Campionamento ed elaborazione della spazzolatura nasale mediante videomicroscopia ciliare digitale ad alta velocità – Adattamento alla pandemia COVID-19

La mancanza di procedure operative formali pubblicate e di standardizzazione impedisce che la videomicroscopia digitale ad alta velocità venga considerata come un test diagnostico di conferma per la discinesia ciliare primaria. Inoltre, per continuare a fornire un servizio diagnostico durante questa crisi COVID-19, il protocollo di videomicroscopia ciliare è stato adattato per includere adeguate misure di controllo delle infezioni. La valutazione funzionale ciliare mediante videomicroscopia digitale ad alta velocità è altamente sensibile e specifica per la diagnosi di discinesia ciliare primaria.

Rispetto ad altri test diagnostici per la discinesia ciliare primaria, la videomicroscopia digitale ad alta velocità è relativamente facile da eseguire, poco costosa e i risultati possono essere disponibili entro il giorno. La videomicroscopia digitale ad alta velocità ha una sensibilità e una specificità più elevate per la diagnosi di discinesia ciliare primaria. Attualmente, solo la microscopia elettronica e i test genetici sono riconosciuti come test di conferma per la discinesia ciliare primaria, ma questi test non rilevano la diagnosi di discinesia ciliare primaria nel 15-30% dei pazienti.

A dimostrare la procedura di spazzolamento nasale sarà Lionel Benchimol, un otorinolaringoiatra del mio laboratorio. Prima di raccogliere il campione nasale, chiedere al paziente di soffiarsi il naso. Dopo aver liberato i passaggi nasali, far sdraiare o sedere comodamente il paziente con la testa appoggiata all'indietro.

Agitare lo spazzolino nel Medium 199 integrato per inumidirlo e posizionare un endoscopio all'ingresso del naso per visualizzare il turbinato nasale inferiore. Inserire lo spazzolino citologico nel naso e muovere lo spazzolino posteriormente e anteriormente più volte sulla parte posteriore del turbinato nasale inferiore prima di ritirarlo. Metti la spazzola in un tubo di M199.

Tagliare il filo in modo che possa entrare completamente all'interno del tubo e chiudere immediatamente il tubo. Quindi, posizionare il campione in un sacchetto doppio ermetico. Entro nove ore dalla raccolta del campione, aprire le provette in una cabina di sicurezza microbiologica e utilizzare la pinza nasale Weil-Blakesley per agitare lo spazzolino per rimuovere le strisce epiteliali raccolte.

Attacca un distanziatore a doppia faccia su un vetrino e rimuovi la protezione dal distanziatore. Agitare delicatamente la provetta per consentire alle ciglia di diffondersi in tutta la provetta e utilizzare una pipetta per trasferire circa 60 microlitri di epitelio ciliato dal centro della provetta al distanziatore. Posizionare un vetrino di copertura rettangolare da 22 x 4 millimetri sul distanziatore per chiudere la camera e disinfettare il vetrino con etanolo al 70% prima di rimuoverlo dalla cabina di sicurezza microbiologica.

Dopo aver cambiato i guanti, posizionare questo vetrino sulla piastra di una scatola riscaldata e chiudere il coperchio. Aggiungere olio all'obiettivo a immersione in olio e posizionare la scatola sul tavolino di un microscopio a luce verticale o invertita. Accendere la scatola e il riscaldatore dell'obiettivo e regolare le impostazioni di temperatura sulla scatola e sui controller del riscaldatore dell'obiettivo.

Dopo cinque minuti, posizionare l'obiettivo fino a toccare appena il vetrino coprioggetto con la punta della lente. Per visualizzare i bordi ciliati respiratori del campione, aprire il software della fotocamera, quindi utilizzare l'obiettivo del microscopio per localizzare manualmente le cellule all'interno del campione e proiettare le cellule sul monitor. Verificare che l'immagine sia visibile sul monitor e regolare la messa a fuoco del condensatore e dell'obiettivo secondo necessità per migliorare la qualità dell'immagine.

Quando le strisce di epitelio ciliato sono state localizzate, selezionare solo bordi epiteliali ciliati intatti e non interrotti che misurano almeno 50 micron di lunghezza. Assicurarsi di utilizzare solo bordi normali o bordi con sporgenze minori per l'analisi funzionale ciliare e di escludere bordi ciliati con sporgenze maggiori e cellule ciliate isolate o singole cellule senza contatto tra loro e qualsiasi altro tipo di cellula. Quando è stato selezionato un buon bordo, utilizzare una frequenza fotogrammi della fotocamera di 500 fotogrammi al secondo per registrare il bordo delle ciglia che battono per circa due secondi.

Dopo aver registrato un minimo di sei bordi buoni in laterale view, rimuovere il vetrino dalla scatola riscaldata e posizionare il vetrino, il vetrino coprioggetto e il distanziatore in un sacchetto ermetico. Quindi, posizionare i guanti e la maschera nella borsa e posizionare la borsa nell'apposito contenitore per rifiuti sanitari pericolosi. Per analizzare la frequenza del battito ciliare, aprire la registrazione in un programma software di analisi video appropriato e dividere i bordi ciliati in circa cinque aree adiacenti di circa 10 micron.

Identifica e visualizza le ciglia o i gruppi di ciglia a un frame rate ridotto e un massimo di due misurazioni della frequenza del battito ciliare per area per ottenere un massimo di 10 misurazioni della frequenza del battito ciliare per bordo. Registra il numero di fotogrammi necessari a un gruppo di ciglia per completare cinque cicli di battito e usa la formula per calcolare la frequenza del battito ciliare. Per determinare la percentuale di ciascun modello di battito ciliare distinto all'interno di un campione, per ogni ciglia o gruppo di ciglia, confrontare il percorso preciso seguito dalle ciglia durante un ciclo di battito completo con il normale modello di battito ciliare osservato nell'analisi digitale al microscopio di videomicroscopia.

Attribuire un modello di battito ciliare distinto, come normale, rigido, immobile, asincrono o discinetico e circolare, a ciascuna ciglia o gruppo di ciglia analizzate. Quindi, calcolare la percentuale di ciascun modello di battito ciliare distinto all'interno di ciascun campione. Il pattern di battito ciliare attribuito al campione è il pattern di battito ciliare predominante osservato.

Qui, osserviamo i risultati dettagliati dell'analisi funzionale ciliare dai campioni di spazzolamento nasale di 14 volontari adulti. Da questi 14 campioni di spazzolamento nasale, sono stati registrati 242 bordi ciliati e 212 hanno soddisfatto i criteri di inclusione definiti per l'analisi. Un totale di 807 misurazioni della frequenza del battito ciliare e valutazioni del pattern del battito ciliare sono state ottenute dalle ciglia o dai gruppi di ciglia analizzati.

L'indice medio di immotilità era simile ai valori precedentemente riportati osservati in volontari sani. Il punteggio di discinesia e la frequenza del battito ciliare erano simili ai valori precedentemente riportati ottenuti selezionando solo bordi normali o bordi con proiezione minore. Quando vengono utilizzati bordi di bassa qualità, vengono segnalate frequenze di battito ciliare più basse e punteggi di discinesia più elevati.

Le cellule del sangue e il muco acquisiti da una spazzolatura troppo robusta possono bloccare il battito delle ciglia libere o nascondere le ciglia all'osservatore. Al contrario, se lo spazzolino non preme saldamente contro il turbinato nasale inferiore, il campione potrebbe non contenere abbastanza strisce epiteliali ciliate di alta qualità. Inoltre, se lo spazzolamento nasale viene eseguito sulla parte anteriore della cavità nasale, si otterranno solo cellule epiteliali non ciliate di transizione.

I due aspetti più importanti del protocollo sono la qualità dello spazzolamento nasale e la scelta di frammenti epiteliali di alta qualità per evitare un risultato completamente positivo o un fallimento della tecnica.