Profilazione metabolica per determinare gli effetti batterici o batteriosfondi dei nuovi prodotti naturali utilizzando la microcalorimetria isotermica
29 ottobre 2020
Il chiarimento della modalità d'azione di un nuovo antibiotico è un compito impegnativo nel processo di scoperta dei farmaci. L'obiettivo del metodo qui descritto è l'applicazione di microcalorimetria isotermica utilizzando calScreener nella profilazione antibatterica per fornire ulteriori informazioni sulle interazioni farmaco-microbo.
Comprendere la modalità di azione dei nuovi composti antibatterici è un compito importante ma difficile. Questo metodo fornisce informazioni dettagliate su tali meccanismi ed è facile da implementare. Questa tecnica consente un'osservazione in tempo reale degli effetti antibatterici in modo non invasivo consentendo un'ulteriore analisi del campione.
Sebbene praticare con tecniche microbiologiche sia un prerequisito, l'esperimento è facile da eseguire. Prendersi il proprio tempo con l'analisi dei dati è molto importante quando si esegue la microcalorimetria per la prima volta. Inizia usando uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nanometri per misurare la densità ottica della coltura notturna.
Diluire la coltura ad una 5 per 10 alla 5a colonia formando unità per millilitro di concentrazione media MHB fresca e aggiungere 150 microlitri di cellule a ciascun tubo di antibiotico da 1,5 millilitri alla concentrazione di interesse. Quindi mescolare il composto con le cellule vortice. Per preparare gli inserti, aggiungere 120 microlitri di ogni miscela antibiotica batterica in singoli inserti di plastica nei pozzi appropriati di una piastra da 48 porri e utilizzare una pinzetta per posizionare tutte le fiale di titanio nei supporti.
Trasferire delicatamente gli inserti nelle fiale in titanio nella piastra portante e posizionare liberamente i coperchi in titanio su tutte le fiale. Una volta trasferiti tutti gli inserti, posizionare il supporto sull'area designata sulla stazione campione e utilizzare una chiave di coppia impostata su 40 centinewton metri per stringere tutti i coperchi. Nel software di sistema, avviare un nuovo esperimento e ritrarre il braccio di inserimento del campione dallo strumento.
Posizionare il portasili sul ponte con la colonna otto rivolta verso l'apertura di inserimento del campione e spingere delicatamente il portasili nello strumento in posizione uno. Attendere 10 minuti prima che il sistema si stabilizzi prima di etichettare i pozzi sperimentali. Quindi, spingere il braccio di inserimento del campione fino a quando il supporto della tazza non è in posizione due.
Dopo aver permesso al sistema di stabilizzarsi per 20 minuti, spingere il braccio di inserimento del campione per posizionarlo e ritrarre il braccio di inserimento del campione fino a quando non si trova in posizione di corsa. Evidenziare tutti i pozzi del software e selezionare l'inizio della reazione, quindi eseguire l'esperimento fino a quando le letture delle emissioni di calore sono stabilmente tornate a zero. Al termine dell'analisi, selezionare Interrompi.
Il software ti chiederà quindi se sei sicuro. Selezionare sì e salvare l'esperimento per l'analisi dei dati. Quindi inserire completamente il braccio di inserimento del campione nello strumento e innestare i magneti per recuperare il supporto della tazza.
Per analizzare i dati, aprire il software e selezionare esperimento aperto. Nella finestra popup selezionare l'esperimento di interesse e fare clic su apri. Fare clic su seleziona tutto e definire la linea di base per normalizzare i dati in ogni posizione.
Nella finestra popup selezionare un periodo di tempo superiore a 30 minuti all'interno della fase di ritardo. Dopo la selezione, la linea di base apparirà in verde nel termogramma. Chiudere la finestra della sezione definire la linea di base, quindi fare clic su Salva e chiudere il software.
Aprire quindi l'applicazione di analisi calorimetrica SymCel basata sul Web. Fare clic su sfoglia per caricare il file di interesse e selezionare l'esperimento. I parametri metabolici saranno calcolati automaticamente per i 32 campioni.
Per adattare i dati del flusso di calore ai modelli Gompertz e/o Richards Growth, fare clic sulla funzione di crescita. I modelli di crescita verranno visualizzati nella sezione cumulativa per il confronto con i dati grezzi nella sezione del flusso. Per scaricare i parametri calcolati, fare clic su misure di download, selezionare il percorso del file e fare clic su Salva.
Il file verrà esportato in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Qui vengono visualizzati i termogrammi ottenuti esponendo A.baumannii DSM-30008 alla ciprofloxacina in diluizione seriale. Concentrazioni tra 0,005 e 0,1 micromolare hanno un effetto minimo sulla crescita e sul metabolismo di A.baumannii.
Il trattamento delle cellule con ciprofloxacina 0,5 micromolare, tuttavia, porta a uno spostamento significativo della durata della fase di ritardo e a un flusso di calore massimo inferiore. Questi due cambiamenti insieme influenzano il tempo al picco, con un conseguente aumento di circa sei ore. In questa figura, il calore rilasciato cumulativo viene tracciato rispetto al tempo con l'effetto di ogni concentrazione riflessa da un'inclinazione di pendenza.
La quantificazione dell'inclinazione del termogramma consente di calcolo del tasso metabolico massimo di A.baumannii in presenza di ciprofloxacina con una concomitante diminuzione del tasso metabolico osservato nelle cellule trattate con ciprofloxacina micromolare 0,5. Il trattamento con rifampicina ha un effetto drammatico sui termogrammi di A.baumannii DSM-30008. Si osserva anche una significativa riduzione delle emissioni di calore correlate con una diminuzione dell'attività metabolica.
Si noti l'aumento del time-to-peak per tutte le concentrazioni testate e la diminuzione del tasso metabolico causata dalla diminuzione della pendenza per tutte le concentrazioni che di solito sono attribuite ad un effetto battericida. Per garantire risultati ottimali, utilizzare la pipettazione inversa e prevenire il liquido aggiuntivo ai lati dell'inserto durante il trasferimento del campione, assicurarsi anche che i coperchi siano correttamente chiusi.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per chiarire il meccanismo d'azione di nuovi composti antibatterici mediante microcalorimetria isoterma. La tecnica consente l'osservazione in tempo reale e non invasiva degli effetti antibatterici, fornendo informazioni sulle interazioni tra farmaco e microrganismi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Farmacologia
- Chimica biologica
Sfondo
- Comprendere i meccanismi antibatterici è fondamentale nella scoperta di farmaci.
- La microcalorimetria offre un approccio unico per studiare queste interazioni.
- La raccolta di dati in tempo reale migliora l'analisi degli effetti dei farmaci.
- La pratica di tecniche microbiologiche è essenziale per ottenere risultati accurati.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo per lo studio di composti antibatterici.
- Osservare gli effetti degli antibiotici sul metabolismo batterico.
- Facilitare ulteriori analisi sulle interazioni farmaco-microbo.
Metodi Utilizzati
- Microcalorimetria isoterma con calScreener.
- Preparazione di colture batteriche e miscele di antibiotici.
- Analisi dei dati mediante software specializzato.
- Analisi dei termogrammi per valutare i tassi metabolici.
Risultati principali
- La ciprofloxacina altera in modo significativo la crescita e il metabolismo di A.baumannii.
- I dati sull'emissione di calore si correlano ai cambiamenti dell'attività metabolica.
- La rifampicina mostra una riduzione drammatica dei tassi metabolici.
- La quantificazione dei termogrammi contribuisce a comprendere gli effetti battericidi.
Conclusioni
- Il metodo fornisce informazioni preziose sull'azione degli antibiotici.
- La microcalorimetria è efficace per il monitoraggio in tempo reale delle risposte batteriche.
- Una tecnica corretta e un'analisi accurata dei dati sono fondamentali per ottenere risultati affidabili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La rapida chiarificazione del meccanismo d'azione antibatterico rappresenta un punto critico nella scoperta di antibiotici, influenzando direttamente la validazione del bersaglio e la selezione del portafoglio. La microcalorimetria isoterma consente un profilo quantitativo in tempo reale delle risposte metaboliche, distinguendo gli effetti battericidi da quelli batteriostatici senza intervento dell'operatore. Questo approccio favorisce una maggiore affidabilità predittiva e accelera lo sviluppo di nuovi composti naturali promettenti contro patogeni resistenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'analisi diretta del meccanismo antibatterico attraverso il fingerprinting metabolico.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio differenziando le risposte battericide e batteriostatiche.
- Facilita la riduzione del rischio biologico e la priorizzazione di nuovi composti di origine naturale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce output standardizzati e quantitativi di termogrammi per lo sviluppo solido di saggi.
- Offre letture metaboliche riproducibili adatte all'adattamento per schermature ad alto rendimento.
- Consente un confronto rapido degli effetti dei composti tra specie batteriche e classi di antibiotici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea profili di risposta metabolica allo sviluppo di biomarcatori traducibili per modelli preclinici.
- Supporta la continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica, consentendo analisi approfondite di impronte molecolari.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento corrette in base al rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La microcalorimetria isoterma si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, collegando la validazione precoce del bersaglio, lo screening e la ricerca traslazionale per candidati antibatterici.
- Biologia della scoperta: L'analisi quantitativa dei termogrammi supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione dei rischi meccanicistici.
- Screening: L'output metabolico standardizzato consente la riproducibilità dei saggi e la prontezza allo screening.
- Analisi: Il calcolo automatico dei parametri metabolici e l'adattamento ai modelli di crescita facilitano il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: I termogrammi di riferimento e le impronte metaboliche supportano l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: L'espansione delle banche dati di riferimento migliora l'interpretabilità e consente il riutilizzo della piattaforma in diversi portafogli antibatterici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nel profilo antibatterico.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni metaboliche standardizzate, scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale nella scoperta precoce di antibiotici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo di nuovi composti antibatterici in base alla gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche microbiologiche e nell'analisi dei dati metabolici.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per microcalorimetria isoterma e a software analitici compatibili.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale delle procedure di preparazione dei campioni e di interpretazione dei dati.
- Potrebbe essere necessaria l'adattamento delle condizioni di misurazione per diverse specie batteriche.
- L'interpretazione trae vantaggio dall'accesso a banche crescenti di termogrammi di riferimento per il confronto.
