L'uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare l'intrappolamento ottico combinato con la microscopia confocale a disco rotante per osservare le interazioni tra ospite e patogeno in tempo reale. Ciò si ottiene aggiungendo prima gli agenti patogeni di interesse a un vetro di copertura a camera. Successivamente, una particella viene selezionata e catturata con la trappola ottica.

Infine, la particella viene diretta verso la cellula di interesse. Come si vede qui. L'intrappolamento ottico può essere un metodo efficace per il controllo di due particelle per l'osservazione delle interazioni intracellulari dinamiche.

Questo metodo può rispondere a domande importanti sulle interazioni tra patogeni dell'ospite e l'immunologia nel campo delle malattie infettive e dell'immunologia, tra cui qual è l'effetto della fagocitosi quando si ottiene il controllo completo delle relazioni spaziali tra le cellule ospiti e i patogeni, nonché se l'ordine dei patogeni assorbiti da una cellula fagocitaria influisce sulla maturazione somica pha. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le condizioni di intrappolamento devono essere ottimizzate per diversi tipi di celle e perline. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale come processo di configurazione e integrazione di un disco rotante.

La confocale a una trappola ottica è difficile da concettualizzare a causa dell'allineamento preciso necessario per tutti i componenti ottici. Raccogli l'agente patogeno di interesse. Ad esempio, qui, 300 microlitri di Canada albicans coltivati durante la notte in brodo vengono rimossi dalla coltura e trasferiscono gli agenti patogeni in una provetta di reazione da 1,5 millilitri.

Quindi lavare gli agenti patogeni tre volte a circa 1300 Gs per cinque minuti a temperatura ambiente, aspirando il surnatante e lasciando il pellet indisturbato ogni volta che viene risospeso PBS e sonicato. Dopo il terzo lavaggio, sospendere nuovamente il pellet in 500 microlitri di PBS. Successivamente, sciogliere un milligrammo del colorante di entrust in 100 microlitri di dimetilformammide per una concentrazione finale di 10 milligrammi per millilitro.

Quindi aggiungere tre microlitri della miscela di colorante al tubo di reazione contenente gli agenti patogeni lavati. Posizionare un foglio attorno alle provette poiché i coloranti sono sensibili alla luce e agitare il campione a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi pellettare e lavare il campione in PB S3 volte come prima. Risospendere il pellet in 300 microlitri di PBS dopo l'ultimo lavaggio.

Caldo media tryin e PVS a 37 gradi Celsius a bagnomaria Wash. Una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri rivestita due volte con macrofagi grezzi 2 6 4 0,7 con PBS che aspira il PBS tra un lavaggio e l'altro. Quindi, coprire la superficie della piastra con cinque millilitri di tripsina e incubare la piastra per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi battere delicatamente il lato della piastra per staccare le celle dalla superficie della piastra. Facendo attenzione a non spruzzare la tripsina all'esterno della piastra. Ora aggiungi cinque millilitri di terreno alla piastra e trasferisci la miscela in una provetta di reazione.

Dopo la pellettatura, le celle aspirano il terreno facendo attenzione a non disturbare il pellet e riprospendono il pellet in 10 millilitri di terreno. Aggiungere 400 microlitri di terreno in ciascuna camera di un vetrino, quindi aggiungere cinque microlitri di sospensione cellulare in ciascuna camera. Lasciare che le cellule crescano durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2.

Recuperare il vetrino della camera dalla pipetta dell'incubatore da cinque a 10 microlitri dei patogeni di interesse marcati in fluorescenza precedentemente preparati in ciascuna camera di macrofagi. Mescolare accuratamente i macrofagi e gli agenti patogeni pipettando su e giù, facendo attenzione a non toccare il fondo della camera e disturbare i macrofagi aderenti. Accendere tutti i componenti del microscopio confocale a disco rotante.

Preparare il microscopio aggiungendo olio alla lente dell'obiettivo a immersione in olio. Inserire il vetrino da camera nel tavolino specializzato, quindi rimuovere la parte superiore del microscopio di allineamento dei vetrini da camera per l'imaging DIC. Accendere l'otturatore per la trappola ottica e il laser IR.

Quindi aprire l'otturatore del laser sulla trappola ottica. Verificare che l'otturatore davanti al laser IR sia chiuso controllando con la scheda IR. Ora concentrati sui macrofagi sul vetrino aderito.

Quindi trova gli agenti patogeni che galleggiano liberamente nella soluzione adiacente ai macrofagi. La parte più difficile di questa procedura è trovare l'oggetto giusto da tracciare nella camera del campione a causa delle forze di adesione tra l'oggetto e il vetro di copertura nella camera del campione. Per spostare quell'oggetto, devi muovere il palco mentre l'oggetto è tenuto dal laser del traffico, ed è anche importante notare che devi muovere il palco a una posizione abbastanza lenta in modo tale che la forza di trascinamento del palco non superi la forza massima di intrappolamento della trappola.

Spostare il tavolino in modo che l'agente patogeno si trovi nelle vicinanze della trappola. Quindi aprire l'otturatore e innestare la trappola. Spostare il campione per portare i macrofagi a contatto con un'immagine di patogeno intrappolato stazionaria.

I patogeni con un microscopio confocale a disco rotante in fluorescenza DIC o una combinazione di entrambe le popolazioni separate di Canada albicans, che in genere hanno una dimensione di circa cinque micron, sono stati etichettati in verde, blu e rosso. Per illustrare l'imaging, un singolo C albicans è stato intrappolato e spostato in uno schema quadrato attraverso un grappolo di altri lieviti, come indicato dalle frecce grigie, dimostrando la capacità di catturare e manipolare la posizione specifica di un singolo patogeno scelto dall'operatore anche in un ambiente affollato. Per illustrare ulteriormente la flessibilità di questo sistema nell'intrappolare le diverse morfologie di forma esibite dagli organismi patogeni in questa figura, la pinzetta ottica è stata utilizzata per trattenere e localizzare una particella di C albicans con una pseudo ifia.

Il C albicans è marcato con colorante rosso e spostato lungo una traiettoria come delineato dalla freccia bianca e posizionato accanto alle cellule grezze fluorescenti GFPL C3. In verde. La parte di lievito dell'albicans è rimasta intrappolata mentre la pseudo hyphy si trascinava.

Anche l'Aspergillus fum goddess è stato posizionato accanto a una cellula macrofagica di topo cruda per analizzare il periodo di tempo assoluto della fagocitosi con questa particolare linea cellulare e patogeno. In questa figura, le immagini in campo chiaro mostrano come l'aspergillus intrappolato, come indicato dalla freccia bianca, sia stato spostato e posizionato lungo il percorso come indicato dalla freccia rossa. L'agente patogeno intrappolato è leggermente fuori fuoco a causa della trappola che spinge l'organismo leggermente al di sopra del piano focale.

L'aspergillus è stato spostato fino a quando non è stato posizionato adiacente alla cella grezza desiderata. Una volta che l'agente patogeno è entrato in contatto con la cellula, la trappola è stata spenta. Il processo di fagocitosi è stato attivato e l'imaging time-lapse è stato impiegato per osservare i successivi eventi cellulari.

A 30 secondi, la membrana della cellula grezza ha iniziato a cambiare e a formare una coppa attorno alla particella. A 60 secondi, la tazza era completamente formata. Da 90 secondi a 150 secondi, l'Afu Gotti stava diventando e inghiottito, e dopo 180 secondi la particella era completamente interiorizzata.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come creare un apparato trappola ottica a disco rotante e su come un tale strumento possa consentire di controllare in modo non invasivo gli agenti patogeni per l'imaging di cellule vive dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle interazioni tra agenti patogeni dell'ospite per studiare il ruolo delle relazioni spaziali tra le cellule ospiti e i patogeni e il suo ruolo sulla conseguente risposta immunitaria.