Un approccio semplificato per la proteomica basata sulla spettrometria di massa utilizzando regioni tissutali selezionate

Abbiamo sviluppato un metodo semplificato per lo studio del proteoma in regioni specifiche di campioni di tessuto superiori utilizzando la spettrometria di massa. Il nostro obiettivo è quello di migliorare la tecnica proteomica, compresa la preparazione del campione e l'analisi della spettrometria di massa, per ottenere un'elevata precisione e affidabilità. Una sfida nella proteomica spaziale basata su FFPE è la digestione incompleta delle proteine, che riduce la copertura proteica complessiva.

Per superare questi problemi sono necessari protocolli di digestione ottimizzati e strategie di spettrometria di massa avanzate per migliorare la profondità e l'accuratezza del proteoma. Abbiamo identificato alterazioni proteiche distinte in diversi tipi di malattia pancreatica, fornendo informazioni sulle differenze tra condizioni benigne e precancerose. Questi risultati potrebbero aiutare nella diagnosi precoce del cancro al pancreas.

Il nostro obiettivo è quello di far progredire il metodo della proteinasi del paziente per ottenere una mappatura delle proteine ad alta risoluzione all'interno delle regioni tissutali. Utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa, cerchiamo di identificare le firme molecolari specifiche della regione che contribuiscono alla scoperta dei biomarcatori. Il nostro approccio integra gli orpelli del paziente e la pre-preparazione con la spettrometria di massa occasionale indipendente dai dati per generare rapidamente dati proteomici di alta qualità da regioni tissutali FFPE selezionate.

Questo metodo consente una grande quantificazione del proteoma spaziale. Per iniziare, preparare un vetrino di tessuto colorato con ematossilina ed eosina o colorato con immunoistochimica con la regione di interesse indicata da un patologo. Posizionare il vetrino in tessuto non colorato e il vetrino in tessuto colorato schiena contro schiena, assicurandosi che si allinei correttamente.

Usando un bisturi, rimuovere le regioni di tessuto che non sono di interesse e raschiare le regioni di tessuto di interesse verso il centro del vetrino. Trasferire il tessuto raccolto in una provetta pulita da 1,5 millilitri a basso contenuto proteico e aggiungere 180 microlitri di tampone di lisi SDS a ciascuna provetta. Eseguire la sonicazione della sonda al 20% di ampiezza per 10 cicli di cinque secondi di accensione e cinque secondi di spegnimento.

Ora, incubare i campioni a 100 gradi Celsius per 3,5 ore mantenendo una velocità di 1.000 G.Dopo l'incubazione, lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, centrifugare a 16.000 G per 10 minuti a temperatura ambiente per separare i detriti tissutali dal surnatante. Raccogliere il surnatante in un tubo pulito ed etichettato e conservare a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.

Per la precipitazione dell'acetone, posizionare il campione proteico corrispondente a 100-300 microgrammi in una provetta compatibile con acetone. Quindi, aggiungere acetone ghiacciato, pre-raffreddato a meno 20 gradi Celsius, in un volume cinque volte superiore al volume del campione. Incubare la miscela a meno 20 gradi Celsius per 18 ore.

Dopo l'incubazione, centrifugare la provetta a 16.000 G per 15 minuti. Smaltire con cura il surnatante senza disturbare il pellet proteico. Aggiungere 500 microlitri di acetone temperato a meno 20 gradi Celsius e centrifugare.

Dopo aver travasato il surnatante, asciugare il campione all'aria. Preparare il tampone di lisi per l'intrappolamento delle sospensioni in acqua deionizzata. Quindi, aggiungere 40 microlitri del tampone preparato alla provetta del campione e agitare accuratamente per sciogliere il pellet proteico essiccato all'aria.

Posizionare il campione in un incubatore agitatore a 100 gradi Celsius a 1.000 G per 35 minuti. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di reagente alchilante al campione e incubare il campione a temperatura ambiente a 300 G per un'ora. All'interno di una cappa chimica, aggiungere cinque microlitri di acido tricloroacetico al 10% al campione, portando il volume totale a 55 microlitri.

Controllare il pH del campione utilizzando carta pH per assicurarsi che sia inferiore a uno. Successivamente, aggiungere 350 microlitri di tampone legante uno al campione per intrappolare le proteine. Posizionare la colonna di intrappolamento della sospensione in una provetta da due millilitri e trasferire l'intero campione, compreso l'eventuale materiale insolubile, nella colonna.

Centrifugare la colonna a 4.000 G per 50 secondi per intrappolare le proteine. Quindi, aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio due. Dopo la centrifugazione, scartare il flusso.

Dopo il lavaggio finale, centrifugare la colonna a 4.000 G per 1,25 minuti per garantire il passaggio completo del tampone uno. Aggiungere 125 microlitri di tampone di digestione alla colonna di intrappolamento della sospensione e tapparla per evitare l'evaporazione. Incubare il campione a 37 gradi Celsius per 18 ore senza agitare.

A questo punto, aggiungere 80 microlitri di tampone di eluizione uno alla colonna di intrappolamento della sospensione e centrifugare a 4.000 G per 1,25 minuti. Estrarre i peptidi eluiti e trasferirli in una nuova provetta pulita. Dopo la quantificazione dei peptidi, liofilizzare 20 microgrammi di peptidi.

Risciogliere i peptidi liofilizzati in 40 microlitri di tampone acquoso contenente il 3% di acetonitrile in acqua di acido formico allo 0,1% e sonicare per 10 minuti in un bagno di sonicazione. Centrifugare il campione a 16.000 G per 60 minuti e trasferire il surnatante in fiale per l'analisi di spettrometria di massa. Iniettare due microlitri di ciascun campione utilizzando l'autocampionatore del sistema di spettrometria di massa per cromatografia nanoliquida.

Separare i peptidi su una colonna a fase inversa impacchettata con tre micrometri di materiale C18 utilizzando un gradiente di 127 minuti da cinque a 35% di acetonitrile a 100 nanolitri al minuto. Ionizzare i peptidi tramite una sorgente ionica nanospray e trasferirli in uno spettrometro di massa basato su Orbitrap. Analizza i peptidi utilizzando un metodo di acquisizione indipendente dai dati a intervalli ristretti.

L'isolamento preciso della regione di interesse durante il processamento del tessuto FFPE è stato ottenuto in diversi tessuti pancreatici fissati in formalina cistica e inclusi in paraffina. I cromatogrammi ionici totali riproducibili sono stati ottenuti tra trireplicati biologici per ogni tipo di neoplasia cistica pancreatica. L'analisi della spettrometria di massa con cromatografia liquida ha identificato 9.703 proteine.

L'abbondanza di tutte le proteine identificate si estendeva su 6,25 ordini di grandezza, dimostrando una copertura completa del proteoma, e sono stati quantificati i marcatori proteici noti del cancro al pancreas. Sono state identificate un totale di 933 proteine differenzialmente espresse, di cui 457 sovraregolate e 476 sottoregolate nelle neoplasie mucinose papillari intraduttali. L'analisi bioinformatica ha rivelato che le proteine differenzialmente espresse erano associate a diversi percorsi correlati al cancro del pancreas.