Name: Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sullattività spontanea della rete ippocampale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri la preparazione di sezioni acute di ippocampo-entorinale nel topo per studiare le oscillazioni di rete neuronali. Questo metodo elettrofisiologico consente registrazioni di potenziali di campo locale e analisi delle dinamiche ippocampali.

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L'autore desidera ringraziare Steve Siegelbaum per il supporto. I finanziamenti sono forniti da 5R01NS106983-02 e 1 F31 NS113466-01.

L'autore non ha nulla da rivelare.

Ci sono diversi passaggi in questo protocollo di affettamento progettato per promuovere la salute dei tessuti e favorire l'emergere di attività spontanea della rete naturalistica: il topo viene transcardially perfuso con soluzione di taglio del saccarosio refrigerato; le fette di corteccia orizzontale-entorinale (HEC) sono tagliate ad uno spessore di 450 μm dall'ippocampo intermedio o ventrale; le fette si riprendono all'interfaccia dell'ACSF riscaldato e dell'aria umidificata ricca di carbogeni; durante le registrazioni...

La misurazione elettrofisiologia da fette ippocampali viventi in vitro è un potente approccio sperimentale con numerosi vantaggi. Lo sperimentatore può usare un microscopio, micromanipolatori e un sistema di registrazione per visualizzare e raccogliere direttamente le misurazioni dai singoli neuroni nel tessuto. Le fette di tessuto sono anche molto accessibili alla fotostimolazione o alla somministrazione di farmaci per esperimenti optogenetici, chemiogenetici o farmacologici.
La rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincrona in vivo,visibile come oscillazioni nel potenziale di campo locale extracellulare1,2,3,4,5. I metodi delle fette cerebrali sono stati sfruttati per ottenere informazioni sui meccanismi cellulari e di circuito alla base di queste oscillazioni della rete neuronale. ha dimostrato che i complessi a catena d'onda affilati (SWR) possono emergere spontaneamente in fette dell'ippocampo ventrale6,7. Studi successivi di più ricercatori hanno gradualmente chiarito molti aspetti degli SWR, tra cui il ruolo dei neuromodulatori nella regolazione dello stato di rete dell'ippocampo8,9,10 e i meccanismi sinaptici che guidano la riattivazione in vitro di insiemi neuronali precedentemente attivi durante il comportamento in vivo11. Gli esperimenti sulle fette cerebrali hanno anche fornito informazioni sull'oscillazione dell'intervallo gamma (30-100 Hz), un distinto stato della rete ippocampale che si ritiene supporti la codifica dellamemoria e richiami 12,13. Infine, riconoscendo il ruolo centrale dell'ippocampo e delle strutture associate nella fisiopatologia dell'epilessia del lobo temporale14,15, i ricercatori hanno utilizzato preparati a fette ippocampali per indagare la generazione e la propagazione dell'attività epileptiforme. carter et al. Successivamente, Karlócai et al. 
Gli investigatori hanno sviluppato numerosi approcci a fette ippocampali che differiscono in modi chiave: (1) la regione dell'ippocampo contenuta nella fetta (dorsale, intermedia o ventrale); 2) la presenza o l'assenza di tessuti extraippocampali come la corteccia entorinale; (3) l'orientamento utilizzato per tagliare le fette (coronale, sagittale, orizzontale o obliquo); e (4) le condizioni in cui il tessuto viene mantenuto dopo l'affezione (immerso completamente in ACSF o tenuto all'interfaccia dell'ACSF e dell'aria umidificata ricca di carbogeni).
La scelta dell'approccio di affezione all'uso dovrebbe essere determinata dall'obiettivo sperimentale. Ad esempio, fette trasversali o coronali dell'ippocampo dorsale mantenute in condizioni sommerse sono state utilizzate in modo molto efficace per lo studio dei circuiti intraippocampali e della plasticità sinaptica18,19,20. Tuttavia, tali preparati non generano spontaneamente oscillazioni di rete così prontamente come fette dall'ippocampo ventrale21,22,23. Sebbene uno stato di attività persistente di CFA possa essere indotto dalla stimolazione tetanica in fette trasversali dall'ippocampo dorsale e ventrale24, gli SWR spontanei sono più facilmente osservati nelle fetteventrali 7,25.
Una distinzione fisiologica e anatomica intrinseca tra l'ippocampo dorsale e ventrale è supportata da studi eseguiti sia in vivo che in vitro26. Le registrazioni nei ratti rivelarono ritmi di theta fortemente coerenti in tutto l'ippocampo dorsale e intermedio, ma scarsa coerenza tra la regione ventrale e il resto dell'ippocampo27. Gli SWR in vivo si propagano prontamente tra l'ippocampo dorsale e intermedio, mentre gli SWR che hanno origine nell'ippocampo ventrale rimangono spessolocali 28. Le proiezioni associativa provenienti dai neuroni piramidali CA3 che risiedono nell'ippocampo dorsale e intermedio proiettano lunghe distanze lungo l'asse longitudinale dell'ippocampo. Le proiezioni CA3 provenienti dalle regioni ventrali rimangono relativamente locali e quindi hanno meno probabilità di essere recise durante il processo diaffezione 29,30. Le fette ventrali possono quindi preservare meglio la rete ricorrente necessaria per generare sincronia della popolazione. La propensione delle fette ventrali a generare attività spontanee di rete in vitro può anche riflettere una maggiore eccitabilità intrinseca dei neuroni piramidali o un'inibizione GABAergica più debole nell'ippocampo ventrale rispetto alle regioni più dorsali31. Infatti, le fette ippocampali ventrali sono più suscettibili all'attività epileptiforme32,33. Così, molti studi di spontaneafisiologica 8,9,11,24 opatologica 16,34,35,36 oscillazioni di rete hanno tradizionalmente utilizzato un approccio di affettare orizzontale, a volte con un leggero angolo nella direzione fronto-occipitale, che produce fette di tessuto parallele al piano trasversale dell'ippocampo ventrale.
La connettività di rete è inevitabilmente influenzata dalla procedura di affettare il numero di celle nella sezione che verrà recisa. L'angolo e lo spessore della fetta e del tessuto trattenuti nella preparazione devono essere considerati per ottimizzare la connettività nei circuiti di interesse. Molti studi hanno utilizzato fette orizzontali combinate di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) per esplorare le interazioni tra le due strutture nel contesto di oscillazioni fisiologiche o patologiche della rete. ha eseguito due registrazioni dal sottocampo CA1 dell'ippocampo e dallo strato V della corteccia entorinale mediale per dimostrare la propagazione dell'attività SWR attraverso la fettaHEC 37. Molti studi sull'attività epileptiforme hanno utilizzato la preparazione della fetta HEC per indagare come le scariche epileptiformi si propagano attraverso la rete corticoippocampale16,35,36,38. È importante notare che la conservazione dell'anello corticoippocampale intatto non è un prerequisito per gli SWR spontanei, le scariche epileptiformi o le oscillazioni gamma; le oscillazioni di rete possono essere generate in fette trasversali dell'ippocampo dorsale o ventrale senza tessuti paraippocampaliattaccati 21,22,23, 25,39,40,41. Un fattore più importante per la generazione spontanea di oscillazioni di rete nelle fette ippocampali può essere lo spessore di ogni fetta, poiché una fetta più spessa (400-550 μm) conserverà una maggiore connettività nella rete ricorrente CA2/ CA321,22,25.
Sebbene siano state utilizzate fette orizzontali angolate di HEC (tagliate con un angolo di circa 12° nella direzione fronto-occipitale) per studiare la connettività funzionale dell'anello corticoippocampale11,16,34,35,42,tali preparati angolati non sono necessari per l'attività spontanea della rete43,44,45. Tuttavia, l'uso di un piano di affettare angolato consente allo sperimentatore di creare selettivamente fette che preservano al meglio le lamelle orientate trasversalmente dell'ippocampo ventrale o intermedio, a seconda che si applica un angolo verso il basso o verso l'alto (Figura 1). Questo approccio è concettualmente simile a quello usato da Papatheodoropoulos et al., 2002, che ha sezionato ogni ippocampo libero e poi ha usato un elicottero tissutale per creare fette trasversali lungo l'intero asse dorsale-ventrale21. Alla luce delle suddette distinzioni funzionali tra l'ippocampo ventrale e dorsale-intermedio, gli investigatori dovrebbero considerare l'origine anatomica delle fette quando progettano esperimenti o interpretano i risultati. L'uso di una rampa di agar durante la procedura di affettare è un modo semplice per produrre preferenzialmente fette dall'ippocampo intermedio o ventrale.
Le fette ippocampali possono essere mantenute in una camera sommersa (con il tessuto completamente immerso in ACSF), o in una camera in stile interfaccia (ad esempio, camera Oslo o Haas, con fette coperte solo da una sottile pellicola di mezzi fluenti). La manutenzione dell'interfaccia migliora l'ossigenazione del tessuto, che promuove la sopravvivenza neuronale e consente alti livelli sostenuti di attività internauronale. Tradizionalmente, le condizioni di registrazione sommerse utilizzano una portata ACSF più lenta che non fornisce un'adeguata ossigenazione dei tessuti per l'espressione stabile delle oscillazioni a livello di rete. Nelle fette ippocampali sommerse le oscillazioni gamma indotte da carbacholo si osservano transitoriamentesolo 46,47, mentre possono essere mantenute stabilmente nelle camere di registrazionedell'interfaccia 10,48,49. Come tale, molti studi di attività spontanea complessa in vitro si sono affidati a camere di registrazione dell'interfaccia per indagarei complessi di increspature a onde acuti6,7,8,9,10,25,37, oscillazioni gamma10,13e attività epileptiforme16,38,45,47.
In una camera di registrazione in stile sommerso, un obiettivo di microscopio ad immersione può essere utilizzato per visualizzare singole cellule e indirizzare selettivamente cellule dall'aspetto sano per le registrazioni. La preparazione sommersa consente anche un controllo fine sull'ambiente cellulare, poiché l'immersione facilita la rapida diffusione di farmaci o altri composti nel tessuto. Pertanto, una metodologia modificata in cui le oscillazioni di rete stabili vengono mantenute in condizioni sommerse rappresenta un potente approccio sperimentale. Questo approccio è esemplificato dal lavoro di Hájos et al., in cui le fette ippocampali si riprendono in una camera di tenuta semplificata in stile interfaccia per diverse ore prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa modificata con un'elevata portata di ACSF (~ 6 mL / min) per migliorare l'apportodi ossigeno al tessuto 12,48,49. In queste condizioni, alti livelli di attività internauron e oscillazioni spontanee stabili della rete possono essere mantenuti in una camera di registrazione sommersa. Questo approccio modificato consente agli investigatori di eseguire registrazioni di patch clamp a celle intere guidate visivamente e caratterizzare il contributo dei tipi di cellule morfologicamente identificati alle oscillazioni gamma indotte da carbacholo12. Gli SWR possono anche verificarsi spontaneamente in fette ippocampali sommerse con una portata veloce di ACSF11,48,49. ha dimostrato che le fette ippocampali che si sono riprese in una camera di interfaccia prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa mostravano in modo affidabile SWR spontanei, mentre le fette che si riprendevano immerse in un becher prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa mostravano risposte di campo evocate più piccole, livelli inferiori di correnti sinaptiche spontanee e solo molto raramente mostravano SWRspontanei 43. ha utilizzato questa metodologia migliorata per dimostrare il ruolo delle cellule del cesto che esprimono parvalbumina nella generazione di SWR spontanei44.
Il seguente protocollo presenta un metodo di affettare attraverso il quale i neuroni spontaneamente attivi nelle fette ippocampali orizzontali possono essere recuperati in condizioni di interfaccia e successivamente mantenuti in una camera di registrazione sommersa adatta a manipolazioni farmacologiche o optogenetiche e registrazioni visivamente guidate.

<table><tbody><tr><td>Stampante 3D</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot TAZ 6</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per incubazione di fette di cervello acuto</td><td>NIH 3D Print Exchange</td><td>3DPX-001623</td><td>Progettato da ChiaMing Lee, disponibile all'indirizzo</td></tr><tr><td>https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 Adenosina 5&prime;-trifosfato sale di magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Ag-Cl pellet macinato</td><td>Warner</td><td>64-1309, (E205)</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Becton, Dickinson</td><td>214530-500g</td><td></td></tr><tr><td>acido ascorbico</td><td>Alfa Aesar</td><td>36237</td><td></td></tr><tr><td>becher (250 mL)</td><td>Kimax</td><td>14000-250</td><td></td></tr><tr><td>becher (400 mL)</td><td>Kimax</td><td>14000-400</td><td></td></tr><tr><td>biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>frullatore</td><td>Oster</td><td>BRLY07-B00-NP0</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Bonn,</td> becton piccolo, capillari in vetro borosilicato <td>Dickinson</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>con filamento (D.E. 1,5 mm, D.I. 0,86 mm, lunghezza 10 cm)</td>Sono <td>preferibili i capillari Sutter</td> <td>Instruments</td><td>BF150-86-10HP</td> lucidati a fuoco.</tr><tr><td>soluzione di cloruro di calcio (1 M)</td><td>G-Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>fotocamera</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>gas carbogeno compresso (95% ossigeno / 5% anidride carbonica)</td><td>Airgas</td><td>X02OX95C2003102</td><td></td></tr><tr><td>ossigeno compresso</td><td>Airgas</td><td>OX 200</td><td></td></tr><tr><td>stimolatore isolato a tensione costante</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>DS2A-Mk.II</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti (22x50 mm)</td><td>VWR</td><td>16004-314</td><td></td></tr><tr><td>adesivo cianoacrilato</td><td>Krazy Glue</td><td>KG925</td><td>Utilizzare idealmente la forma a pennello per il</td></tr><tr><td>software di acquisizione dati</td> di precisione <td>Axograph</td><td>N/A Qualsiasi</td><td>software equivalente (ad es. pClamp) funzionerebbe.</td></tr><tr><td>Workstation tower Dell Precision T1500 Desktop</td><td>Dell</td><td>N/A</td><td>Il numero di catalogo dipende dal computer specifico: qualsiasi computer funziona purché sia in grado di eseguire il software di acquisizione elettrofisiologica.</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td>1-2950-0367</td><td></td></tr><tr><td>timer digitale</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>timer tracciabile a 4 canali</td></tr><tr><td>tamponi assorbenti usa e getta</td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td></td></tr><tr><td>forbici per dissettore</td><td>Fine Science Tools</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>lame di rasoio a doppio taglio</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td></td></tr><tr><td>doppio automatico regolatore di temperatura</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>camera di registrazione ottimizzata a doppia superficie o a flusso laminare</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>La camera presentata in questo protocollo è realizzata su misura. Un equivalente commerciale sarebbe l'RC-27L della Warner Instruments.</td></tr><tr><td>rack per attrezzature</td><td>Automate Scientific</td><td>FR-EQ70"</td><td>Un rack non è strettamente necessario ma utile per organizzare l'elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetietere)- N,N,N',N'-acido teetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>carta da filtro</td><td>Whatman</td><td>1004 070</td><td></td></tr><tr><td>scala fine</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204DR</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammante/marrone</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>piastra di Petri in vetro (100 x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Guanosina 5&prime;-trifosfato sale sodico idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>secchielli per ghiaccio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BAM168072002-1EA</td><td></td></tr> vaporizzatore di <tr><td>isoflurano</td><td>Servizi di anestesia generale</td><td>Tec 3</td><td></td></tr><tr><td>nastro da laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>carta per lenti</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-996</td><td></td></tr><tr><td>sorgente luminosa</td><td>Olympus</td><td>TH4-100</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di cloruro di magnesio (1 M)</td><td>Qualità biologica</td><td>351-033-721EA</td><td></td></tr><tr><td>magnetico ancorette</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-56</td><td>Il numero di catalogo dipenderà dalle dimensioni dell'ancoretta di ancorazione.</td></tr><tr><td>micromanipolatore</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>micromanipolatore (manuale)</td><td>Scientifica</td><td>LBM-2000-00</td><td></td></tr><tr><td>microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>microspatola</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>monitor</td><td>Dell</td><td>2007FPb</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B Amplificatore di microelettrodi Dispositivi</td><td>molecolari</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>Il MultiClamp 700B deve includere headstage, portapipette e una cella modello.</td></tr><tr><td>N-(2-idrossietil)piperazina-N&prime;-(acido 2-etansolfonico), (HEPES)</td><td>Ago Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>(20 gauge, 1,5 di lunghezza)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>filamento di nylon</td><td>YLI Wonder Invisible Thread</td><td>212-15-004</td><td>misura 0,004. Questo gatto. # proviene da Amazon.com</td></tr><tr><td>rete di nylon</td><td>Warner Instruments Corporation</td><td>64-0198</td><td></td></tr><tr><td>pompa perstaltica</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina di(tris) sale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937-1G</td><td></td></tr><tr><td>portapipette</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>filo di platino</td><td>World Precision</td><td>PT0203</td><td></td></tr><tr><td>filamento di acido polilattico (PLA)</td><td>Ultimaker</td><td>RAL 9010</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>gluconato di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1550001-200MG</td><td></td></tr><tr><td>idrossido di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>lamette da barba</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>morsetto a rullo</td><td>Mondo Precision Instruments</td><td>scala 14041</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>manico per bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>arpa a fette</td><td>Warner</td><td>SHD-26GH/2</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>fosfato di sodio monobasico anidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>piruvato di sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>spatola</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr><tr><td>spatola/cucchiaio, grande</td><td>VWR</td><td>470149-442</td><td></td></tr><tr><td>lame di bisturi sterili</td><td>Feather</td><td>72044-10</td><td></td></tr><tr><td>agitatore / piastra riscaldante</td><td>Corning</td><td>6795-220</td><td></td></tr><tr><td>valvole di arresto, 1 via</td><td>World Precision Instruments</td><td>14054</td><td></td></tr><tr><td>valvole di arresto, 3 vie</td><td>World Precision Instruments</td><td>14036</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Acros Organics</td><td></td> AC177142500 <td></td></tr><tr><td>supporto per morsetti girevoli Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-679Q</td><td></td></tr><tr><td>forbici chirurgiche, affilate/smussate</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>siringa (1 mL)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>siringa (60 mL con punta Luer-Lok)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>pinza a tre punte</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-8Q</td><td></td></tr><tr><td>pinza per tessuti, grande</td> pinza per tessuti <td>Fine Science Tools</td><td>11021-15</td><td></td></tr><tr><td>, piccola</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>pipette di trasferimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>tubo</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>ID 1/16 di pollice, OD 3/16 di pollice</td></tr><tr><td>tubo</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td>ID 1/8 di pollice, OD 1/4 di pollice</td></tr><tr><td>grasso per vuoto</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>microtomo a lama vibrante</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo antivibrante con gabbia di Faraday</td><td>Micro-G / TMC-ametek</td><td>2536-516-4-30PE</td><td></td></tr><tr><td>matraccio tarato (1 L)</td>Pallone volumetrico <td>Kimax</td><td>KIM-28014-1000</td><td></td></tr><tr><td>(2 L)</td><td>PYREX</td><td>65640-2000</td><td></td></tr><tr><td>bagno d'acqua calda</td><td>VWR</td><td>1209 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

L'affezione acuta del cervello dei roditori offre un approccio sperimentale trattabile per ottenere informazioni sull'organizzazione e la funzione dei circuiti neurali con risoluzione a singola cellula utilizzando elettrofisiologia, microscopia e farmacologia. Tuttavia, una considerazione importante nella progettazione di esperimenti in vitro è la misura in cui diversi preparati a fette ricapitolano modelli naturalistici di attività neurale osservati in vivo. Nel cervello intatto, la rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincronizzata che riflette lo stato comportamentale dell'animale, come esemplificato dai complessi a catena a onde acuti (SWR) che si verificano durante gli stati consumatori di veglia o il sonno non REM. Gli SWR e altre forme di attività di rete possono emergere spontaneamente in fette ippocampali isolate in condizioni appropriate. Al fine di applicare il potente toolkit di fette cerebrali allo studio dell'attività della rete ippocampale, è necessario utilizzare un approccio che ottimizzi la salute dei tessuti e la conservazione della connettività funzionale all'interno della rete ippocampale. I topi sono perfusi transcardialmente con liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio freddo. Le fette orizzontali contenenti l'ippocampo vengono tagliate con uno spessore di 450 μm per preservare la connettività sinaptica. Le fette si riprendono in una camera in stile interfaccia e vengono trasferite in una camera sommersa per le registrazioni. La camera di registrazione è progettata per la doppia superfusione superficiale di liquido cerebrospinale artificiale ad alta portata per migliorare l'ossigenazione della fetta. Questo protocollo produce tessuti sani adatti allo studio di attività di rete complesse e spontanee in vitro.

Qui sono presentate registrazioni rappresentative da fette HEC preparate come descritto in questo protocollo. Dopo il recupero in una camera di tenuta dell'interfaccia (Figura 1C), le fette vengono trasferite singolarmente in una camera di registrazione sommersa (Figura 2B). La camera di registrazione viene fornita con ACSF saturo di carbogen utilizzando una pompa peristaltica (Figura 2A). La pompa estrae prima L'ACSF da un becher d...

Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Utilizzando questo protocollo, i ricercatori possono studiare i meccanismi alla base delle oscillazioni della rete ippocampale nelle preparazioni acute di fette di cervello di topo. In questa preparazione, le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse in fette che generano oscillazioni spontanee della rete, consentendo l'esecuzione di tecniche farmacologiche e optogenetiche e la visualizzazione di registrazioni di singole cellule. Per la perfusione transcardica, immediatamente prima di rimuovere il topo dalla camera dell'isoflurano, riempire il coperchio di una piastra di Petri con una soluzione di saccarosio refrigerata da tre a cinque millimetri e riempire il fondo della capsula di Petri con circa un centimetro di soluzione di saccarosio refrigerata.Trasferisci rapidamente il mouse anestetizzato sul cuscinetto assorbente sinistro e usa tre pezzi di nastro adesivo per fissare gli arti anteriori e la coda. Usando una pinza per tessuti di grandi dimensioni e forbici chirurgiche, tende la pelle e fai un'incisione longitudinale dalla parte inferiore dello sterno alla parte superiore del torace. Usa le pinze per tirare su lo sterno e usa le forbici per tagliare il diaframma.Usa le forbici per tagliare la gabbia toracica su ciascun lato con un grande movimento verso il punto in cui l'arto anteriore incontra il corpo e usa la pinza per posizionare la parte anteriore della gabbia toracica verso la testa. Usa le forbici per fare un taglio orizzontale per rimuovere completamente le costole e usa la pinza per tenere il cuore in posizione mentre inserisci un ago da perfusione calibro 20 nel ventricolo sinistro. Quando l'ago è in posizione, utilizzare piccole forbici da dissezione per praticare un'incisione nell'atrio destro e consentire al sangue di essere espulso dal sistema circolatorio.Per estrarre il cervello, dopo la decapitazione, utilizzare piccole forbici per eseguire due tagli laterali attraverso il cranio verso la linea mediana nella parte anteriore del cranio vicino agli occhi e fare due tagli aggiuntivi su entrambi i lati della base del cranio. Immergi la testa nella capsula di Petri di vetro e usa le forbici per tagliare lungo la linea mediana per l'intera lunghezza del cranio, tirando verso l'alto con le forbici per ridurre al minimo i danni al tessuto cerebrale sottostante. Usa piccole pinze per tessuti per afferrare saldamente ogni lato del cranio e per sollevare l'osso e allontanarlo dal cervello per aprire il cranio come un libro.Usando le dita della mano sinistra per tenere aperti i lembi del cranio, inserire la microspatola sotto il cervello vicino ai bulbi olfattivi e capovolgere il cervello fuori dal cranio nel saccarosio. Usa la microspatola per recidere il tronco encefalico e lava il cervello per rimuovere eventuali residui di sangue, pelo o tessuti. Usa la spatola grande per trasferire il cervello sul coperchio della capsula di Petri di vetro e usa metà di una lama di rasoio a doppio taglio per fare un taglio coronale nella parte più anteriore del cervello, compresi i bulbi olfattivi.Quindi, fai un taglio coronale per rimuovere il cervelletto e applica l'adesivo cianoacrilato su una rampa di agar. Usa una pinza per asciugare brevemente il cervello su un pezzo di carta da filtro, prima di posizionare il tessuto nell'adesivo sulla rampa dell'agar, con il lato ventrale rivolto verso il basso. Posizionare la piattaforma di affettatura nella camera di affettatura di un microtomo e coprire completamente l'allestimento con una soluzione di saccarosio raffreddata.Usa la spatola grande per mescolare un po' di saccarosio nella camera, sciogliendo il saccarosio congelato e abbassando rapidamente la temperatura della miscela a uno o due gradi Celsius. Tagliare le fette a uno spessore di 450 micron a una velocità di taglio di 0,07 millimetri al secondo. Man mano che ogni fetta viene liberata, usa la pinza per piccoli tessuti e un bisturi affilato per separare i due emisferi e per tagliare via il tessuto fino a quando la fetta non è costituita principalmente dall'ippocampo e dalle regioni periippocampali.Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire le fette singolarmente in una camera di recupero dell'interfaccia contenente aCSF riscaldato. Con le fette posizionate all'interfaccia tra l'aCSF e l'aria, e con solo un sottile menisco di aCSF che copre le fette. Quando tutte le fette sono state acquisite, chiudere ermeticamente la camera per consentire alle fette di riprendersi a 32 gradi Celsius per 30 minuti.Al termine del periodo di recupero, posizionare la camera su un agitatore impostato a bassa velocità per favorire la circolazione dell'aCSF all'interno della camera. Per registrare i potenziali di campo locali, riempire un becher da 400 millilitri con aCSF a bolle di carbogeno e posizionare un'estremità del tubo della pompa nel becher. Accendere una pompa peristaltica a una velocità compresa tra 8 e 10 millilitri al minuto per dirigere l'aCSF dal becher da 400 millilitri a un serbatoio riscaldato e dal serbatoio alla camera di registrazione a 32 gradi Celsius.Quindi, clamp brevemente il tubo e spegnere la pompa per mettere in pausa il flusso. Usando una pinza sottile, trasferire una fetta di tessuto cerebrale nella camera di registrazione vicino all'angolo della carta per lenti su cui è appoggiato il tessuto, tagliarla verso il basso. Staccare la carta per lenti, lasciando la fetta emersa nella camera di registrazione, e utilizzare un'arpa per fissare la fetta.Utilizzando un micromanipolatore manuale, far avanzare lentamente la punta di una pipetta di stimolazione riempita di cloruro di sodio sulla superficie della fetta con un angolo da 30 a 45 gradi, quindi utilizzare un secondo micromanipolatore per far avanzare lentamente la punta di una pipetta di potenziale di campo locale riempita con aCSf nella regione di interesse con un angolo da 30 a 45 gradi, e registrare il potenziale di campo locale del campione secondo i protocolli standard. In questa figura si possono osservare registrazioni rappresentative da fette di corteccia entorinale dell'ippocampo, preparate secondo il protocollo come dimostrato. Nelle fette sane, la stimolazione elettrica dovrebbe produrre un potenziale post-sinaptico di campo con una piccola raffica di fibre pre-sinaptiche e un grande potenziale post-sinaptico con una rapida discesa iniziale.Le increspature spontanee delle onde acute dovrebbero anche essere visibili come deflessioni positive nel potenziale di campo locale nello strato piramidale. Nelle fette non ottimali, i potenziali post-sinaptici del campo evocato dimostrano una grande raffica di fibre e un potenziale post-sinaptico relativamente piccolo, e tali fette non mostrano increspature spontanee di onde taglienti. Le increspature ad onda acuta in vitro dimostrano un potenziale di campo positivo nello strato piramidale, con un'oscillazione ad alta frequenza sovrapposta abbinata a un potenziale di campo negativo nello strato radiante.Come illustrato, le increspature a onde acute nelle fette di corteccia entorinale dell'ippocampo hanno origine all'interno dei circuiti ricorrenti CA2/CA3 e si propagano a CA1. È essenziale far bollire il carbogeno nelle soluzioni durante tutta la procedura, per garantire che la soluzione di saccarosio sia raffreddata ed eseguire ogni passaggio il più rapidamente possibile. Dopo aver preparato queste fette, è possibile eseguire registrazioni extracellulari o intracellulari, insieme a esperimenti optogenetici o farmacologici per determinare in che modo i diversi tipi di cellule contribuiscono alla funzione delle reti neurali.

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Questo articolo descrive le procedure per la preparazione di fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche associate con l'invecchiamento cerebrale e le malattie neurodegenerative legate all'età, come la malattia di Alzheimer.

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

Questo video mostra un protocollo dettagliato per la preparazione di fette orizzontali di cervello ippocampale dai topi, concentrandosi sulla conservazione dell'integrità dei percorsi delle fibre ippocampali. Il processo prevede l'attenta bisezione e fissaggio del cervello, l'utilizzo di un vibratomo per affettare e il mantenimento delle condizioni tissutali ottimali con un fluido carbogenato, ottenendo fette di cervello ippocampale pronte per ulteriori sperimentazioni.

Ottenere fette orizzontali di cervello ippocampale di topo

Il video mostra una procedura per registrare il potenziale di campo locale (LFP) in fette di corteccia ippocampale-entorinale di topo. La stimolazione elettrica è fornita allo strato radio CA3 dell'ippocampo, che provoca cambiamenti nel potenziale postsinaptico allo strato piramidale CA1. Viene registrato il cambiamento combinato nel potenziale di membrana dei neuroni CA1, chiamato potenziale di campo locale.

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Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

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Vi illustriamo come eseguire registrazione ed elettrica modulazione di attività epileptiform indotta da 4-aminopyridine in fettine di cervello del roditore utilizzando matrici microelettrodo. Una camera di registrazione personalizzata mantiene la vitalità del tessuto durante prolungate sessioni sperimentali. Live mapping di elettrodo e selezione di coppie stimolante sono eseguite da un'interfaccia di utente grafica personalizzata.

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