Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Utilizzando questo protocollo, i ricercatori possono studiare i meccanismi alla base delle oscillazioni della rete ippocampale nelle preparazioni acute di fette di cervello di topo. In questa preparazione, le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse in fette che generano oscillazioni spontanee della rete, consentendo l'esecuzione di tecniche farmacologiche e optogenetiche e la visualizzazione di registrazioni di singole cellule. Per la perfusione transcardica, immediatamente prima di rimuovere il topo dalla camera dell'isoflurano, riempire il coperchio di una piastra di Petri con una soluzione di saccarosio refrigerata da tre a cinque millimetri e riempire il fondo della capsula di Petri con circa un centimetro di soluzione di saccarosio refrigerata.

Trasferisci rapidamente il mouse anestetizzato sul cuscinetto assorbente sinistro e usa tre pezzi di nastro adesivo per fissare gli arti anteriori e la coda. Usando una pinza per tessuti di grandi dimensioni e forbici chirurgiche, tende la pelle e fai un'incisione longitudinale dalla parte inferiore dello sterno alla parte superiore del torace. Usa le pinze per tirare su lo sterno e usa le forbici per tagliare il diaframma.

Usa le forbici per tagliare la gabbia toracica su ciascun lato con un grande movimento verso il punto in cui l'arto anteriore incontra il corpo e usa la pinza per posizionare la parte anteriore della gabbia toracica verso la testa. Usa le forbici per fare un taglio orizzontale per rimuovere completamente le costole e usa la pinza per tenere il cuore in posizione mentre inserisci un ago da perfusione calibro 20 nel ventricolo sinistro. Quando l'ago è in posizione, utilizzare piccole forbici da dissezione per praticare un'incisione nell'atrio destro e consentire al sangue di essere espulso dal sistema circolatorio.

Per estrarre il cervello, dopo la decapitazione, utilizzare piccole forbici per eseguire due tagli laterali attraverso il cranio verso la linea mediana nella parte anteriore del cranio vicino agli occhi e fare due tagli aggiuntivi su entrambi i lati della base del cranio. Immergi la testa nella capsula di Petri di vetro e usa le forbici per tagliare lungo la linea mediana per l'intera lunghezza del cranio, tirando verso l'alto con le forbici per ridurre al minimo i danni al tessuto cerebrale sottostante. Usa piccole pinze per tessuti per afferrare saldamente ogni lato del cranio e per sollevare l'osso e allontanarlo dal cervello per aprire il cranio come un libro.

Usando le dita della mano sinistra per tenere aperti i lembi del cranio, inserire la microspatola sotto il cervello vicino ai bulbi olfattivi e capovolgere il cervello fuori dal cranio nel saccarosio. Usa la microspatola per recidere il tronco encefalico e lava il cervello per rimuovere eventuali residui di sangue, pelo o tessuti. Usa la spatola grande per trasferire il cervello sul coperchio della capsula di Petri di vetro e usa metà di una lama di rasoio a doppio taglio per fare un taglio coronale nella parte più anteriore del cervello, compresi i bulbi olfattivi.

Quindi, fai un taglio coronale per rimuovere il cervelletto e applica l'adesivo cianoacrilato su una rampa di agar. Usa una pinza per asciugare brevemente il cervello su un pezzo di carta da filtro, prima di posizionare il tessuto nell'adesivo sulla rampa dell'agar, con il lato ventrale rivolto verso il basso. Posizionare la piattaforma di affettatura nella camera di affettatura di un microtomo e coprire completamente l'allestimento con una soluzione di saccarosio raffreddata.

Usa la spatola grande per mescolare un po' di saccarosio nella camera, sciogliendo il saccarosio congelato e abbassando rapidamente la temperatura della miscela a uno o due gradi Celsius. Tagliare le fette a uno spessore di 450 micron a una velocità di taglio di 0,07 millimetri al secondo. Man mano che ogni fetta viene liberata, usa la pinza per piccoli tessuti e un bisturi affilato per separare i due emisferi e per tagliare via il tessuto fino a quando la fetta non è costituita principalmente dall'ippocampo e dalle regioni periippocampali.

Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire le fette singolarmente in una camera di recupero dell'interfaccia contenente aCSF riscaldato. Con le fette posizionate all'interfaccia tra l'aCSF e l'aria, e con solo un sottile menisco di aCSF che copre le fette. Quando tutte le fette sono state acquisite, chiudere ermeticamente la camera per consentire alle fette di riprendersi a 32 gradi Celsius per 30 minuti.

Al termine del periodo di recupero, posizionare la camera su un agitatore impostato a bassa velocità per favorire la circolazione dell'aCSF all'interno della camera. Per registrare i potenziali di campo locali, riempire un becher da 400 millilitri con aCSF a bolle di carbogeno e posizionare un'estremità del tubo della pompa nel becher. Accendere una pompa peristaltica a una velocità compresa tra 8 e 10 millilitri al minuto per dirigere l'aCSF dal becher da 400 millilitri a un serbatoio riscaldato e dal serbatoio alla camera di registrazione a 32 gradi Celsius.

Quindi, clamp brevemente il tubo e spegnere la pompa per mettere in pausa il flusso. Usando una pinza sottile, trasferire una fetta di tessuto cerebrale nella camera di registrazione vicino all'angolo della carta per lenti su cui è appoggiato il tessuto, tagliarla verso il basso. Staccare la carta per lenti, lasciando la fetta emersa nella camera di registrazione, e utilizzare un'arpa per fissare la fetta.

Utilizzando un micromanipolatore manuale, far avanzare lentamente la punta di una pipetta di stimolazione riempita di cloruro di sodio sulla superficie della fetta con un angolo da 30 a 45 gradi, quindi utilizzare un secondo micromanipolatore per far avanzare lentamente la punta di una pipetta di potenziale di campo locale riempita con aCSf nella regione di interesse con un angolo da 30 a 45 gradi, e registrare il potenziale di campo locale del campione secondo i protocolli standard. In questa figura si possono osservare registrazioni rappresentative da fette di corteccia entorinale dell'ippocampo, preparate secondo il protocollo come dimostrato. Nelle fette sane, la stimolazione elettrica dovrebbe produrre un potenziale post-sinaptico di campo con una piccola raffica di fibre pre-sinaptiche e un grande potenziale post-sinaptico con una rapida discesa iniziale.

Le increspature spontanee delle onde acute dovrebbero anche essere visibili come deflessioni positive nel potenziale di campo locale nello strato piramidale. Nelle fette non ottimali, i potenziali post-sinaptici del campo evocato dimostrano una grande raffica di fibre e un potenziale post-sinaptico relativamente piccolo, e tali fette non mostrano increspature spontanee di onde taglienti. Le increspature ad onda acuta in vitro dimostrano un potenziale di campo positivo nello strato piramidale, con un'oscillazione ad alta frequenza sovrapposta abbinata a un potenziale di campo negativo nello strato radiante.

Come illustrato, le increspature a onde acute nelle fette di corteccia entorinale dell'ippocampo hanno origine all'interno dei circuiti ricorrenti CA2/CA3 e si propagano a CA1. È essenziale far bollire il carbogeno nelle soluzioni durante tutta la procedura, per garantire che la soluzione di saccarosio sia raffreddata ed eseguire ogni passaggio il più rapidamente possibile. Dopo aver preparato queste fette, è possibile eseguire registrazioni extracellulari o intracellulari, insieme a esperimenti optogenetici o farmacologici per determinare in che modo i diversi tipi di cellule contribuiscono alla funzione delle reti neurali.