Name: Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per lediting genomico nella Termbia domestica Firebrat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Impara la microiniezione delle uova per l'editing genomico in Thermobia domestica. Questo protocollo dettagliato facilita la generazione e il mantenimento di ceppi mutanti per studi evolutivi sugli insetti.

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TO e TD sono stati supportati rispettivamente dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999.

1. Mantenimento delle colonie di laboratorio
<ol><li>Per il mantenimento di popolazioni di wildtype e mutanti, utilizzare un grande contenitore di plastica (460 mm x 360 mm x 170 mm) con cibo di pesce artificiale regolare, acqua in tazze di plastica con un foro di ventilazione sulla parte superiore, una carta piegata per nascondere gli insetti e cotone stratificato per la deposizione delle uova(Figura 2A). Mantenere tutte le colture T. domestica all'interno di incubatori a 37 °C e impostare l'umidità relativa (RH) all'interno di ciascun contenitore sul 60%-80%. NOTA: Poiché T. domestica assorbe il vapore acqueo dall'atmosfera11, non è necessario un approvvigionamento idrico diretto. L'rh appropriato viene mantenuto a causa della presenza di vapore acqueo da tazze di plastica contenenti un foro di ventilazione sulla parte superiore o da tazze senza coperchio all'interno di ogni contenitore. Non è necessario umidificare all'interno di un intero incubatore che contiene colture. La durata approssimativa di ogni fase di sviluppo alle condizioni descritte nel presente protocollo è illustrata nella figura 1. La velocità di sviluppo potrebbe essere regolata modificando la temperatura e/o RH12.</li>
	<li>Aggiungere periodicamente del cibo. Aggiungere acqua prima che si aserti.</li>
	<li>Trasferire le popolazioni in un nuovo contenitore pulito almeno ogni 3 mesi, dato che gli adulti smettono di deporre le uova in un ambiente sporco e/o in una popolazione densa (cfr. discussione).</li>
</ol>2. Raccolta delle uova e microiniezione
<ol><li>Progettare un RNA guida (gRNA)<ol>
<li>Progettare una sequenza di gRNA per ogni bersaglio richiesto e FAR ESPLODERE le sequenze di gRNA rispetto all'assemblaggio del genoma per controllare possibili siti di riconoscimento fuori bersaglio.</li>
		<li>Sintetizzare e purificare i gRNA secondo le istruzioni del produttore8. NOTA: Ad esempio, nel caso del gene bianco del trasportatore di cassette legante ATP, è stata progettata una sequenza target di 20 bp e sono stati ordinati due oligonucleotidi del DNA sintetizzati 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' e 5'-TTCTAGCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3'. Il modello di DNA è stato preparato ricotturando questi due oligonucleotidi seguiti dall'amplificazione PCR e il gRNA viene quindi trascritto in vitro dal modello con una T7 RNA polimerasi.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare colonie di raccolta delle uova<ol>
<li>Trasferire circa 20 adulti maschi e 20 femmine in un contenitore di medie dimensioni (200 mm x 150 mm x 90 mm) con cibo, approvvigionamento idrico, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone stratificato per la deposizione delle uova(Figura 2B).</li>
		<li>Creare diverse colonie per ottenere un gran numero di embrioni messi in scena in un breve periodo di tempo da utilizzare per l'editing del genoma. NOTA: Si prevede che circa 20-40 uova saranno raccolte da una colonia dopo 8 ore a 37 °C. Di solito ci vogliono alcuni giorni perché gli adulti trasferiti inizino a deporre le uova, probabilmente a causa dell'adattamento a un nuovo ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Il giorno dell'iniezione, sostituire il cotone all'interno dei contenitori con quelli nuovi.</li>
	<li>Posizionare un nastro 76 mm x 5 mm su un normale scivolo di vetro da 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Otto ore dopo, raccogli le uova dal cotone stratificato separando gli strati usando le forcep.</li>
	<li>Allineare le uova sul nastro a doppia parte utilizzando un pennello bagnato e mantenere una distanza di 2 mm tra le uova. Tutte le uova devono essere orientate in modo che l'asse longitudinale di un uovo sia fronte al lato dell'iniezione(figura 3A). Premere delicatamente le uova con un pennello per una tenuta ferma durante l'iniezione. NOTA: In questo protocollo, il fungo cresce velocemente nelle uova iniettate danneggiate in condizioni umide e calde. È importante mantenere la distanza tra le uova per prevenire la contaminazione incrociata e l'espansione del fungo.</li>
	<li>Mescolare la proteina gRNA e Cas9 con una concentrazione finale rispettivamente di 100 ng/μL e 500 ng/μL. Utilizzare acqua distillata per la diluizione. Incubare il mix per 10 minuti a temperatura ambiente per promuovere la formazione complessa di ribonucleoproteina e quindi mantenere il mix sul ghiaccio. NOTA: Il rosso neutro a una concentrazione finale dell'1% potrebbe essere aggiunto alla soluzione di iniezione per monitorare la quantità iniettata.</li>
	<li>Caricare 2 μL della soluzione gRNA/Cas9 in un capillare di iniezione di vetro con un microloader. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella soluzione prima dell'iniezione. Se necessario, toccare l'ago per rimuovere le bolle. NOTA: In questo esperimento viene utilizzato un ago già pronto per ottenere una punta dell'ago fine (Figura 3B). Un ago fatto in casa con una forma simile potrebbe invece essere usato.</li>
	<li>Fissare il capillare di iniezione di vetro, precedentemente caricato con la soluzione gRNA/Cas9, a un supporto dotato di manipolatore e collegare il supporto a un microiniettore elettronico.</li>
	<li>Ottimizzare la forma della punta dell'ago rompendola leggermente con pini per evitare l'intasamento e ottenere una migliore durata durante una serie di iniezioni (un esempio di ago appropriato è mostrato nella figura 3C). NOTA: Si consiglia di cambiare un ago quando è intasato. È possibile continuare a iniettare con lo stesso ago se viene rotto di nuovo con pini, ma una punta più ampia porta a più danni alle uova e abbassa il loro tasso di sopravvivenza. Poiché le uova T. domestica sono morbide e fragili, mantenere una punta dell'ago fine è la chiave per avere un alto tasso di sopravvivenza dopo l'iniezione.</li>
	<li>Inserire l'ago nel punto centrale dell'asse longitudinale di un uovo e iniettare una leggera quantità della soluzione (vedere figura 3D-H per riferimento sulla quantità di iniezione). Regolare la configurazione del microiniettore elettronico durante l'iniezione, a seconda della forma della punta dell'ago. NOTA: Si consiglia di applicare una pressione costante durante l'iniezione, altrimenti il contenuto di uova appiccicoso può facilmente fluire nell'ago di vetro e può ostruirlo. La soluzione può essere iniettare un impulso di pressione breve o con una pressione costante, a seconda della quantità di liquido iniettato. Tenere presente che quando una punta dell'ago ha un'ampia apertura, inietta troppa soluzione in un uovo, il che causa letalità (Figura 3F-H). In tal caso, mantenere un flusso liquido costante a pressione costante, quindi inserire l'ago in un uovo ed estrarlo immediatamente. Se provoca troppo overflow o l'uovo esplode, cambiare l'ago.</li>
	<li>Conservare le uova iniettate in un contenitore con le dimensioni appropriate per il numero di uova iniettate (<20 uova: piccolo piatto; >20 uova: contenitore di medie dimensioni) con 60%-80% RH e 37 °C.</li>
</ol>3. Accoppiamento
<ol><li>Controllare periodicamente le uova iniettate e scartare le uova danneggiate con forcep per evitare la crescita fungina(Figura 3I,J). Nel caso in cui troppo fungo cresce su un uovo, pulire la superficie dell'uovo con il 70% di EtOH.</li>
	<li>Prima della schiusa (circa 10 giorni a 37 °C dopo la deposizione delle uova), immergere lo scivolo di vetro con le uova iniettate in polvere di talco per rivestire la superficie del nastro a doppia mano. Ciò eviterà l'impilamento di ninfe tratteggiate. Trasferisci i vetri rivestiti di polvere in un contenitore di medie dimensioni con cibo, acqua e una carta piegata per nascondere gli insetti.</li>
	<li>Rimuovere gli scivoli di vetro dopo che le ninfe si sono schiuse. Fornire periodicamente cibo fino a raggiungere l'età adulta. NOTA: Ci vogliono circa 2,0-2,5 mesi perché gli individui raggiungano l'età adulta dopo la schiusa (Figura 1A). Lo stadio adulto è giudicato sulla base di un ovopositore ben sviluppato nelle femmine (Figura 1B).</li>
	<li>Per accoppiare gli individui, trasferire tutte le adulti femmine di tipo selvatico necessarie da una colonia di laboratorio al contenitore di medie dimensioni e incubarle per almeno 14 giorni a 37 °C per assicurarsi che siano vergini. NOTA: Non è necessario raccogliere femmine vergini da una colonia di laboratorio perché l'adulto T. domestica ha un ciclo ripetuto di muta e accoppiamento chiamato "ciclo riproduttivo e muta", durante il quale le femmine gettano via lo sperma con ogni muta e si accoppiano di nuovo nel prossimo ciclo di fecondazione13.</li>
	<li>Trasferire un maschio o una femmina G0 adulto che si è sviluppato da un uovo iniettato e adulto di tipo selvatico a un piccolo piatto di plastica (Ø 100 mm x 40 mm) con cibo, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone per la deposizione delle uova G1(Figura 2C'; piatto di accoppiamento). Conservare i piatti di accoppiamento in un contenitore più grande con 60%-80% RH (Figura 2C). NOTA: Più adulti di tipo selvatico possono essere inclusi in un piatto per aumentare le possibilità di accoppiamento di successo, anche se sono stati raggiunti alti tassi di successo con l'accoppiamento uno a uno.</li>
</ol>4. Genotipizzazione
<ol><li>Progetta coppie di primer PCR per ogni gRNA per amplificare un prodotto da 100 a 200 bp che include il sito preso di mira dal gRNA. BLAST ogni sequenza di primer rispetto all'assemblaggio del genoma per verificarne la specificità (un esempio è mostrato per il targeting del gene bianco nella figura 4A).</li>
	<li>Controlla la trasformazione germinale degli adulti G0.<ol>
<li>Cinque giorni dopo la deposizione delle uova, raccogliere singole uova G1 da ogni coppia adulta G0 in tubi da 0,2 ml (un uovo per tubo; conservare campioni raccolti a -20 °C per una conservazione a lungo termine). Separare gli strati di cotone per raccogliere le uova. NOTA: Si consiglia di genotipare almeno 12 ninfe G1 da ogni coppia di accoppiamenti per valutare il successo della trasmissione della linea germinale (vedi Risultati rappresentativi).</li>
		<li>Aggiungere 15 μL di una soluzione di Proteinasi K da 0,25 mg/mL (sciolta nel tampone Tris-EDTA) a ciascun tubo, omogeneizzare brevemente i campioni con stuzzicadenti e incubare a 55 °C per 3-16 ore.</li>
		<li>Inattivare la Proteinasi K posizionando i campioni a 95 °C per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere 90 μL di acqua distillata ad ogni tubo e mescolare bene. Utilizzare 2 μL di supernatante in una miscela di reazione PCR da 10 μL contenente i primer progettati nella fase 4.1. NOTA: Si consiglia l'uso di una DNA polimerasi ottimizzata per i modelli grezzi per raggiungere un'amplificazione PCR sufficiente.</li>
		<li>Per analizzare i prodotti PCR, eseguire un saggio di mobilità eteroduplex (HMA) con un sistema di elettroforesi a microchip(Figura 3B;vedi Ohde et al., 2018)8. NOTA: Le mutazioni potrebbero essere valutate con due metodi alternativi: (1) HMA con polimeri gel standard, come l'8% di poliacrilammide14; (2) digestione di prodotti PCR con endonucleasi T7 seguita da elettroforesi del gel di agarosio15.</li>
		<li>Conservare solo le ninfe G1 risultanti da adulti G0 che contengono mutazioni nella loro linea germinale e scartare le altre.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipizzazione individuale di ninfe/adulti G1<ol>
<li>Isolare le ninfe G1 in piastre da 24 po 'con un aspiratore o un pennello. Posizionare le piastre a 24 pomp poggiamenti in un contenitore più grande (ad esempio, il contenitore di medie dimensioni utilizzato in questo protocollo) con l'approvvigionamento idrico come descritto sopra per mantenere un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantenere l'approvvigionamento di alimenti artificiali regolari a base dipesce (figura 1D'). NOTA: Sebbene questo passaggio possa essere eseguito in qualsiasi punto delle fasi ninfee e adulte, si consiglia di eseguito dopo aver raggiunto l'età adulta e poco prima dell'accoppiamento (>2,5 mesi dopo l'iniezione; Figura 1B) perché è più facile mantenere i vigili del fuoco in un grande contenitore. L'allevamento individuale è necessario per tracciare il genotipo di ogni ninfa G1 nei seguenti passaggi. Le ninfe G1 dello stesso adulto G0 possono avere mutazioni diverse.</li>
		<li>Pizzicare e estrarre i cerci e il filamento caudale da una ninfa/adulto usando le flesse e raccoglierli in un tubo da 0,2 ml contenente 50 μL EtOH (conservare i campioni raccolti a -20 °C per una conservazione a lungo termine). NOTA: I campioni di tessuto vengono raccolti in EtOH perché prevengono la perdita di questi piccoli campioni a causa dell'elettricità statica. Se è necessario fermare il movimento degli insetti, anestetizzare la ninfa / adulto sul ghiaccio quando si preleva campioni di tessuto. Poiché T. domestica non può sopravvivere dopo il raffreddamento a lungo termine sul ghiaccio, non anestetizzarli per più di un minuto e spostarli immediatamente a temperatura ambiente. L'ablazione dei cerci e del filamento caudale non causa alcun aumento della mortalità.</li>
		<li>Posizionare i tubi campione con i coperchi aperti su un blocco termico per 15 minuti a 70 °C per evaporare l'EtOH.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 4.2.2 a 4.2.5 per genotipizzazione.</li>
		<li>Inviare i prodotti PCR in cui si osserva un modello di banda mutante a un servizio di sequenziamento Sanger standard.</li>
		<li>Mantenere le ninfe/adulti G1 con le mutazioni desiderate e scartare le altre (vedere la figura 4C per un risultato di sequenziamento rappresentativo).</li>
	</ol></li>
	<li>Attraversa gli adulti contenenti le mutazioni desiderate in un piatto di accoppiamento e ottieni le generazioni successive per stabilire un ceppo mutante omozigoto.</li>
</ol>

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<li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+ecology+of+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+%28Packard%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Monographs%22%5BJournal%5D)">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li>
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<li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li>
<li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+notes+upon+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+Packard%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+New+York+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per la generazione di successo del mutante T. domestica desiderato con CRISPR / Cas9, è prima importante raccogliere un numero sufficiente di embrioni messi in scena per l'iniezione. Per una raccolta costante di un numero sufficiente di uova T. domestica, la chiave è selezionare una dimensione appropriata del contenitore per avere una densità di popolazione inferiore perché aiuterebbe il completamento di una serie di complessi comportamenti di accoppiamento, che viene ripetuto dopo ogni muta adulta<sup ...

Thermobia domestica appartiene a uno degli ordini di insetti più basali, Zygentoma, che conserva un ciclo di vita ancestrale ametabolico e senza ali. Tale posizione filogenetica basale e caratteristiche ancestrali hanno fissato questa specie come un modello attraente per studiare i meccanismi alla base del successo degli insetti sulla Terra, che coprono oltre il 70% della specie animaledescritta 1. T. domestica è stato a lungo utilizzato principalmente per studiare le caratteristiche ancestrali della fisiologia degli insetti a causa delle sue caratteristiche adatte come modello di laboratorio, come un ciclo di vita relativamente breve (2,5-3,0 mesi dall'embrione all'adulto riproduttivo; Figura 1A) e un allevamento facile. Negli ultimi tre decenni, il suo uso è stato ampliato per indagare le caratteristiche ancestrali di vari tratti come la pianta corporea, la differenziazione neurale e i ritmicircadiani 2,3,4.
L'applicazione di strumenti genetici avanzati in T. domestica potrebbe accelerare ulteriormente tali contributi in un'ampia area di ricerca. Il successo dell'interferenza dell'RNA (RNAi) mediato dal gene in embrioni, ninfe e adulti è stato riportato in T. domestica4,5,6. L'efficienza della RNAi sistemica è ancora altamente dipendente dalle specie, ad esempio è generalmente elevata nei coleotteri mentre è bassa nell'ordine dei lepidotteri7. L'efficienza e la durata del knockdown RNAi in T. domestica devono ancora essere valutate. Oltre a RNAi, abbiamo precedentemente segnalato un knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 di successo in T. domestica8. Il sistema CRISPR/Cas è stato ampiamente applicato per l'editing del genoma negli insetti, in particolare per il knockout genico mirato. Il suo uso potrebbe essere ampliato per altre applicazioni come il test gene reporter, il tracciamento del lignaggio cellulare e la manipolazione dell'attività trascrizionale bussando a costrutti esogeni dopo l'istituzione di un protocollo per la consegna di componenti del sistema CRISPR / Cas nei nuclei9. In combinazione con l'assemblaggio del genomapubblicato 10, l'ampio utilizzo e l'ulteriore sviluppo dell'editing del genoma basato su CRISPR /Cas in T. domestica faciliterebbero gli studi incentrati sui meccanismi evolutivi alla base dell'eccezionale successo adattivo degli insetti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la microiniezione embrionale e per l'accoppiamento di T. domestica adulto per generare un ceppo mutante utilizzando CRISPR / Cas9. Considerando questo nuovo metodo, discutiamo l'importanza di considerare la biologia unica delle specie modello non tradizionali per applicazioni di successo di queste tecniche.

<table><tbody><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi V3, 100 &; g</td><td></td><td>Detergente antistatico integrato DNA Technologies</td> 1081060 <td></td></tr><tr><td></td><td>Hozan</td><td>Z-292</td><td>per la rimozione dell'elettricità statica da una piastra a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>Barrier Box 20.7L</td><td>AS ONE</td><td>4-5606-01</td><td>Contenitore grande</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Microiniettore elettronico</td></tr><tr><td>Femtotip II, capillare di iniezione</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Capillare per iniezione di vetro</td></tr><tr><td>High Pack 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Incubatore per contenitori di medie dimensioni</td></tr><tr><td></td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>per 37 &deg; C incubazione. Non c'è bisogno di umidificare all'interno dell'incubatrice.</td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>Enzima PCR per la genotipizzazione. Ottimizzato per un'amplificazione da modelli grezzi.</td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td>per contenere il micromanipolatore</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>per microiniezione. Un ingrandimento superiore a 35X è sufficiente per la microiniezione</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Sistema di elettroforesi a microchip</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Nastro biadesivo per posizionare le uova su un vetrino</td></tr><tr><td>Pennello (crine di cavallo)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura vegetale</td><td>SPL Life Sciences</td><td>310100</td><td>Piatto di accoppiamento e forniture d'acqua per contenitori di grandi e medie dimensioni</td></tr><tr><td>Proteinasi K, ricombinante, grado PCR Liofilizzato da Pichia pastoris</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio SZX 12</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td> Un <td>ingrandimento superiore a 35X è sufficiente per la microiniezione</td></tr><tr><td>Talco</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold</td><td>Growth Spectrum Brands</td><td></td><td>Mangime artificiale regolare per pesci</td></tr></tbody></table>

microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella termbia domestica firebrat

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Il firebrat Thermobia domestica è una specie ametabolica e senza ali adatta allo studio dei meccanismi di sviluppo degli insetti che hanno portato alla loro riuscita radiazione evolutiva sulla terra. L'applicazione di strumenti genetici come l'editing del genoma è la chiave per comprendere i cambiamenti genetici che sono responsabili delle transizioni evolutive in un approccio Evo-Devo. In questo articolo, descriviamo il nostro attuale protocollo per la generazione e la manutenzione di ceppi mutanti di T. domestica. Riportiamo un metodo di iniezione secca, in alternativa al metodo di iniezione umida riportato, che ci consente di ottenere tassi di sopravvivenza stabilmente elevati negli embrioni iniettati. Reportiamo anche un ambiente ottimizzato per accoppiare gli adulti e ottenere le generazioni successive con alta efficienza. Il nostro metodo sottolinea l'importanza di tenere conto della biologia unica di ciascuna specie per il successo dell'applicazione dei metodi di modifica del genoma agli organismi modello non tradizionali. Prevediamo che questi protocolli di editing del genoma aiuteranno nell'implementazione di T. domestica come modello di laboratorio e accelereranno ulteriormente lo sviluppo e l'applicazione di strumenti genetici utili in questa specie.

Nelle nostre mani, circa 100 uova possono essere ben iniettate con un singolo capillare di iniezione quando ha la punta adeguata(Figura 3C). L'iniezione di gRNA/Cas9 complesso di ribonucleoproteina negli embrioni entro le prime 8 ore dopo la deposizione delle uova provoca indeli nel sito mirato al gRNA. Ciò causa mutazioni bialleliche in alcune cellule della generazione iniettata (G0) e quindi i fenotipi di mosaico mutante sono solitamente ottenuti in G0. Ad esempio, quando questo protocollo...

Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Poiché Thermobia domestica è un insetto basale, gli studi genetici su questa specie illumineranno i meccanismi alla base dell'evoluzione di innovazioni chiave negli insetti, come il volo motorizzato e le metamorfosi. Questo protocollo copre le tecniche di base, dal mantenimento della coltura alla microiniezione di uova per implementare Thermobia come specie modello di laboratorio. Questo metodo può essere utilizzato anche per l'applicazione di altri strumenti genetici come il knockdown genico mediato da RNI e la transgenesi nella termobia.Mantieni le popolazioni selvatiche e mutanti in un grande contenitore di plastica con normale cibo artificiale per pesci, acqua in bicchieri di plastica con un foro di ventilazione sulla parte superiore, una carta piegata per nascondere gli insetti e cotone a strati per deporre le uova. Conserva tutte le colture di T.domestica all'interno di incubatrici a 37 gradi Celsius e imposta l'umidità relativa all'interno di ciascun contenitore dal 60 all'80%Per preparare le colonie di raccolta delle uova, trasferisci circa 20 maschi e 20 femmine adulte in un contenitore di medie dimensioni con cibo, una scorta d'acqua, una carta piegata e un piccolo pezzo di cotone a strati per la deposizione delle uova. Imposta diverse colonie per ottenere un gran numero di embrioni in fasi in un breve periodo di tempo.Il giorno dell'iniezione sostituire il cotone all'interno dei contenitori con cotone nuovo. Otto ore dopo, raccogli le uova dal cotone stratificato separando gli strati con una pinza. Allinea le uova sul nastro biadesivo usando un pennello bagnato mantenendo una distanza di due millimetri tra le uova.Tutti gli ovuli devono essere orientati in modo che l'asse longitudinale di un uovo sia rivolto verso il lato di iniezione. Premere delicatamente le uova con un pennello per tenerle saldamente durante l'iniezione. Caricare due microlitri della soluzione di gRNA CAS9 in un capillare di iniezione in vetro con un micro caricatore.Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella soluzione prima dell'iniezione. Se necessario, picchiettare l'ago per rimuovere le bolle. Ottimizza la forma della punta dell'ago rompendola leggermente con una pinza per evitare l'intasamento e ottenere una migliore durata durante una serie di iniezioni.Inserire l'ago nel punto medio dell'asse longitudinale di un uovo e iniettare una piccola quantità di soluzione. Regolare la configurazione del micro iniettore elettronico durante l'iniezione, a seconda della forma della punta dell'ago. Conservare le uova iniettate in un contenitore di dimensioni adeguate con un'umidità relativa del 60-80% a 37 gradi Celsius.Controllare periodicamente gli ovuli iniettati e scartare gli ovuli danneggiati per evitare la crescita di funghi. Se su un uovo crescono troppi funghi, pulire la superficie dell'uovo con etanolo al 70%. Prima della schiusa, immergere il vetrino con le uova iniettate nel borotalco per rivestire la superficie del nastro biadesivo.Ciò impedirà l'accatastamento delle ninfe schiuse. Trasferisci i vetrini di vetro verniciato a polvere in un contenitore di medie dimensioni con cibo, acqua e carta piegata. Isolare le ninfe G1 in piastre a 24 pozzetti con un aspiratore o un pennello.Mantenere la fornitura di cibo artificiale regolare per pesci. Posizionare le piastre a 24 pozzetti in un contenitore più grande con una riserva d'acqua per un'umidità compresa tra il 60 e l'80%Pizzicare ed estrarre un cercus da una ninfa o da un adulto usando una pinza e raccoglierli in una provetta da 0,2 millilitri contenente 50 microlitri di etanolo. Conservare i campioni raccolti a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.Posizionare le provette del campione con i coperchi aperti su un blocco termico per 15 minuti a 70 gradi Celsius per far evaporare l'etanolo. L'iniezione del complesso ribonucleoproteico gRNA CAS9 negli embrioni entro le prime otto ore dopo la deposizione delle uova provoca indels nel sito bersaglio del gRNA. Ciò provoca mutazioni bialleliche in alcune cellule della generazione iniettata e di solito si ottengono fenotipi a mosaico mutante.Quando questo protocollo è stato utilizzato per iniettare un gRNA progettato per colpire il gene bianco, il 32,6% delle ninfe G0 ha mostrato una parziale perdita di pigmentazione nei loro occhi composti e nelle regioni dorsali. La valutazione della trasformazione germinale degli adulti G0 e degli individui G1 mutati è stata effettuata mediante PCR genomica seguita da un saggio di mobilità etero duplex. Nei campioni G1, i pattern di bande differenziali tra campioni wild type e mutati sono chiaramente distinguibili.L'editing del genoma in Thermobia fornisce un solido approccio per analizzare i meccanismi genetici alla base dei tratti prematuri degli insetti. Aiuta a esplorare i segreti dietro il loro eccezionale successo e il nostro.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

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Qui presentiamo un protocollo per iniettare uova di cricket, una tecnica che serve come metodo fondamentale in molti esperimenti nel cricket, tra cui, ma non solo, l'interferenza dell'RNA e la manipolazione genomica.

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Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Questo protocollo descrive le procedure di microiniezione per gli embrioni di Culex quinquefasciatus ottimizzate per funzionare con gli strumenti di editing genetico CRISPR/Cas9. Questa tecnica può generare in modo efficiente mutazioni germinali site-specific, ereditabili, che possono essere utilizzate per costruire tecnologie genetiche in questo vettore di malattia poco studiato.

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Molte caratteristiche dell'eusocialità degli insetti si basano sulla comunicazione all'interno della colonia e sulla divisione del lavoro. La manipolazione genetica dei geni regolatori chiave negli embrioni di formiche tramite microiniezione e mutagenesi mediata da CRISPR fornisce informazioni sulla natura del comportamento altruistico negli insetti eusociali.

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Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

La trasformazione germinale di successo nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda,è stata ottenuta utilizzando l'mRNA della trasposasi iperattiva piggyBac.

Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda

Qui, descriviamo una semplice tecnica destinata alla generazione efficiente di topi geneticamente modificati chiamata CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Questo metodo fornisce reagenti di editing mediante elettroporazione negli embrioni con un'efficienza vicina al 100%. Questo protocollo è efficace per mutazioni puntiformi, piccole inserzioni genomiche e delezioni in embrioni di mammifero.

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Impara la microiniezione delle uova per l'editing genomico in Thermobia domestica. Questo protocollo dettagliato facilita la generazione e il mantenimento di ceppi mutanti per studi evolutivi sugli insetti.

Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

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