessuti sono stati raccolti. Centrifugare i campioni e aspirare i surnatanti.

Aggiungi 1.900 microlitri di enzima caldo. Mescolarne uno e incubare i campioni per 15 minuti. In un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, capovolgendo il tubo più volte ogni cinque minuti per risospendere i pezzi di tessuto depositati.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 30 microlitri di enzima appena preparato. Mescolarne due su ciascun campione e capovolgere delicatamente le provette. Quindi, utilizzando una pipetta per parassiti etichettata uno, dissociare ciascun campione con 30 iterazioni su e giù.

Facendo attenzione a non generare bolle. Incubare i campioni per altri 15 minuti a 37 gradi Celsius con inversione ogni cinque minuti, seguiti dalla dissociazione dei campioni con una pipetta per parassiti. Numero due, come appena dimostrato.

Quindi passare alla pipetta numero tre, ripetere la dissociazione e incubare i campioni per altri 10 minuti. Nel bagno d'acqua con inversione ogni cinque minuti al termine dell'incubazione, filtrare le sospensioni di singole cellule attraverso filtri cellulari da 80 micron in provette Falcon da 15 millilitri. Lavando ogni filtro con 10 millilitri di HBSS privo di calcio e magnesio per fermare le reazioni enzimatiche quando l'ultimo campione è stato filtrato, girare le provette e aspirare i surnatanti per esaurire la mielina dalla cellula.

Le sospensioni riprospendono accuratamente i pellet in 400 microlitri di tampone per la rimozione della mielina e aggiungono la quantità appropriata di perle per la rimozione della mielina in ciascun tubo. Pipettare le soluzioni su e giù fino a quando le cellule e le perle non sono completamente miscelate. Quindi incubare il campione a quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, lavare ogni campione in cinque millilitri di tampone per la rimozione della mielina mentre le cellule stanno girando, posizionare una colonna per ogni campione nel campo magnetico di un selezionatore magnetico e posizionare un filtro pulito da 80 micron sopra ogni colonna. Sciacquare tre volte ogni filtro e colonna con un millilitro di tampone per la rimozione della mielina, raccogliendo tutto il flusso in un contenitore per rifiuti. Dopo il risciacquo finale, posizionare tubi a fondo tondo in polistirene da cinque millilitri direttamente sotto ogni colonna per raccogliere l'eluato.

Quindi aspirare il super nominato dai campioni e risospendere i pellet in 500 microlitri di tampone di rimozione della mielina. Applicare immediatamente le sospensioni cellulari alle colonne, raccogliendo le cellule nelle provette sottostanti. Quindi risciacquare ogni filtro e colonna quattro volte con un millilitro di rimozione della mielina, tampone per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare le cellule e aspirare i surnatanti per colorare le cellule per la selezione mediante citometria a flusso. Agitare ogni campione per circa due secondi per dissociare i pellet e trasferire un microlitro di cellule da ciascuna provetta in provette singole. Per i controlli di colorazione, aggiungere immediatamente cinque microlitri di blocco FC a ciascuna provetta, compresi i controlli di colorazione.

Quindi agitare nuovamente i campioni e incubarli a quattro gradi Celsius. Dopo cinque minuti, aggiungere 100 microlitri del cocktail di anticorpi primari appropriato. Coprire le provette per proteggere gli anticorpi dalla luce e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Al termine dell'incubazione, lavare i campioni in due millilitri di tampone di lavaggio, quindi aspirare i surnatanti ed etichettare ogni campione con 100 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato. Coprite i tubi e metteteli a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Quindi lavare i campioni in due millilitri di tampone di lavaggio, centrifugare i campioni e quindi aspirare.

I surnatanti Resus, sospendono i pellet in 250 microlitri di PBS sterile e selezionano le cellule qui vengono mostrate popolazioni rappresentative di cellule neurali ordinate da un singolo ippocampo maschile che le cellule sono state controllate per prime da tutti i possibili eventi in base alle loro proprietà di dispersione diretta e laterale. Successivamente, le singole cellule o singoletti sono stati separati da eventuali doppietti o gruppi di cellule più grandi in base alle loro dimensioni per consentire un ordinamento accurato dei singoli tipi di cellule, le singole cellule sono state quindi ordinate in popolazioni di cellule CD 11, B positive e CD 11 B negative con un ulteriore smistamento delle cellule CD 11 B negative in cellule GT 1 e TH 1 positive. Il programma di analisi è stato quindi utilizzato per determinare il numero totale di eventi in ciascuna popolazione e la percentuale delle popolazioni madri per confermare la purezza delle cellule selezionate.

In questo particolare esempio, l'espressione genica relativa di geni specifici per tipi cellulari alternativi è stata analizzata mediante PCR in tempo reale. Come previsto, questi dati hanno confermato la purezza delle cellule selezionate, oltre a identificare alcune differenze interessanti tra le regioni cerebrali studiate. Dopo la conferma della purezza del tipo, l'espressione di altri geni di interesse può essere misurata per determinare il tipo di cellula specifico in cui sono espressi o se la loro espressione è alterata in seguito a un trattamento in un modo specifico per il tipo di cellula.

Ad esempio, qui è stata studiata l'espressione del legame della mucca, una proteina legante il calcio spesso utilizzata per identificare i neuroni nell'ippocampo e nel cervelletto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare specifici tipi di cellule neurali di interesse, come la cellula neurale mostrata qui utilizzando anticorpi di superficie cellulare appropriati.