Profilazione metabolica per determinare gli effetti batterici o batteriosfondi dei nuovi prodotti naturali utilizzando la microcalorimetria isotermica

Il chiarimento della modalità d'azione di un nuovo antibiotico è un compito impegnativo nel processo di scoperta dei farmaci. L'obiettivo del metodo qui descritto è l'applicazione di microcalorimetria isotermica utilizzando calScreener nella profilazione antibatterica per fornire ulteriori informazioni sulle interazioni farmaco-microbo.

Comprendere la modalità di azione dei nuovi composti antibatterici è un compito importante ma difficile. Questo metodo fornisce informazioni dettagliate su tali meccanismi ed è facile da implementare. Questa tecnica consente un'osservazione in tempo reale degli effetti antibatterici in modo non invasivo consentendo un'ulteriore analisi del campione.

Sebbene praticare con tecniche microbiologiche sia un prerequisito, l'esperimento è facile da eseguire. Prendersi il proprio tempo con l'analisi dei dati è molto importante quando si esegue la microcalorimetria per la prima volta. Inizia usando uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nanometri per misurare la densità ottica della coltura notturna.

Diluire la coltura ad una 5 per 10 alla 5a colonia formando unità per millilitro di concentrazione media MHB fresca e aggiungere 150 microlitri di cellule a ciascun tubo di antibiotico da 1,5 millilitri alla concentrazione di interesse. Quindi mescolare il composto con le cellule vortice. Per preparare gli inserti, aggiungere 120 microlitri di ogni miscela antibiotica batterica in singoli inserti di plastica nei pozzi appropriati di una piastra da 48 porri e utilizzare una pinzetta per posizionare tutte le fiale di titanio nei supporti.

Trasferire delicatamente gli inserti nelle fiale in titanio nella piastra portante e posizionare liberamente i coperchi in titanio su tutte le fiale. Una volta trasferiti tutti gli inserti, posizionare il supporto sull'area designata sulla stazione campione e utilizzare una chiave di coppia impostata su 40 centinewton metri per stringere tutti i coperchi. Nel software di sistema, avviare un nuovo esperimento e ritrarre il braccio di inserimento del campione dallo strumento.

Posizionare il portasili sul ponte con la colonna otto rivolta verso l'apertura di inserimento del campione e spingere delicatamente il portasili nello strumento in posizione uno. Attendere 10 minuti prima che il sistema si stabilizzi prima di etichettare i pozzi sperimentali. Quindi, spingere il braccio di inserimento del campione fino a quando il supporto della tazza non è in posizione due.

Dopo aver permesso al sistema di stabilizzarsi per 20 minuti, spingere il braccio di inserimento del campione per posizionarlo e ritrarre il braccio di inserimento del campione fino a quando non si trova in posizione di corsa. Evidenziare tutti i pozzi del software e selezionare l'inizio della reazione, quindi eseguire l'esperimento fino a quando le letture delle emissioni di calore sono stabilmente tornate a zero. Al termine dell'analisi, selezionare Interrompi.

Il software ti chiederà quindi se sei sicuro. Selezionare sì e salvare l'esperimento per l'analisi dei dati. Quindi inserire completamente il braccio di inserimento del campione nello strumento e innestare i magneti per recuperare il supporto della tazza.

Per analizzare i dati, aprire il software e selezionare esperimento aperto. Nella finestra popup selezionare l'esperimento di interesse e fare clic su apri. Fare clic su seleziona tutto e definire la linea di base per normalizzare i dati in ogni posizione.

Nella finestra popup selezionare un periodo di tempo superiore a 30 minuti all'interno della fase di ritardo. Dopo la selezione, la linea di base apparirà in verde nel termogramma. Chiudere la finestra della sezione definire la linea di base, quindi fare clic su Salva e chiudere il software.

Aprire quindi l'applicazione di analisi calorimetrica SymCel basata sul Web. Fare clic su sfoglia per caricare il file di interesse e selezionare l'esperimento. I parametri metabolici saranno calcolati automaticamente per i 32 campioni.

Per adattare i dati del flusso di calore ai modelli Gompertz e/o Richards Growth, fare clic sulla funzione di crescita. I modelli di crescita verranno visualizzati nella sezione cumulativa per il confronto con i dati grezzi nella sezione del flusso. Per scaricare i parametri calcolati, fare clic su misure di download, selezionare il percorso del file e fare clic su Salva.

Il file verrà esportato in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Qui vengono visualizzati i termogrammi ottenuti esponendo A.baumannii DSM-30008 alla ciprofloxacina in diluizione seriale. Concentrazioni tra 0,005 e 0,1 micromolare hanno un effetto minimo sulla crescita e sul metabolismo di A.baumannii.

Il trattamento delle cellule con ciprofloxacina 0,5 micromolare, tuttavia, porta a uno spostamento significativo della durata della fase di ritardo e a un flusso di calore massimo inferiore. Questi due cambiamenti insieme influenzano il tempo al picco, con un conseguente aumento di circa sei ore. In questa figura, il calore rilasciato cumulativo viene tracciato rispetto al tempo con l'effetto di ogni concentrazione riflessa da un'inclinazione di pendenza.

La quantificazione dell'inclinazione del termogramma consente di calcolo del tasso metabolico massimo di A.baumannii in presenza di ciprofloxacina con una concomitante diminuzione del tasso metabolico osservato nelle cellule trattate con ciprofloxacina micromolare 0,5. Il trattamento con rifampicina ha un effetto drammatico sui termogrammi di A.baumannii DSM-30008. Si osserva anche una significativa riduzione delle emissioni di calore correlate con una diminuzione dell'attività metabolica.

Si noti l'aumento del time-to-peak per tutte le concentrazioni testate e la diminuzione del tasso metabolico causata dalla diminuzione della pendenza per tutte le concentrazioni che di solito sono attribuite ad un effetto battericida. Per garantire risultati ottimali, utilizzare la pipettazione inversa e prevenire il liquido aggiuntivo ai lati dell'inserto durante il trasferimento del campione, assicurarsi anche che i coperchi siano correttamente chiusi.