Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

Poiché Thermobia domestica è un insetto basale, gli studi genetici su questa specie illumineranno i meccanismi alla base dell'evoluzione di innovazioni chiave negli insetti, come il volo motorizzato e le metamorfosi. Questo protocollo copre le tecniche di base, dal mantenimento della coltura alla microiniezione di uova per implementare Thermobia come specie modello di laboratorio. Questo metodo può essere utilizzato anche per l'applicazione di altri strumenti genetici come il knockdown genico mediato da RNI e la transgenesi nella termobia.

Mantieni le popolazioni selvatiche e mutanti in un grande contenitore di plastica con normale cibo artificiale per pesci, acqua in bicchieri di plastica con un foro di ventilazione sulla parte superiore, una carta piegata per nascondere gli insetti e cotone a strati per deporre le uova. Conserva tutte le colture di T.domestica all'interno di incubatrici a 37 gradi Celsius e imposta l'umidità relativa all'interno di ciascun contenitore dal 60 all'80%Per preparare le colonie di raccolta delle uova, trasferisci circa 20 maschi e 20 femmine adulte in un contenitore di medie dimensioni con cibo, una scorta d'acqua, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone a strati per la deposizione delle uova. Imposta diverse colonie per ottenere un gran numero di embrioni in fasi in un breve periodo di tempo.

Il giorno dell'iniezione sostituire il cotone all'interno dei contenitori con cotone nuovo. Otto ore dopo, raccogli le uova dal cotone stratificato separando gli strati con una pinza. Allinea le uova sul nastro biadesivo usando un pennello bagnato mantenendo una distanza di due millimetri tra le uova.

Tutti gli ovuli devono essere orientati in modo che l'asse longitudinale di un uovo sia rivolto verso il lato di iniezione. Premere delicatamente le uova con un pennello per tenerle saldamente durante l'iniezione. Caricare due microlitri della soluzione di gRNA CAS9 in un capillare di iniezione in vetro con un micro caricatore.

Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella soluzione prima dell'iniezione. Se necessario, picchiettare l'ago per rimuovere le bolle. Ottimizza la forma della punta dell'ago rompendola leggermente con una pinza per evitare l'intasamento e ottenere una migliore durata durante una serie di iniezioni.

Inserire l'ago nel punto medio dell'asse longitudinale di un uovo e iniettare una piccola quantità di soluzione. Regolare la configurazione del micro iniettore elettronico durante l'iniezione, a seconda della forma della punta dell'ago. Conservare le uova iniettate in un contenitore di dimensioni adeguate con un'umidità relativa del 60-80% a 37 gradi Celsius.

Controllare periodicamente gli ovuli iniettati e scartare gli ovuli danneggiati per evitare la crescita di funghi. Se su un uovo crescono troppi funghi, pulire la superficie dell'uovo con etanolo al 70%. Prima della schiusa, immergere il vetrino con le uova iniettate nel borotalco per rivestire la superficie del nastro biadesivo.

Ciò impedirà l'accatastamento delle ninfe schiuse. Trasferisci i vetrini di vetro verniciato a polvere in un contenitore di medie dimensioni con cibo, acqua e carta piegata. Isolare le ninfe G1 in piastre a 24 pozzetti con un aspiratore o un pennello.

Mantenere la fornitura di cibo artificiale regolare per pesci. Posizionare le piastre a 24 pozzetti in un contenitore più grande con una riserva d'acqua per un'umidità compresa tra il 60 e l'80%Pizzicare ed estrarre un cercus da una ninfa o da un adulto usando una pinza e raccoglierli in una provetta da 0,2 millilitri contenente 50 microlitri di etanolo. Conservare i campioni raccolti a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.

Posizionare le provette del campione con i coperchi aperti su un blocco termico per 15 minuti a 70 gradi Celsius per far evaporare l'etanolo. L'iniezione del complesso ribonucleoproteico gRNA CAS9 negli embrioni entro le prime otto ore dopo la deposizione delle uova provoca indels nel sito bersaglio del gRNA. Ciò provoca mutazioni bialleliche in alcune cellule della generazione iniettata e di solito si ottengono fenotipi a mosaico mutante.

Quando questo protocollo è stato utilizzato per iniettare un gRNA progettato per colpire il gene bianco, il 32,6% delle ninfe G0 ha mostrato una parziale perdita di pigmentazione nei loro occhi composti e nelle regioni dorsali. La valutazione della trasformazione germinale degli adulti G0 e degli individui G1 mutati è stata effettuata mediante PCR genomica seguita da un saggio di mobilità etero duplex. Nei campioni G1, i pattern di bande differenziali tra campioni wild type e mutati sono chiaramente distinguibili.

L'editing del genoma in Thermobia fornisce un solido approccio per analizzare i meccanismi genetici alla base dei tratti prematuri degli insetti. Aiuta a esplorare i segreti dietro il loro eccezionale successo e il nostro.