Name: Simultanea a due fotoni In Vivo Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Impara la craniotomia per l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo mediante microscopia a due fotoni in vivo. Questo metodo consente il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza.

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Gli autori desiderano ringraziare M. Steczkowski per registrazioni vocali, M. Borczyk per i disegni, A. Trąbczyńska per la produzione di virus, M. Ziókowska per la genotipizzazione e A. Mirgos per l&#39;assistenza con le riprese. KR riconosce il dono tipo di virus adeno-associato ricombinante (rAAV) che esprime una proteina fluorescente mCherry sotto il controllo del promotore CaMK da K. Deisseroth. Questo progetto è stato realizzato presso le strutture fondamentali del Laboratorio di modelli animali e laboratorio di tessuti Struttura e funzione, Centro di Neurobiologia, Nencki Istituto di Biologia Sperimentale, con l&#39;utilizzo delle infrastrutture Cept finanziato dall&#39;Unione Europea - Fondo Europeo di Sviluppo regionale all&#39;interno del programma operativo &quot;Economia innovativa&quot; per il periodo 2007-2013. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 per KR e Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC

Tutte le procedure sperimentali descritte di seguito sono stati approvati dal Comitato Etico Locale presso l&#39;Istituto Nencki of Experimental Biology, Accademia polacca delle scienze. Nota: Alcune delle scene del video associato sono accelerati. Fattore di velocità è indicata in queste scene. 1. Chirurgia Preparazione <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti, contenitori di vetro per liquidi e tamponi di cotone in autoclave. Utilizzare guanti superflui. Pulire il tavolo operatorio, il telaio stereotassico e tutta l&#39;area circostante con il 70% di etanolo. Utilizzare un tampone sterile chirurgica per creare uno spazio sterile per tutte le attrezzature sterilizzato. Tagliare Gelfoam in piccoli pezzi e ammollo in soluzione fisiologica sterile. Nota: Secondo la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, l&#39;etanolo non è né un sterilizzante, né un disinfettante di alto livello. Dovrebbe essere usato solo come un detergente / sgrassante su superfici già sterilizzati. </li><li> Mettere l&#39;animale in the camera di induzione e impostare il livello isoflurano al 5% e il flusso di ossigeno a 2 L / min. Questa procedura dovrebbe durare circa 3 min. </li><li> Prendere l&#39;animale dalla camera di induzione. Utilizzare coda o punta pizzicotti per garantire che l&#39;animale è completamente sedato. </li><li> Utilizzando un trimmer precisa radere i capelli dalla parte posteriore della testa (tra le orecchie) fino agli occhi. </li><li> Posto l&#39;animale nel telaio stereotassico e stabilizzare la testa con barre orecchio. </li><li> Impostare i livelli di anestesia per 1,5-2% isoflurano e 0.3 L / min di ossigeno. </li><li> Applicare l&#39;unguento oculare. </li><li> Iniettare il sottocutanea animale con Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) e Baytril (5 mg / kg) per prevenire l&#39;infiammazione, il dolore e l&#39;infezione, rispettivamente. </li><li> Iniettare il intramuscolare animale con desametasone (0,2 mg / kg) per prevenire il gonfiore cervello. Nota: È possibile iniettare desametasone per via sottocutanea o intraperitoneale per evitare danni muscolari. </li><li> Pulire la pelle con stamponi di cotone terile con Betadine seguita da etanolo al 70%. </li><li> Cambiare i guanti e spruzzarli con il 70% di etanolo. Nota: Durante l&#39;utilizzo di guanti usa e getta non toccare il campo sterile. Toccare l&#39;animale solo con le punte di strumenti chirurgici sterili e tamponi sterili. </li></ol> Chirurgia 2. cranica finestra <ol><li> Sollevare la pelle con una pinza e utilizzando microorganismi forbici incidere la pelle orizzontalmente lungo la base della testa e poi obliquamente al punto fronte tra gli occhi. Rimuovere il lembo cutaneo. </li><li> Applicare lidocaina pomata con un tampone sterile sul periostio per evitare un eccessivo sanguinamento e dolore. </li><li> Usare tamponi di cotone sterili o un bisturi per rimuovere il periostio. Asciugare il cranio con tamponi sterili. </li><li> Utilizzando un ago sterile applicare colla cianoacrilato densa sui bordi della pelle per immobilizzare loro e per evitare il contatto con il cemento dentale. Attendere che la colla si asciughi. </li><li> Lay uno sterile 3 millimetri coprioggetti sopra tegli cranio anteriormente alla sutura lambdoidea. Centrare il vetrino a RSC coordinate: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Mark bordi coprioggetto da graffiare la superficie del cranio con un ago sterile. Mettere il coprioggetti nel contenitore sterile, con il 70% di etanolo. </li><li> Utilizzare un trapano dentistico ad alta velocità con una piccola bava di diametro per delineare un cerchio del diametro di 3 mm. Pulire il sito di perforazione dalla polvere di osso con soluzione salina sterile tamponi immersi. Utilizzare il Gelfoam e tamponi per fermare l&#39;emorragia occasionale e pulire l&#39;osso. </li><li> Tra foratura controllare lo spessore osseo con una pinza sottile toccando delicatamente il cerchio dell&#39;osso e controllando la sua mobilità. Tenere presente che l&#39;osso è più spessa sulla superficie della sutura. Fermare la perforazione quando il cerchio osso è mobile e solo un pari, sottile strato di tessuto osseo viene lasciato sulla circonferenza. Pulire il campo operativo di tutta la polvere osso residuo con soluzione salina immerso tamponi. </li><li> Eliminare la soluzione salina sterile nella zona di perforazione, che copre il cir foratoCLE. Scalzare con cura il cerchio osso con una pinza sottile e poi delicatamente ma con fermezza rimuovere l&#39;osso sollevandolo verso l&#39;alto. Fare attenzione a non inclinare il cerchio osso mentre lo si solleva per evitare possibili danni alla dura. </li><li> applicare delicatamente la Gelfoam imbevuta di soluzione salina sterile sulla dura per aiutare a fermare l&#39;emorragia. Attendere fino a quando tutto il sanguinamento è completamente interrotta. Rimuovere con attenzione il Gelfoam non disturbare il processo di coagulazione. Nota: l&#39;area di sutura è altamente vascolarizzata, in modo che il sanguinamento a questo punto potrebbe rivelarsi profonda. È indispensabile attendere il tempo sufficiente per il sanguinamento si fermi completamente. È utile mantenere l&#39;Gelfoam imbevuta di soluzione salina raffreddato mettendolo in ghiaccio. </li></ol> 3. Virus iniezione <ol><li> Fissare la pompa di infusione alla torre stereotassica e collegare il controller. </li><li> Inserire l&#39;ago 35G nella siringa. Lavare la siringa 10 volte con etanolo per sterilizzare e 10 volte con soluzione salina sterile per rimuovere le tracce di ethanol. Rimuovere le bolle d&#39;aria dalla siringa. Inserire la siringa nella pompa. Nota: Si consiglia di utilizzare altri disinfettanti. </li><li> Scongelare una singola dose di rAAV2 / 1 preparazione mCherry (si consiglia 10 12 pfu) e tenerlo in ghiaccio. Riempire la siringa con la soluzione di virus. </li><li> Centrare l&#39;ago sulla bregma e quindi inserire delicatamente nella ippocampo utilizzando le seguenti coordinate: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Queste coordinate saranno situati vicino al bordo della craniotomia. Attendere per 5 minuti per il tessuto si stabilizzi. </li><li> Iniettare 0,7 ml di soluzione di rAAV2 / 1 mCherry alla velocità di 50 nl / min. Attendere 10 minuti per il virus di adsorbire completamente. Rimuovere delicatamente l&#39;ago. Tamponare con Gelfoam in caso di sanguinamento. Ripetere con il sito controlaterale. </li></ol> 4. cranica Finestra Implantation <ol><li> Lay sterile, coverglass secca sulla parte superiore della dura nel telaio del cerchio forato. Tenere il coprioggetti con la forceps per appiattire delicatamente la dura e portare coverglass &#39;bordi più vicino alla superficie del cranio. Nota: E &#39;possibile che il coprioggetti sconvolge il coagulo e la riprende sanguinamento. Se questo è il caso, sollevare il coprioggetti, metterlo in alcool, asciutto e tornare al punto 2.9. </li><li> Usando un ago sterile applicare la colla cianoacrilato densa sui bordi di coperture vetrose per il fissaggio al cranio. Attendere che la colla si asciughi. </li><li> Mettere una barra di fissaggio (M2 dado o un disegno su ordine) nella parte anteriore del cranio. Applicare la colla cianoacrilato oltre i bordi della barra. Attendere che la colla si asciughi. <ol><li> Posizionare la barra di fissaggio in una posizione che consenta il posizionamento orizzontale della finestra cranica durante l&#39;imaging sessione. Posizionare il più lontano possibile dal finestrino. Se è posizionato troppo vicino alla finestra, la barra e la vite di collegamento con il supporto misura potrebbero rappresentare un ostacolo per l&#39;obiettivo durante il processo di imaging. </li></ol></li><li&gt; Preparare la acrilico dentale e applicarlo sulla superficie del cranio intorno al bicchiere. È utile per formare una figura crateriforme intorno alla finestra. Si creerà una cavità di acqua applicata successivamente per l&#39;imaging con l&#39;obiettivo di acqua. </li><li> Creare un berretto con l&#39;acrilico dentale, che copre il resto della zona operativa, bordi cutanei, bar fissazione, rafforzando il cratere intorno alla finestra cranica. Attendere che il cemento dentale per indurire. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dal telaio stereotassico e metterlo nella camera di recupero. </li><li> Attendere che l&#39;animale per recuperare da un intervento chirurgico nel rispetto delle funzioni fisiologiche. </li><li> Applicare analgesia post-operatoria (carprofen, 10 mg / kg) e il trattamento antibiotici (Baytril, 5 mg / kg) per 48 ore. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Avviare il laser Ti: zaffiro, accendere il microscopio. Il sistema utilizzato in questo esperimento è dotato di un laser a due fotoni, sistema OPO e doppio PMT GaAsP. </li><li> Mettere l&#39;animale nella Induccamera di e indurre l&#39;anestesia. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dalla camera di induzione e posto nella maschera anestesia gas sotto il microscopio. Diminuire il flusso di ossigeno al 0,3 L / min e la concentrazione isoflurano al 1,5-2%. </li><li> Fissare l&#39;animale a stativo personalizzato con una vite M2 (o un altro sistema personalizzato). Livellare la finestra del cranio. Nota: È possibile utilizzare il sistema di fissaggio della testa del produttore microscopio, anche se il telaio personalizzato specifico dà risultati migliori (migliore stabilità testa, costante posizionamento in più sessioni durante un esperimento cronica). </li><li> Utilizzando le impostazioni del microscopio widefield e un basso centro obiettivo di ingrandimento della vista su uno dei lati della corteccia retrosplenial e concentrarsi sulla superficie vetrino. </li><li> Applicare una goccia d&#39;acqua nel pozzo acrilico crateriforme. Passare a un obiettivo di immersione in acqua a lunga distanza. Spostare l&#39;obiettivo verso la finestra del cranio fino a quando l&#39;aria l&#39;acqua del meniscoUnisce il campione e obiettivo. </li><li> Passare alle impostazioni di due fotoni e iniziare la scansione del campione superiore a fondo utilizzando lo zoom più basso. La traversata di dura madre sarà visibile come un bagliore di segnale non specifico alta. </li><li> Regolare le impostazioni di acquisizione microscopio in entrambi i canali (GFP e mCherry) secondo la potenza del segnale da cellule fluorescenti in modo da coprire l&#39;intera gamma dinamica. </li><li> Dopo aver trovato un neurone adeguata (con l&#39;albero dendritiche separata da altre cellule) eseguire una scansione iniziale utilizzando solo il filterset GFP con lo zoom più basso e Z-distanza di 5 micron. </li><li> Ottenere una proiezione massima dello stack scansionato e stamparlo per le annotazioni (utilizzando colori invertiti). </li><li> Impostare lo zoom su un valore che permetterà di immagine i dettagli morfologici desiderati. Immagine l&#39;intero albero dendritiche nei canali GFP e mCherry con proiezione massima di guida. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li>
<li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li>
<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

Gli autori (KL, MR, KR) hanno diritti di brevetto in sospeso (PL410001) per fotogramma Holder usato in questo articolo.

Nel documento corrente vi presentiamo un protocollo per la simultanea a due fotoni imaging in vivo degli ingressi sinaptici e gli obiettivi post-sinaptici in RSC attraverso una finestra cranica. La procedura di impianto è composto da diversi passaggi chiave. Innanzitutto, l&#39;animale è profondamente anestetizzati e fissato nel telaio stereotassico, poi il cranio sopra RSC viene diluito con un trapano lungo le linee circolari segnalati e l&#39;osso circolare viene rimosso. Dopo l&#39;emorragia viene arrestato,...

Microscopia a due fotoni rivoluzionato l&#39;osservazione di attività cerebrale nel vivere e di comportarsi animali. Dalla sua introduzione nel 1990 ha rapidamente guadagnato popolarità ed è ora implementato come uno degli approcci più interessanti e innovative verso l&#39;esame di numerosi aspetti dell&#39;attività cerebrale in vivo 1,2. Queste applicazioni includono le misurazioni del flusso sanguigno, attivazione neuronale (ad esempio, utilizzando indicatori di livello di calcio o di geni precoci immediati espressione) e la morfologia delle cellule neuronali. Un numero crescente di laboratori utilizzano microscopi a due fotoni, l&#39;attuazione della tecnica in tutto il mondo scientifico come un nuovo standard per l&#39;imaging in vivo del cervello. L&#39;approccio standard prevede l&#39;impianto della finestra del cranio (un foro rotondo nel cranio coperto con una copertura in vetro) oltre il barile o corteccia visiva del cervello di topo 3. Successivamente, a seconda del protocollo sperimentale, il mouse subisce una serie di visualizzazione e allenamenti comportamentali, consentendo di monitorare i cambiamenti nell&#39;attività cerebrale e la morfologia neuronale nel tempo 4,5. In entrambi i casi il craniotomia interessa solo l&#39;osso parietale, senza attraversare le suture. È ampiamente ritiene che il principale svantaggio di questa tecnica è la limitata applicazione cortecce facilmente accessibili come il barile o corteccia visiva. L&#39;impianto della finestra del cranio su altre regioni pone molte difficoltà, a causa di eccessivo sanguinamento e / o ostacoli spaziale. In questo articolo si propone l&#39;impianto della finestra del cranio sopra la corteccia retrosplenial (RSC) come un&#39;altra possibile regione di interesse per due fotoni in vivo microscopia a 6. RSC è un elemento importante del circuito di cervello responsabile per la formazione della memoria spaziale. Anatomicamente, RSC è una parte di una rete neuronale che collega corticale, ippocampo, talamo e le regioni 7. Èpesantemente coinvolti in una serie di comportamenti, quali l&#39;apprendimento spaziale e l&#39;estinzione, così come la navigazione spaziale 6. Al fine di visualizzare i cambiamenti morfologici dei neuroni che usiamo una linea di topo transgenico che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il promotore Thy1. In questi topi, GFP è espressa in circa il 10% dei neuroni nel cervello consentendo chiara visualizzazione degli assoni e dendriti corticali utilizzando microscopia a due fotoni 8. Un&#39;altra innovazione che vi proponiamo è l&#39;iniezione di un ricombinante adeno-associato virus sierotipo 2/1 (rAAV2 / 1) che codifica una proteina fluorescente rossa (mCherry) in una specifica-neurone CaMKII promotore 9 nelle strutture profonde del cervello sporgenti di RSC , come l&#39;ippocampo. L&#39;espressione di rAAV2 / 1 mCherry nell&#39;ippocampo di topo Thy1-GFP permette la visualizzazione simultanea di elementi pre-e post-sinaptici del Hippocampo-cortical sinapsi 10. L&#39;espressione rAAV-driven di mCherry richiede due o tre settimane per la proteina di raggiungere livello sufficiente nei terminali degli assoni. Questo periodo è coerente con il solito tempo richiesto per il recupero di craniotomia.

<table><tbody><tr><td><forte>Farmaco</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% preoperatorio</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1,5-2% durante l'intervento</td></tr><tr><td>chirurgico Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0,2 mg/kg intramuscolare</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2,50%</td><td>5 mg/kg per via sottocutanea</td></tr><tr><td>Tolfedina</td><td>Vetoquinolo</td><td>4%</td><td>4 mg/kg per via sottocutanea</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg per via sottocutanea</td></tr><tr><td>Carprofene</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50 mg/ml</td><td>10 mg/kg per via sottocutanea</td></tr><tr><td>Lidocaina</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td> per <td>via topica</td></tr><tr><td>Lidocaina</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>per via topica</td></tr><tr><td>Chirurgia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>per via topica</td></tr><tr><td>Colla CA</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrilico</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Montatura stereotassica</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>HSE-64-0720</td><td></td></tr><tr><td>Trapano dentale</td> da 3 mm di diametro <td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Barra di fissaggio Su</td><td>misura</td><td>N/A</td><td>Potrebbero essere utilizzati dadi a vite M2 o M3</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro forbici</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telaio di supporto</td><td>Microscopio N/A</td><td></td><td>a</td></tr><tr><td>due fotoni</td> su misura <td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Unità laser: Camaleonte coerente 690-1040nm con oscillatore parametrico ottico 1050-1300nm. Obiettivi: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 e LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Rilevamento: filtri passa-banda Zeiss BP 500-550 (GFP) e BP 570-610 (mCherry) separati da beam splitter a 560nm e accoppiati a due fotorivelatori GaAsP.</td></tr><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dono del virus</td> da <td>K. Deisseroth</td><td></td><td>Virus adeno-associato ricombinante (rAAV) che esprime la proteina fluorescente mCherry sotto il controllo del promotore CaMK</td></tr></tbody></table>

simultanea a due fotoni<em&gt; in vivo</em&gt; imaging di synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo (RSC) utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea di topi transgenici Thy1-GFP. Questo approccio crea la possibilità di studiare la correlazione delle manipolazioni comportamentali con i cambiamenti nella morfologia neuronale in vivo.
La procedura di impianto della finestra cranica è stata considerata limitata solo alle regioni della corteccia facilmente accessibili come il campo del barile. Il nostro approccio consente la visualizzazione dei neuroni nell'RSC altamente vascolarizzato. L'RSC è un elemento importante del circuito cerebrale responsabile della memoria spaziale, precedentemente ritenuto problematico per l'imaging a due fotoni in vivo.
L'impianto della finestra cranica sopra l'RSC è combinato con un'iniezione di virus adeno-associato ricombinante che esprime mCherry (rAAVmCherry) nell'ippocampo dorsale. L'mCherry espresso si diffonde alle proiezioni assonali dall'ippocampo all'RSC, consentendo la visualizzazione dei cambiamenti sia nei bottoni assonali presinaptici che nelle spine dendritiche postsinaptiche nella corteccia. 
Questa tecnica consente il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

L&#39;espressione di GFP in un sottoinsieme di neuroni nel topo giornalista Thy1-GFP permette imaging in vivo dei dendriti corticali e proiezioni assonale locali a RSC. Figura 1A mostra proiezione massima di una pila di immagini con più dendriti GFP-positive visibili. Il corpo cellulare è oscurata da un&#39;arteria. Figura 1B mostra un&#39;immagine ingrandita solo piano (zoom digitale 3x) del ramo dendritico indicato 1A. Dettagli di morfologia d...

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Tutte le procedure sperimentali descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Etico Locale presso l'Istituto Nencki di Biologia Sperimentale, Accademia Polacca delle Scienze. Questo video mostra la procedura di craniotomia che permette l'immagine cronica dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo mediante microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica thi one-G di feet. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato, AAV, esprimente mCherry nell'ippocampo dorsale.Combinando insieme queste tecniche, è possibile effettuare un monitoraggio a lungo termine della dipendenza sperimentata e della plasticità strutturale nella corteccia retrospleniale. In questo articolo, proponiamo l’impianto di una finestra cranica sopra la corteccia retrospleniale come regione di interesse non solo possibile per la microscopia in vivo a due fotoni. Al fine di visualizzare i cambiamenti morfologici nelle strutture neuronali, utilizziamo topi di linea B uno-G con espressione della proteina fluorescente GFP in circa il 10 percento dei neuroni nel cervello.Un'altra innovazione che proponiamo è l'iniezione di un AAV, esprimente una proteina fluorescente mCherry sotto un promotore specifico per neuroni, in strutture profonde del cervello, come l'ippocampo, al fine di visualizzare le proiezioni di questa struttura nella corteccia retrospleniale. Sterilizzare tutti gli strumenti, i contenitori di vetro per liquidi e i bastoncini di cotone in autoclave. Indossare guanti monouso.Pulire il tavolo operatorio, il telaio stereotassico e tutta l'area circostante con etanolo al 70%. Utilizzare un tappetino chirurgico sterile per creare uno spazio sterile per tutti gli strumenti sterilizzati. Tagliare la schiuma di gel in piccoli pezzi e immergerli in soluzione fisiologica sterile.Posizionare l'animale nella camera di induzione e impostare il livello di isoflurano al 5% e il flusso di ossigeno a due litri al minuto. Questa procedura dovrebbe richiedere circa tre minuti. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione.Utilizzare pizzichi sulla coda o sulle dita dei piedi per assicurarsi che l'animale sia completamente sedato. Utilizzando forbici precise, rasare i peli sulla parte posteriore della testa, tra le orecchie, fino agli occhi. Posizionare l'animale nel telaio stereotassico e stabilizzare la testa con le barre auricolari.Impostare i livelli di anestesia al 1,5-2% di isoflurano e 0,3 litri al minuto di ossigeno. Applicare il pomata oculare. Iniettare l'animale per via sottocutanea con tolfedina, 4 milligrammi per chilogrammo, buprenorfina, 2 milligrammi per chilogrammo, e Baytril, 5 milligrammi per chilogrammo, per prevenire rispettivamente infiammazione, dolore e infezione.Somministrare all'animale dexametasona per via intramuscolare, zero virgola due milligrammi per chilogrammo, per prevenire il gonfiore cerebrale. Pulire la cute utilizzando tamponi di cotone sterili con betadina seguiti da etanolo al 70%. Cambiare i guanti e spruzzarli con etanolo al 70%.Sollevare la pelle con una pinzetta e, utilizzando forbici microchirurgiche, effettuare un'incisione orizzontale lungo la base della testa e quindi obliqua fino al punto anteriore tra gli occhi. Rimuovere il lembo cutaneo. Applicare un unguento a base di lidocaina con un batuffolo sterile sul periostio per prevenire sanguinamenti eccessivi e dolore.Utilizzare tamponi di cotone sterili o un bisturi per rimuovere il periostio. Asciugare il cranio con tamponi sterili. Utilizzando un ago sterile, applicare una colla densa a base di cianoacrilato sui margini della pelle per immobilizzarli e impedire ulteriori contatti con il cemento dentale.Attendere che la colla si asciughi. Posizionare un vetrino sterile da tre millimetri sul cranio anteriormente alla sutura lambdoidea. Centrare il vetrino alle coordinate retrospleniali, anteriore-posteriore rispetto al bregma meno due virgola otto, mediale-laterale rispetto al bregma zero.Segnare i bordi del vetrino graffiando la superficie del cranio con un ago sterile. Riposizionare il vetrino nel contenitore sterile contenente etanolo al 70%. Utilizzare un trapano dentale ad alta velocità con una fresa di piccolo diametro per delineare un cerchio di tre millimetri di diametro.Pulire il sito di trapanazione dalla polvere ossea utilizzando tamponi sterili imbevuti di soluzione salina. Utilizzare la spugna di gel e i tamponi per arrestare eventuali sanguinamenti e pulire l'osso. Durante le pause della trapanazione, verificare lo spessore dell'osso con pinzette fini toccando delicatamente il cerchio osseo e controllandone la mobilità.Tenendo presente che l'osso è più spesso nella zona delle suture, interrompere la perforazione quando il cerchio osseo è mobile e rimane solo uno strato sottile e uniforme di osso lungo la circonferenza. Pulire il campo operatorio da tutta la polvere ossea residua utilizzando tamponi imbevuti di soluzione fisiologica.Lasciare cadere il soluzione salina sterile sull'area di trapanatura, coprendo il cerchio trapanato. Sollevare con attenzione il cerchio osseo con una pinzetta fine e quindi rimuoverlo delicatamente ma con fermezza sollevandolo verso l'alto. Prestare attenzione a non inclinare il cerchio osseo durante il sollevamento per evitare possibili danni alla dura madre.Applicare delicatamente sulla dura il gel spugnoso imbevuto di soluzione salina sterile per aiutare a fermare l'emorragia. Attendere fino a quando l'emorragia si è arrestata completamente. Rimuovere con attenzione il gel spugnoso per non disturbare il processo di coagulazione.Notare che l'area della sutura è altamente vascolarizzata, quindi il sanguinamento in questa sede potrebbe risultare abbondante. È essenziale attendere un tempo sufficiente affinché il sanguinamento si arresti. Collegare la pompa per infusione alla torre stereotassica e connettere il controllore.Inserire l'ago da 35 gauge nella siringa di riempimento. Sciacquare la siringa 10 volte con etanolo per sterilizzarla e 10 volte con soluzione salina sterile per rimuovere le tracce di etanolo. Rimuovere le bolle d'aria dalla siringa.Inserire la siringa nella pompa. Riempire una singola dose di preparato AV e mantenerla sul ghiaccio. Riempire la siringa con la soluzione virale.Centrare l'ago sul bregma e quindi inserirlo delicatamente nell'ippocampo utilizzando le seguenti coordinate: anteriore, posteriore meno due, mediale laterale più meno uno, dorsale ventrale meno uno. Queste coordinate si troveranno vicino al margine del dominio cranico. Attendere cinque minuti per consentire la stabilizzazione del tessuto.Iniettare zero virgola sette microlitri di soluzione AV al ritmo di 50 nanolitri al minuto. Attendere 10 minuti affinché il virus venga completamente assorbito. Rimuovere delicatamente l'ago.Applicare con una spugna di gel in caso di sanguinamento. Ripetere sull'emisfero controlaterale. Posizionare il vetrino sterile e asciutto sulla dura madre all'interno del cerchio trapanato.Tenere il vetrino con la pinzetta per appiattire delicatamente la dura madre e avvicinare i bordi del vetrino alla superficie del cranio. Utilizzando un ago sterile, applicare la colla densa a base di cianoacrilato sui bordi del vetrino per fissarli al cranio. Attendere che la colla si asciughi.Posizionare una barra di fissaggio, un dado anton o un design personalizzato nella parte anteriore del cranio. Notare che la barra di fissaggio deve essere posizionata in una posizione che consenta il posizionamento orizzontale della finestra cranica durante la sessione di imaging. Applicare la colla lungo i bordi della barra.Attendere che la colla si asciughi. Notare che la barra di fissaggio deve essere posizionata il più lontano possibile dalla finestra. Se posizionata troppo vicino alla finestra, la barra e la vite che la collega al supporto su misura potrebbero ostacolare l'obiettivo durante il processo di acquisizione delle immagini.Preparare l'acrilico dentale e applicarlo sulla superficie del cranio intorno al vetro. È utile formare una struttura simile a un cratere intorno alla finestra. Questo creerà una cavità per l'acqua che verrà applicata successivamente durante l'imaging con l'obiettivo ad immersione in acqua.Creare un cappuccio con l'acrilico dentale, ricoprendo il resto delle barre di fissaggio dei margini cutanei dell'area operativa e rinforzando il bordo attorno alla finestra cranica. Attendere che il cemento dentale si indurisca. Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e posizionarlo nella camera di recupero.Attendere il recupero dell'animale dall'intervento chirurgico osservando le funzioni fisiologiche. Applicare l'anestesia postoperatoria cyroproferrin, 10 milligrammi per chilogrammo, e il trattamento antibiotico baytril, cinque milligrammi per chilogrammo, per 48 ore. Avviare il laser a ti zaffiro, accendere il microscopio.Il sistema utilizzato in questo esperimento è dotato di un laser a due fotoni, un sistema OPO e un PMT a gallio arsenico duale falsificato. Posizionare l'animale nella camera di induzione e indurre l'anestesia. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posizionarlo sotto la maschera per l'anestesia gassosa al microscopio.Ridurre il flusso di ossigeno a zero virgola tre litri al minuto e la concentrazione di isoflurano al 1,52%. Fissare l'animale al supporto microscopico personalizzato con una vite MT o un altro sistema personalizzato. Livellare la finestra cranica. Si noti che è possibile utilizzare il sistema di fissaggio della testa fornito dal produttore del microscopio, anche se il supporto personalizzato specifico offre risultati migliori, una maggiore stabilità della testa e un posizionamento costante in più sessioni durante un esperimento cronico.Utilizzando le impostazioni del microscopio a campo luminoso e un obiettivo a basso ingrandimento, centrare la visione su uno dei lati della corteccia retrospleniale e mettere a fuoco sulla superficie del vetrino. Applicare una goccia d'acqua nel pozzetto acrilico di forma crateriforme. Passare a un obiettivo a immersione in acqua con lunga distanza di lavoro.Spostare l'obiettivo verso la finestra cranica finché il menisco d'acqua non collega il campione e l'obiettivo. Passare alle impostazioni a due fotoni e iniziare a scansionare il campione dall'alto verso il basso utilizzando l'ingrandimento più basso. L'attraversamento della dura madre sarà visibile come un bagliore di segnale altamente non specifico.Regolare le impostazioni di acquisizione del microscopio in entrambi i canali, GFP e mCherry, in base all'intensità del segnale proveniente dalle cellule fluorescenti, in modo da coprire l'intero intervallo dinamico. Dopo aver individuato un neurone adatto con l'albero dendritico separato da altre cellule, eseguire una scansione iniziale utilizzando soltanto i filtri GFP con l'ingrandimento più basso e una distanza Z di cinque micrometri. Ottenere una proiezione massima dello stack di scansione e stamparla per le annotazioni utilizzando colori invertiti.Impostare lo zoom su un valore che consenta di acquisire i dettagli morfologici desiderati. Acquisire l’intero albero dendritico nei canali GFP e mCherry utilizzando la proiezione massima come guida. Utilizzando questo protocollo, sarà possibile monitorare ripetutamente sia le strutture pre- che post-sinaptiche nella corteccia retrospleniale.Questo approccio potrebbe essere utilizzato in un esperimento cronico in cui manipolazioni comportamentali sono previste in correlazione con cambiamenti nella morfologia dei dendriti, delle spine sinaptiche o dei neuroni pre-sinaptici. Le sessioni di imaging possono essere eseguite con qualsiasi frequenza, ma si preferisce un intervallo di 24 ore al fine di consentire un adeguato recupero dell'animale e di minimizzare l'effetto dell'anestesia. Se applicata correttamente, questa tecnica permette di effettuare più sessioni di imaging nell'arco di diversi mesi.

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Neuroscienze

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Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in un topo sveglio

Fonte: Kamei, R., et. al., Imaging cronico a due fotoni in vivo della microglia nell'ippocampo del topo. J. Vis. Exp. (2022)Il video mostra il processo di configurazione e imaging per la microscopia a due fotoni in vivo della dinamica microgliale nel CA1 dell'ippocampo (Cornu ammonis 1) e nel giro dentato, garantendo un allineamento ottico ottimale e una valutazione dell'integrità strutturale.

Imaging in vivo a due fotoni della dinamica microgliale nell'ippocampo del topo

Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali.

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L'imaging time-lapse nell'animale vivente fornisce informazioni preziose sulla riorganizzazione strutturale nel cervello intatto. Qui, introduciamo una preparazione di cranio assottigliato che consente l'imaging transcranico di strutture sinaptiche marcate in fluorescenza nella corteccia di topo vivente mediante microscopia a due fotoni.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

Descriviamo una procedura sperimentale per la misura di attività neuronale attraverso finestre ottiche dual sopra bilaterale corticies somatosensoriale primaria (S1) in Thy1-GCaMP6s topi transgenici utilizzando 2 fotoni (2P) microscopia in vivo.

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