Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l'analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire e valutare esperimenti di consegna genica utilizzando nanoparticelle polimeriche non virali. Ciò si ottiene sezionando prima le cellule con particelle di consegna genica. L'efficienza della trasfezione viene quindi valutata mediante microscopia e analisi di citometria a flusso ad alto rendimento.

Successivamente, la distribuzione dimensionale delle nanoparticelle, la concentrazione e i plasmidi per particella vengono determinati utilizzando uno strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle. In definitiva, questo metodo consente la caratterizzazione delle dimensioni delle nanoparticelle e l'efficacia della trasfezione utilizzando le nanoparticelle. Il vantaggio principale dell'utilizzo di nanoparticelle polimeriche biodegradabili per la consegna genica è che possono essere più sicure ed efficaci rispetto ad altri metodi di trasferimento genico.

Il vantaggio principale dell'analisi del tracciamento delle nanoparticelle rispetto ai metodi esistenti come la diffusione dinamica della luce è che l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle fornisce direttamente il numero, la distribuzione media e la concentrazione delle particelle. Questo metodo aiuterebbe a rispondere a domande chiave nel campo della consegna genica non virale, come il numero di plasmidi per particella, che è importante per gli studi di co-espressione. Il seguente protocollo è dimostrato utilizzando cellule endoteliali retiniche umane o hre come cellule modello e poli beta amminoesteri o PBA AE come polimeri modello.

Si noti che potrebbe essere necessario regolare le condizioni di coltura e i solventi a seconda delle cellule e dei polimeri utilizzati 24 ore prima. Trasfezione. Utilizzare una pipetta multicanale per seminare hre in coltura di tessuto chiaro trattato in piano. Piastre inferiori a 96 pozzetti a una concentrazione da 25 a 50 cellule per microlitro.

Ciò conferirà una fluidità del 70-80% di co il giorno della trasfezione, preparerà ed etichetterà le colture non tissutali chiare trattate. Piastre da 96 pozzetti che fungeranno da piastre master per preparare e diluire il PBA e il DNA. Verranno preparati due piatti identici.

Uno per la valutazione della tossicità e uno per la valutazione dell'efficienza della trasfezione. Seguire l'estere poli-beta amminoacido o il polimero PVAE e le soluzioni madre P-E-G-F-P-N 1D NA a temperatura ambiente. Una volta rasato, utilizzare una pipetta a 12 canali per preparare un pozzetto contenente 50 microlitri di DNA da 0,06 milligrammi per millilitro in tampone acetato di sodio da 25 millimolari per ogni condizione.

Successivamente, sulla stessa piastra, diluire i polimeri PBAE a 10 milligrammi per millilitro in tampone di acetato di sodio. Quindi diluire ulteriormente i polimeri PBAE in rapporti tra peso del polimero e peso del DNA di 30 e 60 e 50 microlitri di tampone acetato di sodio. Per la formazione di nanoparticelle, utilizzare una pipetta a 12 canali per combinare i 50 microlitri di PBA diluito con i 50 microlitri di DNA plasmatico diluito miscelati energicamente pipettando su e giù.

Quindi lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire l'autoassemblaggio. Dopo l'autoassemblaggio, utilizzare una pipetta a 12 canali per aggiungere 20 microlitri della soluzione di nanoparticelle goccia a goccia a ciascun pozzetto delle cellule seminate contenenti il mezzo di trasfettare quattro pozzetti per condizione, come mostrato in questo diagramma. Per ogni piastra, riservare almeno quattro pozzetti per ciascuno dei controlli negativi e positivi.

Il controllo negativo è costituito da cellule non trattate e i controlli positivi sono costituiti da cellule trasfettate con un reagente disponibile in commercio come lipo 2000 o Fuge hd. Incubare le piastre con le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius per quattro ore Dopo l'incubazione, utilizzare la pipetta a 12 canali per rimuovere il terreno dalle cellule e sostituirlo con 100 microlitri per pozzetto di hre fresco. Incubare a medio per altre 24-48 ore.

Il giorno successivo, rimuovere una piastra dall'incubatrice. Valutare la trasfezione e la tossicità cellulare mediante microscopia a fluorescenza e quantificare la tossicità cellulare utilizzando il saggio del titolo cellulare 96 acquoso come descritto nel testo allegato. Trascorse le 48 ore, rimuovere l'altra piastra dall'incubatrice.

Valutare l'efficienza della trasfezione mediante fluorescenza, microscopia e citometria a flusso come descritto nel testo di accompagnamento. Utilizzare i dati di tossicità e trasfezione acquisiti qui per determinare le concentrazioni ottimali di PBA da utilizzare per esperimenti futuri. Il nano sito NS 500 è uno strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle in grado di fornire informazioni sulla distribuzione dimensionale di un campione di nanoparticelle tracciando la diffusione delle singole nanoparticelle prima di utilizzare il sistema fluidico del nanosito in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri.

Preparare il PBA e il DNA plasmatico per l'analisi come prima alle stesse concentrazioni utilizzate nella sezione precedente di questo video. Dopo l'autoassemblaggio, diluire la soluzione di nanoparticelle 100 volte in PBS in un nuovo tubo da 1,5 millilitri per ottenere un volume finale di almeno 500 microlitri. Ciò produrrà una concentrazione di nanoparticelle nell'intervallo appropriato per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle.

Quindi, caricare il campione nel nanosito. Assicurati di non introdurre bolle d'aria, controllato visivamente per assicurarti che ci siano tra le 20 e le 100 particelle sullo schermo. Un numero ideale per il tracciamento delle nanoparticelle è di circa 50 particelle.

Se ce ne sono troppi o troppo pochi, lavare l'NS 500, regolare la diluizione in PBS e ricaricare il campione. Se il numero di particelle sullo schermo è compreso tra 20 e 100, cattura video. Una volta acquisiti i video, procedi alla fase di elaborazione aprendo un file video nello stesso software.

Quindi, una volta aperto il file, aumenta il guadagno dello schermo. Selezionare la regolazione automatica per i parametri dell'immagine facendo clic sulle caselle appropriate. Se una particella sullo schermo viene riconosciuta dal software, verrà contrassegnata con una croce rossa.

Una volta che tutte le particelle sono state contrassegnate, fare clic sul pulsante di processo nel software per elaborare il file video. Verranno quindi visualizzate la dimensione delle particelle, la distribuzione, le dimensioni medie e la concentrazione delle particelle per verificare che il conteggio delle particelle sia accurato. Ripetere questa procedura utilizzando lo stesso campione diluito di due x e quattro.

Forex in PBS apre sono stati trasfettati con le nanoparticelle E-G-F-P-P-B-A-E come mostrato in questo video. Per valutare visivamente l'efficienza della trasfezione, è stata eseguita l'imaging al microscopio a fluorescenza. Queste immagini mostrano il campo chiaro a fluorescenza e le immagini unite delle cellule trasfettate come si vede nell'immagine unita, la maggior parte delle cellule esprime EGFP e mantiene una morfologia normale.

Per quantificare l'efficienza della trasfezione, è stata eseguita la citometria a flusso, come si può vedere in questa figura dopo aver effettuato il gating sulla popolazione viva. La popolazione non resecata non conteneva cellule EGFP positive. Tuttavia, il 71,6% delle cellule trattate era positivo per il nanosito EGFP L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle è stata quindi utilizzata per determinare la distribuzione dimensionale e la concentrazione delle nanoparticelle.

Per questa analisi, è importante che la distribuzione granulometrica sia monodispersa. Utilizzando queste informazioni, il numero medio di plasmidi per particella può essere calcolato dividendo la concentrazione di plasmidi in soluzione per la concentrazione di particelle determinata dall'NS 500. Il numero di plasmidi per particella è una distribuzione che riflette la distribuzione granulometrica.

All'interno del campione, ci saranno particelle più grandi con il valore dei plasmidi per particella superiore alla media, così come particelle più piccole con il valore dei plasmidi per particella inferiore alla media. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non lasciare che i polimeri degradabili rimangano in solvente acquoso troppo a lungo prima di aggiungere nanoparticelle alle celle per l'utilizzo di ncy, regolare la diluizione appropriata per il dimensionamento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasfettare i tipi di cellule di aderenza con polimeri di consegna genica non virali, oltre a misurare l'efficacia della trasfezione e la distribuzione delle dimensioni delle particelle.

Non dimenticare che lavorare con le cellule umane è a rischio biologico. Indossare sempre dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cabina di biosicurezza durante l'esecuzione di questa procedura.