I centrosomi Imaging in Fly Testicoli

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare marcatori centrosomali geneticamente marcati per lo screening di nuove mutazioni genetiche e scoprire la funzione dei geni centrosomali recentemente identificati. Ciò può essere ottenuto con tre diverse strategie di imaging. Traccia un imaging di testicoli vivi, traccia B, fissazione chimica dei testicoli o colorazione immunologica della traccia C.

Il primo passo della procedura consiste nell'isolare i testicoli dei moscerini che esprimono proteine somiche centris geneticamente marcate, che possono essere seguite da un imaging immediato. Il secondo passo è fissare chimicamente i testicoli, che può essere seguito anche dall'imaging. In terzo luogo, i testicoli possono essere colorati con l'immuno e quindi sottoposti a immagini.

Infine, le posizioni delle proteine centrali vengono identificate mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della zona centrale, come le basi molecolari della formazione centrale, l'allungamento centrale e la separazione centrale. Inizia isolando i testicoli di drosophila come dettagliato dalla pubblicazione JoVE 2 6 4 1.

Dopo aver isolato i testicoli, immergere il campione in sei microlitri di tampone per colorazione a temperatura ambiente appena preparato su un vetrino da microscopio in vetro caricato positivamente. Attendere 10 minuti, quindi lavare delicatamente i DPI in eccesso sostituendo due volte il tampone colorante. Con sei microlitri di PBS.

Fare attenzione a non lavare via i testicoli. Rimuovere le soluzioni dal vetrino utilizzando un pezzo di carta da filtro per allontanarlo. Sei volumi da microlitro funzionano bene per vetrini da 18 millimetri quadrati.

Ora è utile utilizzare un bisturi affilato per perforare i testicoli vicino al tipo di cellula di interesse, e questo riduce al minimo la pressione su queste cellule durante la fase di schiacciamento. Quindi posizionare con cura un vetrino coprioggetti sopra il campione e sigillarlo con smalto per unghie. Quindi segnare la posizione dei testicoli sul vetrino con una penna e procedere all'imaging.

Dopo aver isolato i testicoli, immergerli in una goccia da sei microlitri di PBS sopra un vetrino da microscopio in vetro caricato positivamente. Orientare manualmente i testicoli in modo lineare o come si preferisce. Quindi utilizzare un pezzo di carta da filtro per rimuovere il PBS e sostituirlo con sei microlitri di tampone fisso appena preparato.

Dopo cinque minuti nel tampone fisso, asciugalo con un pezzo di carta da filtro. Ora immergere il campione in sei microlitri di tampone di colorazione DPI appena preparato per 10 minuti. Lavare via il DPI sostituendolo con due volumi da sei microlitri di PBS.

Quindi posizionare con cura un vetrino coprioggetto da 18 millimetri quadrati sopra il campione e sigillarlo con smalto per unghie. Quindi segnare la posizione dei testicoli sul vetrino e procedere con l'imaging. Per questa procedura preparare innanzitutto dei vetrini coprioggetto siliconati.

Per prima cosa, immergere i vetrini coprioggetti in un vaschetta di soluzione siliconata per un minuto a temperatura ambiente sotto una cappa aspirante, assicurarsi che i vetrini coprioggetti siano completamente esposti e non siano impilati uno sopra l'altro. Quindi, lavare i vetrini coprioggetto tre volte in acqua per un minuto per lavaggio. Seguire questo con tre lavaggi di un minuto in etanolo al 70% e un ultimo lavaggio di un minuto in acqua.

Quindi lasciare asciugare all'aria i vetrini coprioggetto siliconati sotto una cappa aspirante. Dopo aver sezionato diversi testicoli e inciso un vetrino con il tipo di campione, aggiungere cinque microlitri di PBS al vetrino coprioggetti siliconato e trasferire i testicoli nella gocciolina di PBS. Per garantire il successo sono necessari diversi vetrini copritutto, ciascuno con un singolo testicolo.

Successivamente, al microscopio da dissezione, perforare attentamente ciascuno dei testicoli come dimostrato in precedenza. Ora, posiziona delicatamente un microscopio di vetro caricato positivamente. Far scorrere il vetrino coprioggetti, in modo che il PBS si disperda uniformemente tra il vetrino coprioggetto e il vetrino.

Quindi rimuovere il tampone in eccesso tra il vetrino coprioggetti e il vetrino, che aumenterà la pressione sui testicoli e li schiaccerà. A questo punto far cadere il vetrino preparato nell'azoto liquido. Ora è possibile preparare e aggiungere più scivoli al serbatoio.

Prima di procedere con una pinza grande, rimuovere uno dei vetrini dall'azoto liquido e utilizzare rapidamente un bisturi per rimuovere il vetrino. Il campione deve rimanere sul vetrino mentre si rimuove il vetrino coprioggetto dal campione. Fare attenzione a non spalmarlo lungo la superficie del carrello S.

Ciò può essere ottenuto utilizzando il bisturi per staccare il vetrino coprioggetto con un movimento rapido. Ora incubare i vetrini in un barattolo di vetro per la colorazione del coplan riempito di metanolo. Raffreddare a meno 20 gradi Celsius per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, trasferire i vetrini in un barattolo contenente acetone. Raffreddare a meno 20 gradi Celsius dopo 30 secondi nell'acetone. Lavare i vetrini per un minuto in PBS a temperatura ambiente.

Successivamente, incubare i vetrini per 10 minuti in PBST appena preparato per bloccare siti non specifici Durante l'incubazione della TB PBS, riempire i pozzetti di una camera di umidità con acqua Dopo 10 minuti, rimuovere i vetrini dal PBST e asciugare ogni vetrino attorno al campione. Fare attenzione a non asciugare l'esemplare stesso. Man mano che ogni vetrino viene asciugato.

Posizionarlo nella camera di umidità. È importante asciugare l'area del vetrino che circonda il campione prima di aggiungere la soluzione anticorpale. Ciò garantisce che l'anticorpo rimanga localizzato sul campione, prevenendo così l'essiccazione durante la fase di incubazione.

Quindi far cadere delicatamente sui campioni 100 microlitri di anticorpi primari diluiti in P-B-S-T-B-R appena preparato. Utilizzare una diluizione da uno a 200 per anticorpi non caratterizzati. Quindi posizionare un pezzo quadrato di paraforma di un centimetro sopra il campione per diffondere la soluzione anticorpale e proteggere la soluzione anticorpale dall'evaporazione.

Lasciare incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, utilizzare una pinza per rimuovere delicatamente il paraforma dai vetrini. Quindi lavare i vetrini tre volte in PBST a temperatura ambiente per cinque minuti per lavaggio.

Successivamente, trasferire i vetrini nella camera di umidità con il campione rivolto verso l'alto, aggiungere delicatamente 100 microlitri di anticorpo secondario diluito in PBST, BR sui campioni. Come prima, applicare paraform e attendere un'ora di lavaggio dal secondario con tre lavaggi da cinque minuti in PBST e poi tre lavaggi da cinque minuti in PBS. Quindi asciugare accuratamente i vetrini senza toccare i campioni.

Aggiungere sei microlitri di supporto di montaggio e applicare un vetrino coprioggetti standard. Dopo aver sigillato il vetrino coprioggetto con smalto per unghie e aver segnato la posizione dei testicoli, procedere con l'imaging. I centrosomi subiscono molteplici trasformazioni morfologiche e funzionali nel corso della spermatogenesi.

Un processo facilmente osservabile è l'allungamento del centrosoma negli spermatogoni, il marcatore LAR ANA one GFP segna l'ole lungo 0,6 micron che questo ole allunga durante la spermatogenesi e raggiunge una lunghezza di 2,5 micron negli spermatidi quasi maturi. Poiché gli oli centrali di spermatozoi di drosophila sono straordinariamente lunghi, l'imaging può essere utilizzato per fare affermazioni quantitative riguardanti l'allungamento del centrosoma. Rispetto alla morfologia wild type, sono state identificate varie mutazioni che alterano la crescita centrale.

Due esempi sono sempre le mutazioni precoci e a palla di cannone che arrestano la spermatogenesi prima dell'inizio della meiosi, ma non bloccano l'allungamento dei centesimi in questi mutanti Gli oli centesimi dello spermatocita maturo crescono fino a circa 2,4 micron rispetto agli oli centesimi delle cellule di controllo, che raggiungono una lunghezza massima di 1,8 micron. Una volta masterizzata, la traccia A può essere eseguita in 20 minuti, la traccia B in 30 minuti e la traccia C in tre-cinque ore, a seconda della dimensione del campione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare il centrosoma in volo.