Valutazione funzionale della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti mediante inibizione in vivo , immunofluorescenza e citometria a flusso

La meiosi è un evento evolutivo conservato negli eucarioti, che è essenziale per la gametogenesi e la riproduzione sessuale. Il nostro protocollo fornisce un metodo efficace per gli studi della divisione meiotica e della spermatogenesi. Abbiamo descritto una serie di protocolli per l'analisi degli spermatociti.

Questa tecnica può essere applicata per l'osservazione del fuso meiotico, dei cromosomi omologhi e degli organelli subcellulari negli spermatociti. Questo metodo può essere utilizzato per l'analisi della divisione meiotica, la generazione di modelli animali di editing genetico e la trasfezione genica in tessuti o organi. Gli sperimentatori dovrebbero mantenere un ambiente sterile durante la chirurgia addominale e prestare attenzione alla temperatura, al tempo e alle condizioni sperimentali chiave di questo protocollo.

A dimostrare la procedura sarà la signorina Meng-Fei Xu, una post-laurea del mio laboratorio. Iniziare la costruzione del modello murino di inibizione della proteina centromero mediata da GSK923295 E o CENP-E legando gli arti del topo anestetizzato e fissandoli sul vassoio di cera. Dopo aver disinfettato l'area chirurgica, utilizzare un bisturi sterile per fare un'apertura di cinque millimetri nella cavità addominale del topo, seguita dal posizionamento di morsetti chirurgici sterili sulla pelle.

Quindi tirare il cuscinetto di grasso epididimo con una pinza da dissezione sterile per individuare i testicoli con l'aiuto di pinzette sterili. Dopo aver fissato i testicoli con una pinza sterile sotto uno stereoscopio, iniettare lentamente 10 microlitri di GSK923295 in tubuli seminiferi ad una concentrazione finale di 10 micromolari utilizzando 10 microlitri di Riodine. Al termine, spingere i testicoli nella cavità addominale e suturare il sito chirurgico come descritto nel manoscritto testuale.

Per la disidratazione del gradiente dei testicoli di topo raccolti, incubare sequenzialmente il campione in vari supporti come descritto nel manoscritto. Dopo l'incubazione seriale, posizionare il tessuto sul fondo della scatola di incorporamento e aggiungere la paraffina fusa nella scatola. Per la completa solidificazione della paraffina, raffreddare i campioni a quattro gradi Celsius per sei ore.

Successivamente, fissare il campione sul supporto dell'ultra microtomo mantenendo l'angolo tra il campione e la superficie del coltello da 5 a 10 gradi. Regolare lo spessore della fetta a cinque micrometri per preparare le sezioni spesse cinque micrometri utilizzando un ultra microtomo. Al momento della preparazione, distribuire il vetrino del campione a bagnomaria a 40 gradi Celsius prima di asciugare le sezioni nell'essiccatore per 12 ore a 37 gradi Celsius.

Dopo 12 ore, eseguire l'incubazione sequenziale delle diapositive come spiegato in precedenza. Quindi, sciacquare i vetrini in acqua distillata per cinque minuti, quindi colorare con la soluzione di ematossilina di Mayer per sei minuti a temperatura ambiente. Quindi sciacquare i vetrini macchiati in acqua corrente per cinque minuti e incubare con acqua distillata per due minuti.

Incubare i vetrini in etanolo cloridrato all'1% per tre secondi, quindi risciacquare e far scorrere acqua per due minuti. Colorare il campione con 1% di eosina per 15 secondi, seguito dall'incubazione seriale. Al termine, sigillare i vetrini utilizzando 15 microlitri di gomma neutra e un coprislip da 24 x 50 millimetri.

Per l'immunofluorescenza, posizionare il vetrino nella soluzione di recupero dell'antigene per far bollire ad alta pressione in una pentola a pressione per quattro minuti per il recupero dell'antigene. Quindi raffreddare il vetrino naturalmente a temperatura ambiente prima di risciacquare due volte con acqua distillata per cinque minuti e con PBS per cinque minuti. Per permeabilizzare le cellule, incubare il vetrino in 500 microlitri di Triton X-100 allo 0,25% in PBS per 10 minuti e quindi risciacquare i vetrini con PBS per cinque minuti tre volte.

Per il blocco dell'antigene, incubare il campione con 300 microlitri di albumina sierica bovina al 3% o BSA per un'ora e con gli anticorpi primari al 3% BSA in PBST per 16 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, mettere il vetrino in una scatola umidificata per evitare che i tessuti si secchino. Riscaldare i vetrini naturalmente a temperatura ambiente per 30 minuti.

Eliminare l'anticorpo primario, seguito dal risciacquo del vetrino in PBST per cinque minuti tre volte. Diluire gli anticorpi secondari con 3% BSA e PBST. Quindi incubare il campione con anticorpi secondari diluiti per una o due ore a 37 gradi Celsius.

Dopo aver risciacquato il campione in PBST per cinque minuti cinque volte, colorare i nuclei con 50 microlitri DAPI per cinque minuti a temperatura ambiente. Montare il coprislip con il mezzo di montaggio anti-sbiadimento e sigillare il coprislip con lo smalto. Per la citometria a flusso, raccogliere i testicoli di topo in piastre di Petri di sei centimetri e tagliare i testicoli in pezzi di un millimetro cubo usando le forbici chirurgiche.

Quindi digerire i testicoli in un millilitro di collagenasi all'1% in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Per precipitare le cellule spermatogene, centrifugare il campione a 1.000 G per cinque minuti e scartare il surnatante prima di aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina EDTA allo 0,25% nel campione per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, centrifugare il campione a 1.000 G per cinque minuti.

Scartare il surnatante per incubare le cellule precipitate con un millilitro di etanolo freddo al 70% per più di otto ore a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione a 1.000 G per cinque minuti, raccogliere i sedimenti cellulari e colorare le cellule spermatogeniche con 500 microlitri di ioduro di propidio o soluzione colorante PI a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, filtrare il campione utilizzando uno schermo a 300 maglie per eliminare i detriti cellulari e raccogliere le cellule in un tubo di flusso per conservare le cellule a quattro gradi Celsius.

Rileva i segnali di fluorescenza e la diffusione della luce alla lunghezza d'onda dell'eccitazione a 488 nanometri utilizzando un citometro a flusso. Analizzare il contenuto di DNA nel campione e la diffusione della luce utilizzando il software ModFit MF LT 32. Dopo l'iniezione testicolare di GSK923295, l'onda spermatogena è stata alterata nei tubuli seminiferi a causa dell'inibizione di CENP-E.

Tuttavia, l'onda spermatogena nei tubuli seminiferi era regolare e organizzata nel gruppo di controllo. È stato osservato che i diversi cromosomi omologhi non erano allineati alla placca equatoriale dopo l'inibizione di CENP-E. Inoltre, l'inibizione di CENP-E ha portato all'aumento degli spermatociti di metafase I nei tubuli seminiferi.

L'analisi di immunofluorescenza ha dimostrato la diminuzione del numero di cellule positive della proteina del complesso anti-sinaptonemale tre o SYCP3 per tubulo seminifero dopo inibizione di CENP-E. D'altra parte, i punti SYP3 per cellula metafase e gli allungamenti SYP3 per cellula non sono stati influenzati nei gruppi GSK92395. Le distanze dei poli del fuso negli spermatociti in metafase I sono aumentate a causa dell'inibizione di CENP-E.

L'analisi rappresentativa dimostra che l'inibizione di CENP-E ha determinato la diminuzione delle cellule aploidi nel gruppo 923295 GSK rispetto al controllo. I rapporti delle cellule diploidi e delle cellule aneuploidiche non sono stati influenzati in modo significativo dopo l'inibizione di CENP-E. Al contrario, i rapporti delle cellule tetraploidi sono aumentati nel gruppo GSK923295 rispetto al gruppo di controllo.

L'analisi al microscopio elettronico a trasmissione delle cellule spermatogeniche ha mostrato l'organizzazione interrotta delle cellule spermatogeniche nel gruppo GSK923295. Lo sperimentatore deve prestare attenzione alla posizione di iniezione, alla dose del farmaco, al metodo di iniezione e al metodo di sutura durante la chirurgia addominale e l'iniezione testicolare. Questa tecnica, insieme all'elettroporazione in vivo focalizzata sulle proteine bersaglio e sugli strumenti di editing genico, può essere utilizzata nel campo della divisione miotica e della spermatogenesi.