Rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 utilizzando l'imaging fluorescente ad alto rendimento dell'infezione da pseudovirus

Il protocollo qui descritto delinea un metodo rapido ed efficace per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina spike SARS-CoV-2 valutando la capacità dei campioni di siero convalescente di inibire l'infezione da un virus della stomatite vescicolare potenziato con proteina fluorescente verde pseudotipizzato con glicoproteina spike.

Questo metodo fornisce un modo per rispondere a una delle domande più importanti riguardanti i vaccini SARS-coronavirus-2 in fase di sviluppo. Il vaccino è in grado di suscitare una risposta anticorpale neutralizzante? Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita in una struttura di livello due di contenimento.

È anche relativamente veloce e poco costoso, il che lo rende adatto all'analisi di molti campioni contemporaneamente. Dimostrando la procedura di neutralizzazione dell'acido, abbiamo Ricardo Marius, un tecnico senior in laboratorio e Taylor Jamieson, uno studente di dottorato MD. Inizia coltivando cellule Vero E6 in DMEM integrate con il 10% di FBS a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica.

Per passare le cellule, prima lavarle aggiungendo 10 millilitri di PBS e dondolando delicatamente il piatto da quattro a cinque volte. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere tre millilitri di tripsina EDTA e scuotere il piatto per assicurarsi che l'intera superficie sia coperta prima di incubarla a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate, disattivare la tripsina aggiungendo sette millilitri di DMEM integrati con il 10% di FBS, quindi risospegnare le cellule tubando su e giù più volte.

Rimuovere la tripsina per centrifugazione e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare prima di riconsociegnare le cellule in 10 millilitri di DMEM fresco. Dopo il conteggio, aggiungere circa una volta 10 alla settima cellule a ciascuna piastra di 15 centimetri e incubare la coltura per uno o due giorni fino a quando le cellule sono confluenti al 100%. Per preparare lo pseudovirus VSV spike EGFP per il titolo, infettare le cellule a 0,01 molteplicità di infezione con il virus stock diluito in 12 millilitri di DMEM senza siero.

Dopo aver aggiunto il virus, incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con occasionali dondoli. Alla fine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con DMEM fresco integrato con 2% FBS e 20 millimolari, quindi incubare le cellule a 34 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Il giorno successivo, utilizzare un microscopio fluorescente per visualizzare l'espressione EGFP delle cellule infette.

Una volta osservato un esteso effetto citopatico e il distacco cellulare, raccogliere il surnatante di coltura e rimuovere i detriti mediante centrifugazione. Per evitare cicli multipli di congelamento-disgelo, aliquotare il surnatante prima della conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per determinare il titolo virale, placcare le cellule Vero E6 in sei piastre di pozzetto ad una densità di semina di sei volte 10 alla quinta cellule per pozzetto e incubare durante la notte.

Il giorno successivo, impostare una serie di diluizione seriale di dieci volte dello stock virale aggiungendo 900 microlitri di tubi da media a sette microcentrifughe e aggiungendo 100 microlitri di stock virale al primo tubo. Dopo un breve vortice, trasferire 100 microlitri di virus diluito a ciascun tubo successivo, vorticosamente tra ciascun tubo. Quindi sostituire il surnatante in ogni pozzo della piastra di coltura Vero E6 con 500 microlitri da 10 a meno secondo a 10 a meno settima diluizioni virali.

Dopo un'incubazione di 45 minuti nell'incubatore di colture cellulari con dondolo delicatamente ogni 15 minuti, sostituire l'inoculo con una soluzione di sovrapposizione e incubare le cellule a 34 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore. Alla fine dell'incubazione, per visualizzare le placche mediante colorazione viola cristallina, lavare le cellule una volta con PBS prima di aggiungere due millilitri di viola cristallino allo 0,1% a ciascun pozzetti. Posizionare la piastra su un bilanciere per circa 20 minuti a temperatura ambiente prima di lavare delicatamente ogni pozzetti due volte con PBS.

Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare asciugare le piastre all'aria per almeno un'ora prima di utilizzare la formula come indicato per calcolare il titolo del virus in ciascun pozzo in unità di formazione della placca per millilitro. Per impiattare le cellule per un test di neutralizzazione, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di cellule Vero E6 a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzi ad una densità di due volte 10 alla quinta cella per millilitro e incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, il calore inattiva i campioni di siero del paziente da testare a bagnomaria a 56 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi impostare una serie di diluizione di dieci volte dei campioni di siero del paziente in una piastra di coltura tissutale vuota da 96 pozzi aggiungendo otto microlitri del siero a 72 microlitri di DMEM senza siero con antibiotici in ogni pozzetto della riga A.Quindi aggiungere 40 microlitri di DMEM senza siero a ciascun pozzetto delle file da B a G e 80 microlitri a ciascun pozzetto della riga H.Utilizzando una pipetta multicanale da 12 pozzetti, mescolare i campioni nella riga A, quindi trasferire 40 microlitri del campione da ciascun pozzettimo della riga A a ciascun pozzetti della riga B.Dopo la miscelazione, ripetere la diluizione per ogni successiva fila di pozzetti fino alla riga F.Successivamente, aggiungere 40 microlitri di VSV spike EGFP a 0,05 molteplicità di infezione per ciascun pozzetti nelle righe da A a G, e mescolare pipettando da quattro a cinque volte prima di incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, aspirare accuratamente il surnatante da ciascun pozzettino della piastra di coltura Vero E6 e trasferire 60 microlitri di miscela di virus anticorpali da ciascun pozzettio della piastra di diluizione del campione al corrispondente pozzettimo della piastra di coltura cellulare. Quando tutti i campioni sono stati trasferiti, posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un'ora con dondolo ogni 20 minuti.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 140 microlitri di soluzione di sovrapposizione di carbossimetilcellulosa a ciascun pozzettino della piastra di coltura cellulare e trasferire la piastra in un incubatore a 34 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, immagina le lastre su un imager fluorescente automatizzato a una lunghezza d'onda di 488 nanometri e utilizza la funzione di conteggio automatico dell'imager per quantificare i singoli focolai EGFP. In questo esempio rappresentativo, un anticorpo neutralizzante disponibile in commercio contro il dominio di legame del recettore spike SARS-coronavirus-2 è stato utilizzato come controllo positivo, insieme a IgG come controllo negativo.

L'inibizione percentuale è stata calcolata in base al numero di focolai EGFP rilevati tramite imaging fluorescente. La neutralizzazione dello pseudovirus da parte di campioni di pazienti convalescenti raccolti circa tre mesi dopo l'infezione da SARS-coronavirus-2 ha mostrato che i pazienti ospedalizzati hanno dimostrato una maggiore capacità neutralizzante rispetto a quelli che non hanno richiesto il ricovero in ospedale. Questa procedura può essere utilizzata anche per valutare altri agenti terapeutici e di prevenzione COVID-19 che mirano a bloccare l'infezione virale.