Name: Imaging Dellassorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Impara a eseguire l'imaging del calcio mitocondriale in astrociti e neuroni utilizzando gli indicatori GCaMP5G e GCaMP6s. Questo metodo consente di studiare la dinamica del calcio in specifici tipi cellulari neurali.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) concede R01NS069726 e R01NS094539 a SD. Ringraziamo Erica DeMers per la registrazione audio.

Le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Missouri-Columbia.
1. Costruzione di plasmidi a DNA
NOTA: Per l'imaging in vitro e in vivo, vengono costruiti plasmidi di DNA che codificano GCaMP5G/6s con promotori astrociti e neuroni specifici e sequenze di targeting mitocondriale.
<ol><li>Inserire matrice mitocondriale (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 nei siti di clonazione EcoRI e BamHI nella spina dorsale del plasmide adeno-associato (AAV) pZac2.1 per ottenere plasmidi contenenti promotore astrocitico gfaABC1D o promotore caMKII neuronale18,19,20.</li>
	<li>Subclone GCaMP5G/6s nei siti di clonazione BamH I e Non 1 nei plasmidi di cui sopra per ottenere nuovi plasmidi pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s e pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s che mirano all'espressione transgenica nei mitocondri negli astrociti e nei neuroni20,21 (Figura 1A).</li>
	<li>Preparare i plasmidi del DNA pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s per la trasfezione per lo studio in vitro (Sezione 2). Produrre vettori AAV con sierotipo 5 per gli astrociti e sierotipo 9 per i neuroni per lo studio in vivo 18 (Sezione 3).</li>
</ol>2. Imaging mitocondriale In vitro Ca2+ in astrociti e neuroni
<ol><li>Preparare astrociti primari dalla corteccia di topi neonatali P1 e neuroni primari dalla corteccia degli embrioni E15-1618,22,23, 24e coltivarli su coperture di vetro di 12 mm di diametro in piastre a 24 pozzetti utilizzando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e il mezzo basale neuronale (NBM) contenente il 2% di B27, rispettivamente.</li>
	<li>Trasfettare astrociti e neuroni maturi con pZac-gfaABC1D-GCaMP6s e plasmidi pZac-CaMKII-GCaMP5G utilizzando reagenti di trasfezione a base lipidica per esprimere GCaMP6 nei mitocondri degli astrociti e GCaMP5G nei mitocondri dei neuroni18,20,21. Trasfettate le cellule in ogni pozzetto con 0,5 μg di DNA e cambiate il mezzo 6 ore dopo. NOTA: Gli astrociti e i neuroni sono pronti per l'imaging 1-2 giorni dopo la trasfezione.</li>
	<li>Eseguire l'imaging mitocondriale in vitro Ca2+ 1-2 giorni dopo la trasfezione.<ol>
<li>Trasferire le coperture di vetro coltivate con astrociti o neuroni nella camera di perfusione PH-1 sotto un microscopio a epifluorescenza o due fotoni.</li>
		<li>Stimolare l'assorbimento astrocitico mitocondriale di Ca2+ con 100 μM di ATP in ACSF, o stimolare i mitocondri neuronali con 100 μM di glutammato/10 μM di glicina20,25 (Figura 2 e Figura 3). NOTA: le modifiche della soluzione da ACSF ad ACSF contenente ATP e glutammato/glicina sono controllate da un sistema di perfusione ALA-VM821. La velocità del cambio di soluzione è controllata a 1-2 ml/min regolando una valvola.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Imaging mitocondriale In vivo Ca2+ in astrociti e neuroni
<ol><li>Preparazioni AAV.<ol>
<li>Preparare i seguenti vettori di virus adeno-associato ricombinante (rAAV) utilizzando i plasmidi del DNA preparati nella sezione 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vettori. NOTA: In questo esperimento, i vettori rAAV del sierotipo 5 sono stati preparati per esprimere GCaMP5G nei mitocondri negli astrociti e i vettori rAAV del sierotipo 9 sono stati preparati per esprimere GCaMP6 nei mitocondri nei neuroni.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezione stereotassica di AAV.<ol>
<li>Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano. NOTA: Più tardi durante l'intervento chirurgico, i livelli di isoflurano sono ridotti al 2%.</li>
		<li>Dopo che il topo raggiunge un livello chirurgico di anestesia, come determinato dal pizzico della coda e della punta, radere i capelli sul sito chirurgico, sulla corteccia motoria o somatosensoriale, con un tagliacapelli.</li>
		<li>Posizionare il mouse sul dispositivo stereotassico del mouse e fissare la testa con le barre auricolari. Applicare unguento oftalmico sugli occhi per proteggerli durante l'intervento chirurgico. Utilizzare una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C durante l'intervento chirurgico. NOTA: Eseguire interventi chirurgici utilizzando procedure asettiche. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave o con uno sterilizzatore a caldo.</li>
		<li>Dopo che il mouse è stato montato sul dispositivo stereotassico, sterilizzare il cuoio capelluto con scrub alternato a base di iodio e etanolo al 70% tre volte. Fare un'incisione nella linea mediana del cuoio capelluto per esporre il sito di iniezione.</li>
		<li>Aprire la pelle nell'asse bregma-lamda e creare un foro di bava di circa 1 mm di diametro con un trapano ad alta velocità nella posizione di iniezione prevista del motore o della corteccia somatosensoriale.</li>
		<li>Utilizzare una siringa Hamilton da 33 G contenente virus adeno-associato (vettori rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x 1011 GC] o vettori rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 1011 GC]) per iniettare fino a 1 μL di virus nell'area bersaglio. NOTA: ad esempio, per la somministrazione virale corticale, iniettare la soluzione virale a due profondità in più passaggi. In primo luogo, inserire l'ago a una profondità di 1 mm dalla dura e consentire 5 minuti per il recupero del cervello. Quindi, spostare l'ago fino a ~ 700 μm di profondità e iniettare 500 nL della soluzione virale ad una velocità di iniezione di 10 nL/s utilizzando una siringa hamilton controllata da un controller della pompa a microsiringa. Al termine dell'iniezione, attendere 5 minuti per consentire al virus di diffondersi nel cervello. Quindi, spostare l'ago fino alla seconda posizione di iniezione a una profondità di 300 μm. Qui, iniettare altri 500 nL della soluzione virale. Attendere 10 minuti per consentire al virus di diffondersi nel cervello.</li>
		<li>Chiudere il cuoio capelluto e la pelle utilizzando un adesivo tissutale. Lascia che i topi si riprendano sulla piastra riscaldante. Rimanda i topi alla struttura per animali dopo il recupero.</li>
	</ol></li>
	<li>Installazione della finestra cranica e imaging in vivo a due fotoni (2-P) dei segnali mitocondriali Ca2+. NOTA: L'impianto della finestra cranica viene eseguito 3 settimane dopo l'iniezione di AAV sulla corteccia motoria o somatosensoriale26,27,28,29. Carprofene (10 mg / kg) viene iniettato per via sottocutanea per fornire sollievo dal potenziale dolore prima dell'intervento chirurgico. Le procedure chirurgiche della finestra cranica sono identiche alle procedure chirurgiche di iniezione AAV e vengono eseguite in condizioni asettiche.<ol>
<li>Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano. NOTA: Questa è la dose iniziale e ridurre al 2% per l'intervento chirurgico in seguito. Durante l'imaging, per l'anestesia viene utilizzata un'iniezione intraperitoneale (IP) di 130 mg di ketamina/10 mg di xilazina/kg di peso corporeo disciolto in ACSF.</li>
		<li>Posizionare il mouse sul dispositivo stereotassico del mouse e fissare la testa con le barre auricolari. Applicare unguento oftalmico agli occhi. Utilizzare una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C durante l'intervento chirurgico. NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati.</li>
		<li>Fai un'incisione di 5-8 mm di lunghezza nella linea mediana del cuoio capelluto e rimuovi un lembo di pelle usando un paio di forbici.</li>
		<li>Dopo che il cranio è stato esposto, eseguire la craniotomia di 2,0-3,0 mm di diametro utilizzando un trapano ad alta velocità sull'area iniettata dal virus (ad esempio, corteccia motoria o corteccia somatosensoriale, Figura 1B). In primo luogo, fare quattro piccoli fori, quindi praticare in un cerchio che collega i fori. Quindi, sollevare e rimuovere l'osso con forbici affilate e rimuovere. La dura madre esposta può essere rimossa o mantenuta intatta per l'impantazione della finestra cranica.</li>
		<li>Posizionare una copertura di vetro di 3-5 mm di diametro che trasporta un silicone trasparente sopra la craniotomia. Usa uno stuzzicadenti per spingere delicatamente la finestra cranica sulla superficie del cervello. Quindi, sigillare il bordo con una piccola quantità di adesivo siliconico. NOTE: In alternativa, invece del disco di silicone, è possibile utilizzare gel di agarosio a basso punto di fusione all'1,2% tra il vetro di copertura e il tessuto cerebrale.</li>
		<li>Infine, sigillare i bordi del coperchio con cemento dentale. Fare attenzione ad applicare leggermente il cemento sul bordo della finestra cranica per un forte incollaggio. Attaccare una piastra metallica su misura al cranio con cemento dentale. NOTA: La piastra metallica viene utilizzata per fissare la testa del mouse allo stadio del microscopio 2-P durante la sessione di imaging (Figura 1C).</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di soluzione ACSF sopra il coperchio sulla finestra cranica per l'immersione in acqua durante l'imaging.</li>
		<li>Eseguire l'imaging 2-P time-lapse in vivo di mito-GCaMP5G in astrociti e mito-GCaMP6 in neuroni con lunghezza d'onda di 910 nm attraverso la finestra cranica(Figura 1C)18,20,27. NOTA: durante l'imaging, i topi sono sulla piastra riscaldante per mantenere la temperatura fisiologica. I topi saranno sacrificati immediatamente dopo il completamento della sessione di imaging.</li>
		<li>Etichettare gli astrociti in vivo con sulforodamina 101 (SR101) quando è necessario determinare la colocalizzazione.<ol>
<li>Alla fine del passaggio 3.3.4, applicare 100 μL di 100 μM SR101 in ACSF sulla superficie corticale per 1-5 min.</li>
			<li>Risciacquare la superficie con ACSF per lavare via l'SR101 non legato. Utilizzando l'imaging 2-P, la co-marcatura di mito-GCaMP5G e SR101 negli astrociti può essere osservata 45-60 minuti dopo (Figura 4A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo, forniamo un metodo e un protocollo per l'imaging dei segnali mitocondriali Ca2+ in astrociti e neuroni. Abbiamo implementato strategie di targeting dei mitocondri e specifiche per tipo cellulare per esprimere GECI GCaMP5G/6s. Per indirizzare GCaMP5G / 6 nei mitocondri, abbiamo incluso una sequenza di targeting dei mitocondri nei plasmidi. Per esprimere GCaMP5G/6s in astrociti e neuroni in vivo,abbiamo inserito un promotore astrocitario specifico gfaABC1D e un promotore neurone-spec...

I mitocondri sono organelli subcellulari dinamici e sono considerati le centrali cellulari per la produzione di energia. D'altra parte, i mitocondri possono assorbire Ca2+ alla matrice in risposta a aumenti locali o citosolici di Ca2+. L'assorbimento mitocondriale di Ca2+ influenza la funzione mitocondriale, compresi i processi metabolici come le reazioni nel ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e la fosforilazione ossidativa, e regola le proteine sensibili al Ca2+in condizioni fisiologiche1,2,3,4. Il sovraccarico mitocondriale di Ca2+ è anche un fattore determinante per la morte cellulare, compresa la necrosi e l'apoptosi in vari disturbi cerebrali5,6,7. Provoca l'apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTPs) e il rilascio di cofattore caspasi, che avvia la morte cellulare apoptotica. Pertanto, è importante studiare la dinamica e la manipolazione mitocondriale di Ca2+ nelle cellule viventi per comprendere meglio la fisiologia e la patologia cellulare.
I mitocondri mantengono l'omeostasi della matrice Ca2+ attraverso un equilibrio tra l'assorbimento di Ca2+ e l'efflusso. L'assorbimento mitocondriale di Ca2+ è mediato principalmente dagli uniportatori mitocondriali Di Ca2+ (MCU), mentre l'efflusso mitocondriale di Ca2+ è mediato dagli scambiatori Na+-Ca2+-Li+ (NCLX) e dagli scambiatori H+/Ca2+ (mHCX)8. L'equilibrio può essere perturbato attraverso la stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)9. L'omeostasi mitocondriale di Ca2+ è anche influenzata dal tamponamento mitocondriale dalla formazione di complessi insolubili xCa2+-xPO4x-xOH8.
Le variazioni intracellulari e mitocondriali della concentrazione di Ca2+ ([Ca2+])possono essere valutate mediante indicatori fluorescenti o luminescenti di Ca2+. Il legame di Ca2+ agli indicatori provoca modifiche spettrali, consentendo la registrazione di cellule libere [Ca2+]in tempo reale in cellule vive. Attualmente sono disponibili due tipi di sonde per monitorare i cambiamenti di Ca2+ nelle cellule: indicatori chimici organici e indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI). Generalmente, diverse varianti con diverse affinità di Ca2+ (basate su Kd),proprietà spettrali (lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione), intervalli dinamici e sensibilità sono disponibili per le questioni biologiche in esame. Sebbene molti indicatori organici sintetici di Ca2+ siano stati utilizzati per l'imaging citosolico di Ca2+, solo pochi possono essere caricati selettivamente nella matrice mitocondriale per l'imaging mitocondriale Ca2+, con Rhod-2 che è il più utilizzato (per le recensioni vedi10,11). Tuttavia, Rhod-2 ha un grosso svantaggio di perdite durante esperimenti a lungo termine; inoltre, è suddiviso tra mitocondri, altri organelli e il citosol, rendendo difficili le misurazioni assolute in diversi sottocompartimenti. Al contrario, utilizzando promotori specifici per tipo cellulare e sequenze di targeting del compartimento subcellulare, i GECI possono essere espressi in diversi tipi di cellule e compartimenti subcellulari per l'imaging Ca2+ specifico per cellula e compartimento in vitro o in vivo. Gli indicatori GCaMP Ca2+ basati sull'intensità di fluorescenza a lunghezza d'onda singola sono recentemente emersi come principali GECI12,13,14,15,16. In questo articolo, forniamo un protocollo per il targeting dei mitocondri e l'espressione specifica del tipo cellulare di GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) in astrociti e neuroni e l'imaging dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in questi tipi di cellule. Utilizzando questo protocollo, l'espressione di GCaMP6G/6s nei singoli mitocondri può essere rivelata e l'assorbimento di Ca2+ in risoluzione mitocondriale singola può essere ottenuto in astrociti e neuroni in vitro e in vivo.

<table><tbody><tr><td>Unguento per lacrime artificiali</td><td>Rugby</td><td>NDC-0536-6550-91</td><td>83% petrolato bianco</td></tr><tr><td>Colla cianoacrilato</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>3M Vetbond Adesivo</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio da dissezione</td><td>Nikon</td><td>SMZ 2B</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Dumont con punta fine</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>11255-20</td><td>per la rimozione della dura Vetrini</td></tr> di <tr><td>copertura, 0,13-0,17 mm di spessore</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>per la copertura della finestra cranica</td></tr><tr><td>Micro trapano ad alta velocità</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>con punta per lucidare le ossa</td></tr><tr><td>Siringa per iniezione</td><td>Hamilton</td><td>2,5 ml</td><td>per iniezione virale</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td>VEDCO NDC-50989-996-06</td><td>100 mg/kg di peso corporeo</td></tr><tr><td>Basso punto di fusione agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>riduzione degli artefatti di movimento</td></tr><tr><td>Telaio metallico</td><td>Su misura</td><td>vedi Fig 1</td><td>per il collegamento del cervello al tavolino del microscopio</td></tr><tr><td>Controller della pompa MicroSyringe World</td><td>Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Regolatore di velocità di iniezione</td></tr><tr><td>Dispositivo stereotassico del mouse</td><td>Stoelting</td><td>51725</td><td>per contenere i topi</td></tr><tr><td>Camera di perfusione</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA-VM8</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo autoregolante</td><td>Fine Science Tools</td><td>21061</td><td>per prevenire l'ipotermia dei topi</td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td>colorante fluorescente rosso per marcare gli astrociti</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td>per la dissezione</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18004-23</td><td>per la pulizia del materiale</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-234-11</td><td>10 mg/kg di peso corporeo</td></tr></tbody></table>

imaging dell'assorbimento mitocondriale di ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori ca2+ geneticamente codificati (geci)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Il Ca2+ mitocondriale svolge un ruolo fondamentale nel controllo del buffering citosolico di Ca2+, del metabolismo energetico e della trasduzione del segnale cellulare. Il sovraccarico di Ca2+ mitocondriale contribuisce a varie condizioni patologiche, tra cui la neurodegenerazione e la morte cellulare apoptotica nelle malattie neurologiche. Qui presentiamo un approccio molecolare specifico per tipo cellulare e mitocondri per l'imaging mitocondriale Ca2+ in astrociti e neuroni in vitro e in vivo. Abbiamo costruito plasmidi di DNA che codificano gli indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) con promotori astrociti e neuronali specifici gfaABC1D e CaMKII e sequenza di targeting dei mitocondri (mito-). Per l'imaging mitocondriale in vitro Di Ca2+, i plasmidi sono stati trasfettati in astrociti e neuroni in coltura per esprimere GCaMP5G/6s. Per l'imaging mitocondriale in vivo di Ca2+, sono stati preparati vettori virali adeno-associati (AAV) e iniettati nel cervello del topo per esprimere GCaMP5G/6s nei mitocondri negli astrociti e nei neuroni. Il nostro approccio fornisce un mezzo utile per visualizzare la dinamica mitocondriale Ca2+ in astrociti e neuroni per studiare la relazione tra segnalazione citosolica e mitocondriale Ca2+, così come le interazioni astrociti-neuroni.

Lo scopo di questo studio è stato quello di fornire una metodologia per l'immagine di segnali mitocondriali Ca2+ utilizzando GECI in astrociti e neuroni in vitro e in vivo. I risultati dell'imaging mitocondriale Ca2+ sia in vitro che in vivo sono presentati qui.
Segnalazione mitocondriale invitro Ca2+ in astrociti e neuroni in coltura L'assorbim...

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

A dimostrare la procedura saranno lo studente laureato Zhe Zhang, lo specialista di ricerca Nannan Zhang, i professori Illker Ozden e Shinghua Ding. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare astrociti e neuroni di coppia specifici per tipo cellulare e il metodo di targeting mitocondriale per la conta mitocondriale in vitro e in vivo di imaging utilizzando l'indicatore di calcio geneticamente codificato, GCaMP5G e 6s. Per l'imaging in vitro o in vivo, costruiremo plasmidi del DNA contenenti promotori specifici di astrociti o neuroni gfaABC1D o CaMKII e indicatori di calcio geneticamente codificati, GCaMP5G/6s con sequenze di targeting mitocondriale.Per l'imaging in vitro del calcio mitocondriale abbiamo trasfettato neuroni di astrociti coltivati su scivoli di copertura di vetro con i suddetti plasmidi del DNA utilizzando il metodo Lipofectamine. L'imaging può essere avviato uno o due giorni dopo la trasfezione trasferendo la copertura di vetro scivola nella camera di profusione sotto un microscopio a epifluorescenza o a due fotoni. Ecco alcuni esempi di segnali fluorescenti provenienti da mitocondri e un astrocita che esprime GCaMP6s a sinistra, e per i mitocondri in un neurone, che esprimono GCaMP5G a destra.Per l'imaging in vivo, abbiamo preparato l'adenovirus associato al sierotipo 5 per l'espressione di mito-GCaMP5G negli astrociti e l'adenovirus associato al sierotipo 9 per l'espressione di mito-GCaMP6 nei neuroni. Per gli interventi chirurgici di iniezione di virus stereotassico, abbiamo prima anestetizzato il topo con il 3% di isoflurano. Successivamente, durante l'intervento chirurgico, i livelli di isoflurano vengono ridotti al 2% Dopo aver raggiunto il corretto livello di anestesia, i capelli sul cuoio capelluto vengono rasati e il topo viene posizionato su uno strumento chirurgico stereotasso.Un unguento oftalmico viene applicato agli occhi per proteggerli durante l'intervento chirurgico. Gli interventi chirurgici di iniezione vengono eseguiti utilizzando procedure asettiche, compresi strumenti sterili e tecniche asettiche. Gli strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave o mediante uno sterilizzatore a caldo.Dopo che il mouse è stato montato sulla stereotassa, il cuoio capelluto viene pulito con betadina e etanolo al 70% tre volte. Quindi la pelle viene tagliata lungo l'asse Bregma Lambda e la verticale viene effettuata da un trapano ad alta velocità sulla posizione target. In questo lavoro, abbiamo preso di mira la corteccia motoria o la paracorteccia.Una siringa Hamilton calibro 33 che trasporta un vettore di adenovirus associato viene inserita attraverso il foro nel cervello e i vettori vengono iniettati nell'area bersaglio. Per la consegna corticale, iniettiamo la soluzione del virus a due profondità in più passaggi. In primo luogo, inseriamo l'ago a un millimetro di profondità nella corteccia.Dopo aver concesso cinque minuti al cervello per recuperare, spostiamo l'ago fino a 700 micrometri di profondità, iniettiamo 500 nano litri di soluzione virale. Dopo che l'iniezione è completata, aspettiamo cinque minuti per consentire al virus di diffondersi nel cervello. E poi spostiamo l'ago fino alla seconda posizione di iniezione a 300 micrometri di profondità.Qui, iniettiamo altri 500 nano litri di soluzione virale. Dopo che l'iniezione è completata, aspettiamo 10 minuti per consentire al virus di diffondersi e quindi rimuoviamo l'ago dal cervello e chiudiamo il foro della bava con cera ossea o Kwik-Sil. Infine, la pelle viene suturata con Vetbond e il topo viene recuperato su una piastra riscaldante prima di essere rimandato alla struttura per animali.Il mouse sarà pronto per l'uso per l'imaging in vivo in un minimo di tre settimane, che è il periodo di tempo in cui matura l'espressione GCaMP. Gli interventi chirurgici di impianto della finestra cranica vengono eseguiti anche utilizzando condizioni asettiche come descritto per gli interventi chirurgici di iniezione. Le procedure chirurgiche della finestra cranica sono identiche alle procedure chirurgiche di iniezione fino al punto di esposizione del cranio.Una volta che il cranio è esposto, quarti di una craniotomia di 2-3 mm di diametro sopra l'area iniettata dal virus sono contrassegnati da quattro fori poco profondi fatti da un trapano ad alta velocità attaccato a un manipolatore. Quindi la sezione del cranio, alle gole della craniotomia viene assottigliata forando con cura e lentamente l'osso intorno in un cerchio, collegando questi quattro fori. Una volta che il cranio ai bordi è abbastanza sottile, l'osso viene sollevato con pinzette affilate e rimosso.La dura madre esposta può essere rimossa o mantenuta intatta per l'impianto della finestra cranica. La nostra finestra cranica è costituita da una copertura in vetro di 3-5 millimetri di diametro, creando un disco in silicone di circa 300 micron di spessore al centro. Il montaggio della finestra cranica si ottiene posizionandolo sopra la craniotomia.Un pezzo di stuzzicadenti attaccato a un manipolatore viene utilizzato per spingere delicatamente la finestra cranica sulla superficie del cervello. Quindi, il bordo della finestra cranica viene sigillato con una piccola quantità di adesivo siliconico Kwik-Sil. Infine, la finestra cranica è fissata nei bordi del cranio con acrilico dentale.Bisogna fare attenzione per applicare l'acrilico dentale leggermente sopra i bordi della finestra cranica per un forte legame. Come molti altri gruppi di ricerca hanno implementato in passato, un gel di agarosio all'1,2% può essere utilizzato tra il vetro di copertura e il cervello come alternativa al disco in silicone. Dopo che la finestra cranica è stata installata in modo sicuro, una piastra metallica è attaccata al cranio.Questa piastra di testa verrà utilizzata per fissare la testa del mouse sul palco di un microscopio a due fotoni durante le sessioni di imaging. L'assorbimento mitocondriale di calcio negli astrociti può essere suscitato dall'applicazione di ATD mentre l'assorbimento di calcio mitocondriale nei neuroni può essere provocato dall'applicazione di glicina glutammato nel liquido spinale cerebrale artificiale, con gravità attraverso un sistema di perfusione. Si può quindi osservare l'assorbimento di calcio nei singoli mitocondri negli astrociti e nei neuroni.I seguenti film mostrano l'assorbimento mitocondriale di calcio in un astrocita suscitato dall'ATP a sinistra e in un neurone suscitato da glutammato e glicina a destra. L'imaging viene eseguito raccogliendo immagini a due fotoni in vivo time-lapsed di segnali fluorescenti mitocondriali in astrociti e neuroni con un sistema di microscopia a due fotoni Ultima di Prairie Technologies, che è dotato di un milione di laser Ti Sapphire Ultra di Coherent. Utilizziamo le lunghezze d'onda di eccitazione da 880 a 910 nanometri, che sono ottimali per l'imaging in vivo con GCaMP5G e 6s.Astrociti ed espressione neuron-specifica di mito-GCaMP5G e 6s e riconfermata dalla co-localizzazione dell'etichettatura astrocitaria-specifica di SR101 o del marcatore neurone specifico NeuN. L'assorbimento spontaneo di calcio mitocondriale negli astrociti e nei neuroni in vivo può essere osservato mediante imaging time-lapse utilizzando la microscopia a due fotoni. Le immagini mostrano aumenti spontanei di calcio nei singoli mitocondri in un astrocita a sinistra e un neurone a destra.I nostri approcci sono utili per l'imaging del calcio mitocondriale specifico del tipo cellulare in vitro e in vivo. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come immaginare l'assorbimento di calcio mitocondriale negli astrociti e nei neuroni.

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Imaging Dellassorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI) (Video) | JoVE Journal

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI)

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