Un metodo generalizzato per determinare la composizione dell'acido fenolico solubile libero e la capacità antiossidante di cereali e legumi

Un metodo generalizzato per determinare la composizione dell'acido fenolico solubile libero e la capacità antiossidante di cereali e legumi. I cereali integrali, compresi cereali e legumi, costituiscono una parte sostanziale delle diete umane. La loro rilevanza nutrizionale per gli esseri umani è stata a lungo riconosciuta.

Tuttavia, più recentemente, sono stati segnalati i loro benefici per la salute protettivi antiossidanti. Gli acidi fenolici presenti negli strati esterni di cereali e nel rivestimento dei semi dei legumi contribuiscono alle proprietà antiossidanti dei cereali integrali. Eliminano i radicali liberi che causano danni ossidativi alle biomolecole.

Le due classi di acidi fenolici presenti nei cereali integrali sono gli acidi idrossibenzoici e gli acidi idrossicinnamici. Questo studio fornisce un metodo semplice per estrarre gli acidi fenolici integrali e determinare la loro capacità antiossidante in vitro. Utilizzare cinque campioni di cereali integrali per questo studio, grano duro, mais giallo, fagiolo di fagiolo dall'occhio nero, soia e fagiolo rosso.

Pesare accuratamente 100 milligrammi del campione di farina integrale direttamente in un tubo micro centrifugo color ambra, con capacità di due millilitri. Il colore scuro del tubo aiuta a prevenire l'esposizione della miscela alla luce. Aggiungere un millilitro di metanolo acquoso all'80% a ciascuno dei tubi contenenti esempi.

Vortice brevemente per mescolare la soluzione di metanolo e il campione. Sonicare i campioni per 60 minuti per estrarre i composti fenolici solubili liberi. Metti un coperchio sopra i campioni per la durata della sonicazione per una maggiore protezione dalla luce.

Dopo la sonicazione, centrifugare le miscele a 20.000 volte G per cinque minuti per sedimentare i residui solidi, lasciando il surnatante in cima. Composti fenolici liberi saranno presenti nel surnatante dopo la centrifugazione. Il surnatante deve essere filtrato prima di essere iniettato nello strumento HPLC.

Per filtrare il surnatante, rimuovere lo stantuffo di una siringa da 3 ml e collegare un filtro a siringa. Il filtro deve avere una dimensione dei pori non superiore a 0,22 micrometri. Pipettare circa 0,4 millilitri del surnatante nella parte superiore della siringa.

Reinserire lo stantuffo e spingere il liquido attraverso il filtro in un flaconcino HPLC contenente un inserto del flaconcino. Una volta che lo strumento è stato impostato per eseguire il metodo delineato nel manoscritto per l'analisi HPLC, caricare le fiale nel carosello per corrispondere all'elenco dei campioni. Ottenere cromatogrammi HPLC a 320 nanometri e 280 nanometri, mostrando picchi distinti che rappresentano diversi composti fenolici.

Utilizzando curve standard appropriate, quantificare gli acidi idrossicinnamici a 320 nanometri poiché hanno una massima assorbanza a questa lunghezza d'onda. Con lo stesso principio, quantificare gli acidi idrossibenzoici a 280 nanometri. Utilizzare Trolox, un analogo solubile in acqua della vitamina E, come standard per stimare la capacità antiossidante in vitro degli estratti di cereali integrali.

Pesare accuratamente un milligrammo di Trolox in un tubo Falcon. Sciogliere con quattro millilitri di metanolo acquoso al 50% per preparare una soluzione madre di un millimolo per litro, che equivale a 1000 micromole per litro. Preparare sei concentrazioni di Trolox che sono 50, 100, 200, 400, 600 e 800 micromole per litro per tracciare curve standard per la stima della capacità di scavenging radicale DPPH e della capacità antiossidante equivalente di Trolox, TEAC.

Allo stesso modo, preparare concentrazioni di Trolox da 6,25, 12,5, 25 e 50 micromole per litro per stimare la capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno, ORAC. Portare il volume totale di ogni concentrazione a 500 microlitri, come mostrato nella tabella uno. Diluire gli estratti del campione con metanolo prima dell'analisi.

Qui, gli estratti di mais giallo e fagiolo sono stati diluiti due volte. Gli estratti di grano e fagioli sono stati diluiti cinque volte, mentre l'estratto di soia è stato diluito 10 volte con metanolo. Pesare 8,23 milligrammi di ABTS in un tubo micro centrifugo ambrato pulito, con capacità di due millilitri.

Quindi, pesare 1,62 milligrammi di persolfato di potassio in un tubo micro centrifugo ambrato pulito, capacità di due millilitri. Sciogliere ciascuna delle sostanze chimiche pesate in un millilitro di acqua distillata mediante vortice. Ciò si traduce in una soluzione ABTS da 16 millimolari e una soluzione di persolfato di potassio a sei millimolari.

Preparare la soluzione madre ABTS mescolando le soluzioni abTS e di persolfato di potassio in volumi uguali. La soluzione cambierà immediatamente in un colore scuro. Lasciare incubare questa miscela al buio per 12-16 ore.

Diluire la soluzione madre ABTS 30 volte con soluzione salina tamponata con fosfato millimolare per formare la soluzione di lavoro ABTS. Per fare ciò, aggiungere 58 millilitri di PBS 200 millimolari a due millilitri della soluzione di lavoro ABTS. La soluzione di lavoro conterrà 0,27 millimolari ABTS e 0,1 millimolare di persolfato di potassio.

Per l'analisi, posizionare 10 microlitri di ciascun estratto diluito in una micropiastra da 96 pozzetti. Aggiungere 190 microlitri di soluzione di lavoro ABTS a ciascun pozzo e incubare per 60 minuti. Misurare l'assorbanza delle miscele di reazione a 750 nanometri in un lettore di micropiastre.

Utilizzare gli standard Trolox in concentrazioni comprese tra 100 e 800 micromole per litro per tracciare una curva di calibrazione. Il test antiossidante DPPH richiede un composto che genera radicali, DPPH. Pesare 1,2 milligrammi di DPPH in un tubo centrifugo vuoto da 15 millilitri di capacità.

Sciogliere il DPPH in metanolo per preparare una soluzione da 60 micromolari. Il test DPPH verifica la capacità degli estratti campione di eliminare i radicali liberi prodotti da DPPH. Aggiungere cinque microlitri di estratto campione nei pozzetti delle micropiastre.

Quindi, aggiungere 195 microlitri di soluzione metanolica DPPH micromolare e incubare per 60 minuti. Misurare l'assorbanza a 515 nanometri. Utilizzare gli standard Trolox per tracciare una curva di calibrazione.

La figura uno mostra la struttura degli acidi idrossibenzoici presenti nei cereali integrali. In questo studio attuale, l'acido vanillico è stato l'unico acido idrossibenzoico identificato. La figura due mostra la struttura degli acidi idrossicinnamici presenti nei cereali integrali.

Nel presente studio, i campioni sono stati identificati acidi p-cumarico, caffeico e ferulico. La tabella due mostra gli acidi fenolici identificati nei campioni. Come accennato in precedenza, l'acido vanillico era l'unico acido idrossibenzoico identificato nei campioni.

È stato identificato solo nell'estratto di fagiolo. L'acido caffeico dell'acido idrossicinnamico è stato identificato solo nel fagiolo, mentre l'acido p-coumerico è stato identificato nel mais giallo, nel fagiolo e nella soia. L'acido ferulico è stato identificato in tutti i campioni ed era l'acido fenolico predominante nei campioni.

La concentrazione totale degli acidi fenolici in ordine dal più grande al meno era nell'ordine soia, fagiolo, mais giallo e fagiolo renale o equivalente, seguito da grano. La terza tabella ha mostrato il contenuto fenolico totale e la capacità antiossidante dei campioni. La capacità antiossidante comprendeva la capacità di scavenging dei radicali DPPH, TEAC, ORAC e la capacità antiossidante totale dei campioni.

La capacità antiossidante totale è la somma dei valori DPPH, TEAC e ORAC. Simile alla tabella due, la soia aveva la più alta capacità antiossidante totale. Tuttavia, invece del fagiolo, era piuttosto il fagiolo renale che aveva la seconda più alta capacità antiossidante totale, sebbene il fagiolo avesse il secondo più alto contenuto totale di acido fenolico.

Questa anomalia è correlata alle strutture dei singoli acidi fenolici e al possibile effetto antagonista dell'acido vanillico dell'acido idrossibenzoico sugli effetti antiossidanti degli acidi idrossicinnamici nel pisello. Questo studio ha concluso che i cereali integrali differiscono nelle loro composizioni di acido fenolico. Tra i cereali integrali studiati, la soia ha la più alta quantità totale di acidi fenolici e, di conseguenza, la più alta capacità antiossidante.