Ex Vivo Rilascio di peptide correlato al gene della calcitonina dal sistema trigeminovascolare nei roditori

Questo metodo è uno strumento per studiare i meccanismi coinvolti nel rilascio di CGRP dal sistema vascolare trigemino. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di dividere il sistema vascolare trigemino in tre diversi siti e valutare il rilascio del CGRP all'interno di ciascun sito distinto. A dimostrare la procedura saremo io e Inger Jansen-Olesen, uno scienziato senior del nostro gruppo.

Per iniziare, preparare il tessuto del ratto rimuovendo la pelle e il muscolo intorno alla testa e al collo usando le forbici. Quindi, utilizzare un trimmer osseo e un paio di forbici per separare le mascelle inferiori dalla testa. Ora esponi il midollo spinale e il tronco cerebrale inserendo un trimmer osseo caudalmente nella parte dorsale delle vertebre e rimuovilo.

Quindi tagliare la parte caudale del cranio dai bordi delle ossa occipitali e interparietali per rimuovere queste strutture ossee, esponendo il cervelletto. Per isolare la TNC che corre caudalmente a circa 13-16 millimetri dal bregma su ciascun lato, tagliare la parte dorsolaterale del tronco cerebrale con forbici a molla. Segue l'immersione del TNC sinistro e destro in SIF.

Quindi, tagliare la testa a metà per dividere il cranio in due usando una sega. Ora rimuovi con cura il cervello senza toccare la dura madre attaccata al cranio usando una spatola. Per isolare il TG, tagliarlo includendo i suoi rami attorno ai bordi visivi con il ramo mandibolare che entra nel forame ovale e i rami oftalmici e mascellari che entrano nel cranio.

Quindi immergere le metà del cranio e i TG in SIF. Per preparare il tessuto del topo, rimuovere la pelle e il muscolo intorno alla testa e al collo usando le forbici. Ora esponi il midollo spinale e il tronco cerebrale inserendo un paio di forbici caudalmente nella parte dorsale delle vertebre e rimuovilo.

Quindi tagliare la parte caudale del cranio dai bordi delle ossa occipitale e interparietale per rimuovere queste strutture ossee esponendo il cervelletto. Tagliare l'osso parietale a metà e rimuovere l'osso per esporre il cervello. Rimuovere con attenzione il cervelletto per esporre il tronco cerebrale usando una spatola.

Isolare il TNC contenente parte del tronco encefalico con forbici a molla, seguito da immergere il tronco encefalico in SIF. Ora rimuovi con cura il cervello usando una spatola e taglia il nervo trigemino dove entra nel tronco cerebrale. Per isolare il TG, tagliarlo includendo i suoi rami attorno ai bordi visivi con il ramo mandibolare dove entra nel forame ovale e rami oftalmici e mascellari che entrano nel cranio.

Quindi, immergi i TG in SIF. Per una facile sostituzione di SIF, aggiungere un coperchio di pedaggio ai contenitori di plastica e iniziare a lavare il tessuto di ratto e topo in SIF per 30 minuti sostituendo SIF ogni cinque minuti. Dopo 30 minuti di lavaggio a temperatura ambiente, trasferire le metà TNC del ratto e i TG del ratto per separare i tappi del tubo della microcentrifuga con 350 microlitri di SIF.

Trasferire il tronco cerebrale del topo con TNC in un tappo a tubo per microcentrifuga con 250 microlitri di SIF. Infine, trasferire i due TG del topo in un tappo a tubo microcentrifuga con 250 microlitri di SIF. Posizionare le metà del cranio di ratto su una piastra di coltura a sei pozzetti e riempire il cranio con 400 microlitri di SIF.

Posizionare i teschi di ratto in tappi di tubo di microcentrifuga con tessuto di ratto e topo in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius. Sostituire SIF utilizzando una pipetta ogni cinque minuti per 20 minuti senza toccare il tessuto. Preparare provette da microcentrifuga per la raccolta dei campioni mediante un'etichettatura appropriata.

Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone EIA da 10 forza a ciascuna provetta per microcentrifuga. Quindi, preparare la soluzione del composto in esame e la soluzione del veicolo diluendo in SIF per tutte le concentrazioni. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 250 microlitri di SIF al topo TG e TNC, 350 microlitri SIF al ratto TG e TNC e 400 microlitri SIF a ciascun cranio di ratto.

Dopo 10 minuti di incubazione, raccogliere 200 microlitri del campione in una provetta di microcentrifuga pre-etichettata con 50 microlitri di tampone EIA da 10 forza per consentire la misurazione del rilascio basale di CGRP. Scartare il liquido rimanente e conservare immediatamente i campioni a meno 20 gradi Celsius. Aggiungere il composto in esame nel veicolo corrispondente a concentrazioni crescenti, iniziando con la concentrazione più bassa, e incubare per 10 minuti.

Dopo 10 minuti di incubazione, raccogliere 200 microlitri del campione in una provetta di microcentrifuga pre-etichettata con 50 microlitri di tampone EIA da 10 forza. Scartare il liquido rimanente e aggiungere la seconda concentrazione più bassa al tessuto. Conservare immediatamente i campioni a meno 20 gradi Celsius e ripetere questa procedura con la concentrazione rimanente.

Per eseguire un controllo positivo per l'esperimento, aggiungere il controllo positivo al tessuto alla fine del protocollo. Dopo un periodo di incubazione di 10 minuti, raccogliere un campione da 200 microlitri in una provetta da microcentrifuga con 50 microlitri di tampone EIA da 10 forti. Le concentrazioni di CGRP rilasciate nei campioni raccolti vengono misurate utilizzando un kit EIA seguendo le istruzioni del produttore fornite con il kit EIA.

Nel ratto, l'esposizione alla capsaicina ha indotto un significativo rilascio di CGRP dalla dura madre e dalla TG rispetto al veicolo. Nella dura madre, il massimo rilascio di CGRP è stato trovato a un micromolare di capsaicina. E in TG, il massimo rilascio di CGRP è stato trovato a 10 micromolari di capsaicina.

Quando analizzata con un ANOVA unidirezionale, glibenclamide non mostra alcun effetto sul rilascio basale di CGRP da dura madre e TG. La glibenclamide ha ridotto significativamente il rilascio di CGRP indotto da capsaicina nella dura madre del 40% e il TG del 39% rispetto alla capsaicina con il veicolo quando analizzato con un ANOVA unidirezionale. È stato riscontrato che il potenziale recettore transitorio Ankyrin-1 agonista super cinnamaldeide rilascia CGRP in modo dipendente dalla concentrazione dal TG con 1, 10 e 100 micromolari di super cinnamaldeide con conseguente aumento del 9% 52% e del 69% del rilascio di CGRP rispetto al veicolo rispettivamente quando analizzato con ANOVA a due vie. L'aumento del rilascio di CGRP era assente in TG dai topi knockout del potenziale recettore transitorio Ankyrin-1 in cui l'esposizione a 1, 10 e 100 micromolari di super cinnamaldeide con conseguente variazione dell'11% meno 13% e 9% nel rilascio di CGRP rispetto al veicolo rispettivamente quando analizzato con ANOVA a due vie.

È importante fare attenzione a non toccare il tessuto durante la raccolta del campione e essere precisi quando si cronometra il tempo di incubazione per tutti i campioni. Se sono disponibili adeguati kit ELISA, è possibile applicare questa procedura per misurare il rilascio di altri peptidi presenti nel sistema vascolare trigemino.