Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia e delle interazioni con le sinapsi nella retina murina malata

L'ambito della ricerca del nostro laboratorio è studiare i meccanismi sottostanti del glaucoma e della microglia nella rimodellazione delle sinapsi durante lo sviluppo. Le attuali sfide sperimentali ruotano attorno al fatto che la microglia stia attivamente scomponendo le sinapsi delle cellule ganglionari retiniche o se stiano semplicemente eliminando passivamente i detriti. Inizia con la retina del topo posizionata su una carta filtrante e asciugala con una salvietta da laboratorio.

Inverti la retina su una piastra di Petri MatTek. Appesantisci la retina usando palline di metallo o un anello. Poi, aggiungi da tre a cinque gocce di liquido cerebrospinale artificiale.

Posiziona il campione sotto un microscopio confocale a disco rotante e regola le impostazioni per visualizzare in anteprima la retina. Raccogli immagini lungo l'asse Z a una profondità totale di 10-20 micrometri utilizzando una dimensione di passo di 0,3 micrometri. Mantenere l'intervallo di tempo tra i fotogrammi e l'altro tra 20 e 30 secondi per consentire un tracciamento delle celle affidabile.

Per eseguire il rendering superficiale delle microglia, converti il file time lapse in formato IMS utilizzando il software di conversione file. Inserisci le dimensioni dei voxel in base alle proprietà dell'immagine acquisite in precedenza. Nel campo del software di analisi, clicca sulla cartella osservazione per aprire il file convertito e assicurarti che l'immagine sia in visualizzazione 3D.

Per rilevare singoli microgli, clicca sull'icona aggiungi nuova superficie nella barra degli oggetti. Seleziona il segmento solo in una regione di interesse, traccia le superfici nel tempo, classifica le superfici e le statistiche oggetto-oggetto nelle impostazioni dell'algoritmo. Poi, clicca sul pulsante blu play per proseguire.

Scegli il canale per il rendering delle superfici. Opzionalmente, abilita il liscio per levigare la creazione della superficie e entrare nel dettaglio della superficie. Sotto la soglia, scegli segmentazione di machine learning per rilevare le celle.

Sotto dati di addestramento, usa gli strumenti pennello di sfondo e in primo piano. Disegna i pennelli selezionando il pennello desiderato e usando shift più il clic sinistro. Assicurati che il display interpolate sia attivato, poi seleziona il train e prevedi.

Usa il puntatore giallo al centro per orientarti sull'asse Z. Disegna più tratti sui piani X, Y e Z, e su diversi intervalli temporali. Usa da tre a cinque tratti brevi per ogni ingresso, regolando iterativamente fino a ottenere una superficie accurata.

Usa il rettangolo giallo per alternare tra il display di addestramento e la superficie reale creata come controllo finale. Controlla anche nel time lapse che la superficie corrisponda alla morfologia cellulare. Una volta fatto, deseleziona gli oggetti separati.

Regolare la soglia dell'istogramma voxel per rimuovere piccoli oggetti non collegati che non fanno parte della superficie primaria. Poi, modifica manualmente la superficie per rimuovere oggetti superflui o tagliare i bordi usando lo strumento forbice. Se desiderato, stabilire una soglia di spazi consentiti per l'oggetto e selezionare l'algoritmo di tracciamento per la cella in movimento.

Traccia i filtri degli oggetti non associati alla superficie principale. Una volta terminato, imposta il display delle celle mobili su un profilo trasparente per visualizzare i punti per i passaggi successivi. Per rilevare un singolo punto PSD95, clicca sull'icona della superficie blu nella barra degli oggetti.

Poi, seleziona gli spot delle piste nel tempo, classifica gli spot e le statistiche oggetto-oggetto e premi play. Seleziona il canale sorgente per il marcatore sinaptico. Disattiva lo slicer e gli altri canali per visualizzare solo il PSD95.

Usa il pulsante di controllo e lo strumento di selezione del puntatore per stimare il diametro XY del punto. Scegli alcuni punti luminosi che persistono attraverso i fotogrammi e disattiva la sottrazione sullo sfondo. Poi, aggiungi un filtro basato sulla qualità del punto.

Regola l'istogramma per includere punti PSD95 accurati su tutti i periodi temporali. Rimuovi le macchie di falsi positivi tramite modifica. Alterna tra il cursore cubico o circolare per eliminare punti che durano solo uno o due fotogrammi.

Se desiderato, stabilire una soglia di spazi permessi e scegliere l'algoritmo di tracciamento per i punti sinaptici. Filtrare tracce spot non associate a puncta reali usando una soglia di istogramma per escludere tracce di oggetti piccoli. Definire le classificazioni usando la distanza più breve dalla classificazione superficiale.

Impostata come qualsiasi punto inferiore a zero micrometri, contattata approssimativamente tra zero e 0,5 micrometri dalla superficie, e non contattata come più di 0,5 micrometri. Assegna etichette agli eventi usando le classificazioni sopra trovate. Una volta che le superfici e i punti rappresentano correttamente microglia e punti, esporta tutte le statistiche nella scheda statistiche.

La microglia ha mostrato un aumento della lunghezza dello spostamento del processo dopo l'ipertensione oculare indotta da laser rispetto al controllo. La velocità microgliale era significativamente superiore negli occhi trattati con laser rispetto ai controlli. Il numero di eventi di contatto tra microglia e punti PSD95 è aumentato dopo il trattamento laser.

Le registrazioni time-lapse hanno mostrato che le retine trattate con laser mostravano una maggiore motilità microgliale e un'interazione aumentata con i punti PSD95 rispetto alle retine di controllo. I nostri risultati significativi hanno mostrato un aumento del numero di microglie, della complessità e della motilità, e della colocalizzazione sinaptica dopo l'aumento transitorio della pressione intraoculare nei topi. Il nostro protocollo offre imaging ex vivo, che aiuta a evitare problemi di opacità di cataratta e cornea, consentendo una configurazione più semplice per esperimenti più rapidi e una maggiore produttività complessiva.

I nostri risultati fanno avanzare la ricerca permettendo la visualizzazione delle interazioni microglia-neuroni, della comunicazione e della dinamica cellulare tramite linee fluorescenti transgeniche, oltre a immagini time-lapse ad alta risoluzione.