Coltivare e manipolare geneticamente i nematodi entomopatogeni
31 marzo 2022
I nematodi entomopatogeni vivono in simbiosi con i batteri e insieme infettano con successo gli insetti minando il loro sistema immunitario innato. Per promuovere la ricerca sulle basi genetiche dell'infezione da nematodi, vengono descritti metodi per il mantenimento e la manipolazione genetica dei nematodi entomopatogeni.
Un protocollo efficace per mantenere e amplificare il nematode entomopatogeno è essenziale per comprendere le basi molecolari della patogenicità dei nematodi e dell'immunità anti-nematodi dell'ospite. Questo protocollo ci consente di produrre un elevato numero di Heterorhabditis bacteriophora simbiotici e ascinici e Steinernema carpocapsae IJ utilizzando l'ospite insetto, Galleria mellonella. Iniziate coprendo la capsula di Petri con un pezzo di carta da filtro e aggiungete circa 10-15 larve di Galleria mellonella.
Usando una pipetta, erogare due millilitri di acqua contenenti circa 25-50 giovani infettivi per 10 microlitri di sospensione sui vermi di cera. E conservare la capsula di Petri in un armadietto a temperatura ambiente. A seconda dell'umidità della carta da filtro, aggiungere uno o due millilitri di acqua ogni due giorni.
I vermi di cera infetti da giovani infettivi di solito muoiono entro 48 ore. Preparare le trappole d'acqua di White circa 10 giorni dopo che i vermi di cera sono stati infettati dai giovani infettivi. Trasferire con cura gli insetti morti sulla parte non imbevuta della carta da filtro.
Utilizzare l'acqua del rubinetto per riempire la capsula di Petri inferiore e posizionare un tappo di un tubo da 15 millilitri come distanziatore per la ventilazione. Utilizzare l'acqua del rubinetto invece dell'acqua demineralizzata o deionizzata per evitare l'aggregazione dei nematodi e assicurarsi che il livello dell'acqua nella trappola dell'acqua raggiunga circa la metà dell'altezza della capsula di Petri. Quando l'acqua nella piccola capsula di Petri diventa torbida a causa dei nematodi, utilizzare una pipetta per spostare la nuova generazione di giovani infettivi in un pallone di coltura cellulare T25 o T75.
Successivamente, aggiungere acqua del rubinetto fino al 40% di volume o fino a raggiungere la densità appropriata. E conservare il pallone di coltura cellulare orizzontalmente per evitare la congestione dei nematodi. Ripetere il trasferimento di novellame infettivo in palloni di coltura cellulare e l'aggiunta di acqua fino a quando i giovani infettivi smettono di emergere dalle carcasse di insetti in circa tre o cinque giorni.
Usando un ciclo di inoculazione, raschiare diversi fiocchi di una coltura congelata di Photorhabdus temperata Ret16 su una piastra MacConkey e una striscia per singole colonie. Incubare la piastra per due o tre giorni a 28 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, inoculare 10 millilitri di brodo LB con una colonia su agar MacConkey in un tubo da 50 millilitri e incubare la coltura durante la notte a 28 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante.
Dopo l'incubazione, trasferire 100 microlitri di coltura notturna da un tubo da 50 millilitri in un nuovo tubo microcentrifuga, quindi lavare 100 la coltura notturna con 900 microlitri di PBS a singola resistenza mediante centrifusione, in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, a 17.900 volte g. Decantare il surnatante. Quindi, diluire la coltura 10 volte in PBS a singola forza e lasciare il tubo sul ghiaccio.
Ora, immergere i vermi di cera in una soluzione di etanolo al 70%. Dopo aver asciugato gli insetti con un tovagliolo di carta, metterli in un tubo da 50 millilitri. Posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti per immobilizzare i vermi di cera.
Usa la carta da filtro per coprire la metà superiore e inferiore di una capsula di Petri. Utilizzare il coperchio della capsula di Petri coperto con carta da filtro come supporto di base per l'iniezione. Inumidire la carta da filtro della capsula di Petri inferiore e trasferirla sul ghiaccio per aiutare i vermi di cera iniettati a recuperare.
Pipettare 50 microlitri di batteri ghiacciati su un pezzo di Parafilm, quindi preparare una siringa ad ago raffinatore calibro 22 e premere delicatamente lo stantuffo per rimuovere l'aria sulla punta dell'ago. Mantenere un verme di cera vicino all'estremità posteriore sotto lo stereoscopio. Iniettare la coltura batterica nel lato dorsale del torace.
Preferibilmente alla giunzione tra due segmenti appena sotto la cuticola parallela al verme della cera per ridurre al minimo i danni interni e prestare attenzione a come il corpo larvale inizia a gonfiarsi. Quindi, trasferire gli insetti iniettati nella piastra di Petri di recupero. E una volta che tutti gli insetti vengono iniettati e collocati nel piatto di recupero, posizionare la capsula di Petri al buio.
I vermi di cera soccombono due giorni dopo l'iniezione e appaiono rosso mattone dopo circa tre o quattro giorni. Tuttavia, gli insetti di colore marrone indicano un'infezione batterica non riuscita. A sette giorni dall'infezione, trasferire gli insetti con il caratteristico colore rosso mattone su una capsula di Petri rivestita di carta da filtro fresca e ripetere la produzione di giovani infettivi al nematode simbiotico.
Per iniziare la sterilizzazione superficiale, raccogliere sufficienti simbiotici, heterorhabditis bacteriophora e candidati giovani infettivi axenici mediante centrifugazione. Per produrre un pellet in un tubo centrifugo da 1,5 millilitri, aggiungere 500 microlitri di candeggina al 5% al pellet in ciascun tubo microcentrifuga e invertire il tubo. Dopo l'incubazione per 10 minuti, centrifugare a 17.900 volte g per un minuto e rimuovere il surnatante.
Quindi lavare il pellet con un millilitro di acqua sterile. Centrifuga, rimuovi il surnatante e ripeti questa procedura altre quattro volte. Il grafico mostra i risultati della valutazione dello stato dei nematodi batteriofori eterohabditis che hanno subito l'axenizzazione.
Heterorhabditis bacteriophora dalla coltura stock trasportato cellule simbiotiche Photorhabdus luminescens. Tuttavia, i nematodi privi dei loro batteri Photorhabdus luminescens associati erano ascinici. Per mantenere la riproducibilità del tuo esperimento, striscia sempre fresco dalla coltura batterica di una colonia fresca ed estrai la coltura notturna prima che raggiunga la faccia stazionaria.
Usa solo il verme di cera Galleria rosso mattone per la trappola d'acqua di White e scarta il resto. Dopo questa procedura, i nematodi possono essere utilizzati per studiare l'interazione con il sistema immunitario degli insetti. Questa tecnica apre la strada al ricercatore per esplorare le basi molecolari del parassitismo dei nematodi e dell'immunità anti-nematode dell'ospite.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la conservazione e l'amplificazione di nematodi entomopatogeni, in particolare Heterorhabditis bacteriophora e Steinernema carpocapsae. Questi nematodi, in simbiosi con batteri, infettano efficacemente gli insetti eludendo le loro risposte immunitarie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Nematodi entomopatogeni
- Patologia degli insetti
- Relazioni simbiotiche
Sfondo
- I nematodi entomopatogeni sono utilizzati nel controllo biologico dei parassiti.
- Si avvalgono di batteri simbionti per infettare e uccidere gli ospiti insetto.
- Comprendere la loro manipolazione genetica può migliorare la ricerca sulla patogenicità dei nematodi.
- I protocolli per la loro manutenzione sono fondamentali per gli studi sperimentali.
Scopo dello studio
- Fornire metodi per il mantenimento e l'amplificazione di nematodi.
- Facilitare la ricerca sui meccanismi di infezione dei nematodi.
- Esplorare la base genetica delle interazioni ospite-nematode.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di larve di Galleria mellonella come ospiti per l'amplificazione di nematodi.
- Distribuzione di forme giovanili infettive sulle larve in un ambiente controllato.
- Monitoraggio dei livelli di umidità nell'allestimento della coltura.
- Conservazione delle colture a temperatura ambiente per una crescita ottimale.
Risultati principali
- Mantenimento efficace di elevate quantità di nematodi simbiotici e asseptici.
- Il protocollo consente una produzione efficiente di giovani infettivi.
- Fornisce le basi per ulteriori studi sulla patogenicità dei nematodi.
- Migliora la comprensione delle risposte immunitarie dell'ospite alle infezioni da nematodi.
Conclusioni
- I metodi descritti sono efficaci per la coltivazione e l'amplificazione di nematodi.
- La ricerca sulla genetica dei nematodi può portare a progressi nel controllo dei parassiti.
- Comprendere le interazioni tra nematodi e ospiti è fondamentale per la ricerca biologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La coltivazione affidabile e la manipolazione genetica dei nematodi entomopatogeni permettono un'analisi sistematica delle interazioni ospite-patogeno e la validazione funzionale di bersagli nella fase iniziale della scoperta. Questo protocollo consente la generazione di popolazioni di nematodi sia simbiotiche sia asessuate, facilitando l'eliminazione dei fattori di rischio meccanicistici e aumentando la prevedibilità nei studi sulla patogenicità dei nematodi e sulle risposte immunitarie dell'ospite. L'approccio garantisce continuità alla ricerca traslazionale fornendo sistemi biologici standardizzati per lo screening successivo e la caratterizzazione molecolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette la disamina funzionale dei fattori di infezione dei nematodi mediante silenziamento genico e assestamento asseptico.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistico isolando i contributi del nematode e dei batteri alla risposta dell'ospite.
- Facilita studi basati su ipotesi sulle interazioni molecolari tra ospite e patogeno.
- Fornisce un sistema riproducibile per la validazione di bersagli candidati nella biologia dei nematodi.
Sviluppo di screening e saggi
- Genera popolazioni standardizzate di giovani infettivi per saggi quantitativi di infezione.
- Permette la riproducibilità e la scalabilità nei test fenotipici di mutanti dell'ospite o di nematodi.
- Consente la preparazione di nematodi aspecifici e simbiotici per lo sviluppo comparativo di saggi.
- Fornisce materiale biologico validato per analisi molecolari e trascrittomiche successive.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per la malattia modellando le risposte immunitarie dell'ospite all'infezione da nematodi.
- Supporta la scoperta traslazionale di biomarcatori attraverso studi di infezione controllata e silenziamento genico.
- Permette una continuità dalla scoperta meccanicistica alla validazione preclinica di interventi anti-nematodi.
- Riduce l'ambiguità biologica nello sviluppo di modelli preclinici standardizzando gli input di nematodi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso di scoperta, che va dagli studi meccanicistici iniziali allo sviluppo di modelli preclinici, sostenendo sia la validazione della proteina bersaglio che la preparazione del saggio.
- Biologia della Scoperta: Fornisce una piattaforma per il test dell'ipotesi nulla riguardo ai fattori di infezione dei nematodi e alle risposte dell'ospite.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per saggi comparativi di infezione e studi sulla funzione genica.
- Analisi: Consente la misurazione degli esiti di infezione e dei parametri molecolari per l'analisi statistica.
- Ricerca Translazionale: Collega la ricerca di base e quella preclinica permettendo la manipolazione controllata delle variabili di infezione.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per la coltura dei nematodi e la manipolazione genetica in diversi programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi su ospite-patogeno.
- Valore operativo: Standardizza la produzione di nematodi e la manipolazione genetica per ottenere risultati di ricerca riproducibili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale consentendo una valida caratterizzazione funzionale e la conferma robusta dei bersagli.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli interventi anti-nematodi o mirati all'ospite, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in biologia dei nematodi, microbiologia e tecniche di manipolazione genetica.
- Necessita dell'accesso a ospiti insetto, strutture per colture sterili e strumentazione per biologia molecolare.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra gruppi di lavoro riguardo alle condizioni di coltura di nematodi e batteri.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse specie di nematodi o modelli di ospite.
- Le limitazioni includono la necessità di un attento controllo tra stati simbiotici e aseni e la riproducibilità dell'infezione.
