Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati

Questo protocollo può aiutarci a caratterizzare la risposta immunitaria dell'ospite contro diversi biomateriali che possono successivamente aiutare a progettare migliori impianti medici futuri. La citometria a flusso ci fornisce informazioni sulle cellule immunitarie che si infiltrano in un biomateriale che ci aiuta a determinare i meccanismi di come le cellule rispondono alla lesione e all'impianto di materiale, nonché i bersagli per migliorare le terapie. Lo stesso protocollo può essere modificato per caratterizzare la risposta immunitaria in diversi contesti.

Sezionare il muscolo quadricipite di topi che hanno ricevuto un impianto ECM una settimana fa e raccolti in una provetta da 50 millilitri contenente cinque millilitri di terreno privo di siero. Infine tagliate a dadini il fazzoletto con le forbici. Quindi, aggiungi cinque millilitri di media di enzimi digestivi al tubo.

Mettere la provetta contenente i terreni digestivi e i fazzoletti tagliati a cubetti in un'incubatrice agitata per 45 minuti a 37 gradi Celsius e 100 giri/min. Al termine dell'incubazione, filtrare la sospensione tissutale digerita attraverso un colino da 70 micron in una provetta individuale da 50 millilitri. Utilizzare una testina da siringa da cinque millilitri per schiacciare qualsiasi pezzo solido di fazzoletti e lavare il filtro con PBS a temperatura ambiente.

Eliminare eventuali residui nel filtro e regolare il volume del tubo a 50 millilitri con PBS a temperatura ambiente. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet in 10 millilitri di soluzione fredda di EDTA da cinque millimolari in PBS. Se nel campione sono presenti cellule del sangue, risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi, incubare per 10 minuti, quindi aggiungere nove millilitri di EDTA.

Lasciare la sospensione sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi regolare il volume a 50 millilitri con PBS freddo. Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere i pellet e 100 microlitri di PBS freddo.

Trasferire 10 microlitri della sospensione in singole provette da microcentrifuga e mescolare con 10 microlitri di trip e blu per il conteggio. Erogare il volume rimanente di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Rimuovere 20 microlitri di cellule dal pozzetto e aggiungerle in un nuovo pozzetto da utilizzare come controllo non colorato.

Quindi utilizzare PBS per portare il volume finale in ciascun pozzetto a 200 microlitri. Raccogliere le cellule sul fondo dei pozzetti della piastra mediante centrifugazione e risospendere le cellule in 100 microlitri di una concentrazione da uno a 1000 di colorante di vitalità per pozzetto. Al termine dell'incubazione, lavare ogni pozzetto con 100 microlitri di PBS fresco e risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone colorante per pozzetto.

Dopo la seconda centrifugazione, risospendere le cellule in 50 microlitri di diluizione da uno a 100 di bloccante monocitario. Incubare la sospensione cellulare per cinque minuti su ghiaccio e poi aggiungere 50 microlitri di cocktail di anticorpi. Incubare per 30 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce.

Quindi lavare i pozzetti con 100 microlitri di tampone colorante per pozzetto. Centrifugare nuovamente le cellule e lavarle con 200 microlitri di tampone colorante. Ripetere il processo altre due volte e poi risospendere le cellule in 400 microlitri di tampone colorante.

Prima di analizzare il campione, eseguire un campione non colorato per consentire di regolare la popolazione cellulare su un grafico a dispersione laterale rispetto a un grafico a dispersione diretta. Successivamente, eseguire il campione colorato. Estrarre la firma autofluorescente.

Quindi importare i file FCS per utilizzarli come controllo per l'unmixing. Fare clic sull'icona di unmixing per aprire la procedura guidata di unmixing ed eseguire l'unmixing utilizzando tutti i controlli di un singolo colore controllando le popolazioni positive e negative. Quindi, fai clic sulla sezione QC e guarda l'indice di complessità.

L'indice di complessità è una misura di quanto sia distinguibile una raccolta di firme spettrali quando le firme spettrali non sono mescolate insieme. Infine, demixate il campione facendo clic su Live Unmix. Qui, si possono osservare i risultati di un 14 fatti di colore sul tessuto di topo di controllo.

In questa analisi, è stato possibile osservare diverse popolazioni di lobbisti, come i neutrofili positivi ly6g e le classi di monociti ly6c a media e alta espressione. Le cellule dendritiche positive ad alto MHC CD11c erano prontamente evidenti quando sono state gate contro CD11b per escludere i macrofagi e altre cellule della linea mieloide come neutrofili e monociti. Un sottogruppo di cellule dendritiche CD206 positive CD86 positive potrebbe essere identificato concentrandosi su questa popolazione CD11c positiva, che include sia CD86 ad alto M1 come le cellule dendritiche che CD206 ad alto M2 come le popolazioni di cellule dendritiche.

F4/80 ha dimostrato un gradiente di espressione come si osserva comunemente in varie popolazioni di macrofagi. Siglec-F era presente sia su popolazioni F4-80 positive che negative, molto probabilmente corrispondenti rispettivamente a un sottogruppo di macrofagi e a eosinofili. Sebbene la colorazione con marcatori di superficie cellulare consenta di effettuare queste designazioni di tipi di cellule, è importante notare che le cellule che esprimono marcatori diversi dovrebbero essere viste in modo funzionale rispetto a una classificazione più binaria.

Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la comprensione della firma autofluorescente dei campioni sottoprodotti prima di progettare il pannello è fondamentale per ottenere una migliore miscelazione. Oltre ad analizzare le cellule, le cellule isolate possono essere suddivise in popolazioni specifiche per valutazioni a valle con saggi cellulari, in vitro, analisi trascrittomica o per analisi microscopiche per valutare la morfologia cellulare. La crescente complessità delle analisi di citometria a flusso dei biomateriali aiuta a colmare il divario tra gli studi immunologici di base e l'ingegnerizzazione di nuove terapie.