Simultanea a due fotoni In Vivo Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Tutte le procedure sperimentali descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Etico Locale presso l'Istituto di Biologia Sperimentale Nenscki, Accademia Polacca delle Scienze. Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica di questo uno-G di piedi. Questo approccio è combinato con l'iniezione di mCherry che esprime il virus adeno-associato, AAV, nell'ippocampo dorsale.

Combinate insieme, queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della dipendenza sperimentata, della plasticità strutturale nella corteccia retrospleniale. In questo articolo, proponiamo l'impianto della finestra cranica sopra la corteccia retrospleniale come non una possibile regione di interesse per la microscopia in vivo a due fotoni. Al fine di visualizzare i cambiamenti morfologici nelle strutture neuronali, utilizziamo questo one-G di topi B con l'espressione della proteina fluorescente GFP in circa il 10% dei neuroni nel cervello.

Un'altra innovazione che proponiamo è l'iniezione di un AAV, espressione di una proteina fluorescente mCherry sotto un promotore neurone-specifico nelle strutture più profonde del cervello, come l'ippocampo, al fine di visualizzare le proiezioni della struttura nella corteccia retrospleniale. Sterilizzare tutti gli strumenti, i contenitori di vetro per liquidi e i tamponi di cotone nell'autoclave. Guanti dispensabili.

Pulire il tavolo operatorio, il telaio stereotassico e tutta l'area circostante con etanolo al 70%. Utilizzare un tampone chirurgico sterile per creare uno spazio sterile per tutte le apparecchiature sterilizzate. Tagliare la schiuma di gel in piccoli pezzi e immergerli in soluzione fisiologica sterile.

Metti l'animale nella camera di induzione e imposta il livello di isoflurano al 5% e il flusso di ossigeno a due litri al minuto. Questa procedura dovrebbe richiedere circa tre minuti. Estrarre l'animale dalla camera di induzione.

Usa pizzichi per la coda o le dita dei piedi per assicurarti che l'animale sia completamente sedato. Utilizzando dei rifinitori precisi, radere i capelli dalla parte posteriore della testa, tra le orecchie, fino agli occhi. Posiziona l'animale nella cornice stereotassica e stabilizza la testa con le barre auricolari.

Impostare i livelli di anestesia all'1,5-2% di isoflurano e zero virgola tre litri al minuto di ossigeno. Applicare l'unguento per gli occhi. Iniettare all'animale per via sottocutanea tolfedina, quattro milligrammi per chilogrammo, butomidor, due milligrammi per chilogrammo, e Baytril, cinque milligrammi per chilogrammo per prevenire rispettivamente l'infiammazione, il dolore e l'infezione.

Iniettare l'animale per via intramuscolare con desametasone, zero virgola due milligrammi per chilogrammo, per prevenire il gonfiore cerebrale. Pulire la pelle utilizzando tamponi di cotone sterili con betadina seguita da etanolo al 70%. Cambia i guanti e spruzzali con etanolo al 70%.

Sollevare la pelle con una pinza e con le microforbici incidere la pelle orizzontalmente lungo la base della testa e poi obliquamente verso il punto anteriore tra gli occhi. Rimuovere il lembo della pelle. Applicare unguento alla lidocaina con tampone sterile sul periostio per prevenire sanguinamento e dolore eccessivi.

Utilizzare tamponi di cotone sterili o bisturi per rimuovere il periostio. Asciugare il cranio con tamponi sterili. Utilizzando un ago sterile, applicare una colla densa cianoacrilica sui bordi della pelle per immobilizzarli e prevenire un ulteriore contatto con il cemento dentale.

Attendi che la colla si asciughi. Stendere un vetro di copertura sterile da tre millimetri sul cranio anteriormente alla sutura lambdoidea. Centrare il vetrino coprioggetti alle coordinate retrospleniali, anteriore, bregma posteriore meno due virgola otto, bregma laterale mediale zero.

Segnare i bordi del vetrino coprioggetto graffiando la superficie del cranio con un ago sterile. Rimettere il vetro di copertura nel contenitore sterile con il 70% di etanolo. Utilizzare un trapano dentale ad alta velocità con fresa di piccolo diametro per delineare un cerchio di tre millimetri di diametro.

Pulire il sito di perforazione dalla polvere ossea con tamponi sterili con punta salina. Usa la schiuma gel e i tamponi per fermare l'emorragia occasionale e pulire l'osso. Tra una perforazione e l'altra, controllare lo spessore osseo con una pinza sottile toccando delicatamente il cerchio osseo e controllandone la mobilità.

Tenendo presente che l'osso è più spesso nell'area delle suture. Interrompere la perforazione quando il cerchio osseo è mobile e sulla circonferenza rimane solo uno strato uniforme e sottile di osso. Pulire il campo operatorio da tutta la polvere ossea residua con tamponi salini.

Far cadere la soluzione fisiologica sterile sull'area di perforazione, coprendo il cerchio perforato. Fare leva con cautela sul cerchio osseo con una pinza sottile e poi rimuovere delicatamente ma con fermezza l'osso sollevandolo verso l'alto. Fare attenzione a non inclinare il cerchio osseo durante il sollevamento per evitare possibili danni alla dura.

Applicare delicatamente la schiuma gel imbevuta di soluzione fisiologica sterile sulla dura madre per aiutare a superare l'emorragia. Attendere che tutto il sanguinamento sia completamente fermato. Rimuovere con cura la schiuma di gel per non disturbare il processo di coagulazione.

Si noti che l'area della sutura è altamente vascolarizzata, quindi il sanguinamento a questo punto potrebbe rivelarsi profondo. È essenziale attendere il tempo sufficiente affinché l'emorragia si fermi. Collegare la pompa di infusione alla torre stereotassica e collegare il controller.

Inserire l'ago calibro 35 nella siringa di riempimento. Sciacquare la siringa 10 volte con etanolo per sterilizzarla e 10 volte con soluzione fisiologica sterile per rimuovere le tracce di etanolo. Rimuovere le bolle d'aria dalla siringa.

Inserire la siringa nella pompa. Riempi una singola dose di preparato AV e tienilo in ghiaccio. Riempi la siringa con la soluzione virale.

Centrare l'ago sul bregma e poi inserirlo delicatamente nell'ippocampo utilizzando le seguenti coordinate: anteriore, posteriore meno due, laterale mediale più meno uno, ventrale dorsale meno uno. Queste coordinate saranno localizzate vicino al bordo del dominio cranico. Attendere cinque minuti affinché il tessuto si stabilizzi.

Iniettare zero virgola sette microlitri di soluzione AV alla velocità di 50 nanolitri al minuto. Attendere 10 minuti affinché il virus si assorba completamente. Rimuovere delicatamente l'ago.

Tamponare con schiuma di gel se si verifica sanguinamento. Ripetere con il lato controlaterale. Appoggiare il vetro di copertura asciutto sterile sulla parte superiore della dura madre nel telaio circolare forato.

Tenere il vetro di copertura con le anterie per appiattire delicatamente la dura madre e avvicinare i bordi del vetro di copertura alla superficie del cranio. Utilizzando un ago sterile, applicare la colla densa cianoacrilica sui bordi del vetro di copertura per fissarli al cranio. Attendi che la colla si asciughi.

Posiziona una barra di fissaggio, un dado anton o un design su misura nella parte anteriore del cranio. Si noti che la barra di fissazione deve essere posizionata in una posizione che consenta il posizionamento orizzontale della finestra cranica durante la sessione di imaging. Applicare la colla sui bordi della barra.

Attendi che la colla si asciughi. Si noti che la barra di fissaggio deve essere posizionata il più lontano possibile dalla finestra. Se viene posizionato troppo vicino alla finestra, la barra e la vite che la collega al supporto su misura potrebbero rappresentare un ostacolo per l'obiettivo durante il processo di imaging.

Preparare l'acrilico dentale e applicarlo sulla superficie del cranio attorno al vetro. È utile formare una forma simile a un cratere attorno alla finestra. Creerà una cavità per l'acqua applicata successivamente per l'imaging con l'obiettivo dell'acqua.

Creare un tappo con l'acrilico dentale, coprendo il resto dell'area operativa, la barra di fissazione dei bordi della pelle, rinforzando il cratere attorno alla finestra cranica. Attendere che il cemento dentale si indurisca. Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e inserirlo nella camera di recupero.

Attendere che l'animale si riprenda dall'intervento chirurgico osservando le funzioni fisiologiche. Applicare l'anestesia postoperatoria ciroproferrina, 10 milligrammi per chilogrammo, e il trattamento antibiotico baytril, cinque milligrammi per chilogrammo, per 48 ore. Avvia il laser allo zaffiro ti, accendi il microscopio.

Il sistema utilizzato in questo esperimento è dotato di un laser a due fotoni, sistema OPO e PMT falsificato a doppio arseniuro di gallio. Mettere l'animale nella camera di induzione e indurre l'anestesia. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e metterlo nella maschera per anestesia gassosa al microscopio.

Ridurre il flusso di ossigeno a zero virgola tre litri al minuto e la concentrazione di isoflurano all'1,52%Fissare l'animale al telaio del microscopio personalizzato con una vite MT o un altro sistema personalizzato. Livellare la finestra cranica. Si noti che è possibile utilizzare il sistema di fissazione della testa del produttore del microscopio, anche se il telaio personalizzato specifico offre risultati migliori, una migliore stabilità della testa, un posizionamento costante in più sessioni durante un esperimento cronico.

Utilizzando le impostazioni del microscopio ad ampio campo, un obiettivo a basso ingrandimento, centrare la vista su uno dei lati della corteccia retrospleniale e focalizzarla sulla superficie del vetrino. Applicare una goccia d'acqua nel pozzetto acrilico simile a un cratere. Passa a un obiettivo a immersione in acqua a lunga distanza.

Spostare l'obiettivo verso la finestra cranica fino a quando il menisco dell'acqua collega il campione e l'obiettivo. Passa alle impostazioni a due fotoni e inizia a scansionare il campione dall'alto verso il basso utilizzando lo zoom più basso. L'attraversamento della dura matter sarà visibile come bagliore di un segnale non specifico elevato.

Regolare le impostazioni di acquisizione del microscopio in entrambi i canali, GFP e mCherry in base alla potenza del segnale proveniente dalle celle fluorescenti, al fine di coprire l'intera gamma dinamica. Dopo aver trovato un neurone adatto con l'albero dendritico separato dalle altre cellule, eseguire una scansione iniziale utilizzando solo filtri GFP impostati con lo zoom più basso e la distanza Z di cinque micron. Ottenere una proiezione massima della pila di scansione e stamparla per le annotazioni utilizzando i colori invertiti.

Impostare lo zoom su un valore che consenta di visualizzare i dettagli morfologici desiderati. Immagine dell'intero albero dendritico in GFP e canale mCherry utilizzando la massima proiezione come guida. Utilizzando questo protocollo, sarà possibile monitorare ripetutamente sia le strutture pre che post-sinaptiche nella corteccia retrospleniale.

Questo approccio potrebbe essere utilizzato con un esperimento cronico in cui ci si aspetta che le manipolazioni comportamentali siano correlate ai cambiamenti nella morfologia dei dendriti, delle spine sinaptiche o dei neutroni pre-sinaptici. Le sessioni di imaging possono essere eseguite con qualsiasi frequenza, ma è preferibile un intervallo di tempo di 24 ore per consentire un corretto recupero dell'animale e ridurre al minimo l'effetto dell'anestesia. Se applicata correttamente, questa tecnica consente di eseguire più sessioni di imaging nel corso di diversi mesi.