Simultanea a due fotoni

Tutte le procedure sperimentali descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Etico Locale presso l'Istituto Nencki di Biologia Sperimentale, Accademia Polacca delle Scienze. Questo video mostra la procedura di craniotomia che permette l'immagine cronica dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo mediante microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica thi one-G di feet. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato, AAV, esprimente mCherry nell'ippocampo dorsale.

Combinando insieme queste tecniche, è possibile effettuare un monitoraggio a lungo termine della dipendenza sperimentata e della plasticità strutturale nella corteccia retrospleniale. In questo articolo, proponiamo l’impianto di una finestra cranica sopra la corteccia retrospleniale come regione di interesse non solo possibile per la microscopia in vivo a due fotoni. Al fine di visualizzare i cambiamenti morfologici nelle strutture neuronali, utilizziamo topi di linea B uno-G con espressione della proteina fluorescente GFP in circa il 10 percento dei neuroni nel cervello.

Un'altra innovazione che proponiamo è l'iniezione di un AAV, esprimente una proteina fluorescente mCherry sotto un promotore specifico per neuroni, in strutture profonde del cervello, come l'ippocampo, al fine di visualizzare le proiezioni di questa struttura nella corteccia retrospleniale. Sterilizzare tutti gli strumenti, i contenitori di vetro per liquidi e i bastoncini di cotone in autoclave. Indossare guanti monouso.

Pulire il tavolo operatorio, il telaio stereotassico e tutta l'area circostante con etanolo al 70%. Utilizzare un tappetino chirurgico sterile per creare uno spazio sterile per tutti gli strumenti sterilizzati. Tagliare la schiuma di gel in piccoli pezzi e immergerli in soluzione fisiologica sterile.

Posizionare l'animale nella camera di induzione e impostare il livello di isoflurano al 5% e il flusso di ossigeno a due litri al minuto. Questa procedura dovrebbe richiedere circa tre minuti. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione.

Utilizzare pizzichi sulla coda o sulle dita dei piedi per assicurarsi che l'animale sia completamente sedato. Utilizzando forbici precise, rasare i peli sulla parte posteriore della testa, tra le orecchie, fino agli occhi. Posizionare l'animale nel telaio stereotassico e stabilizzare la testa con le barre auricolari.

Impostare i livelli di anestesia al 1,5-2% di isoflurano e 0,3 litri al minuto di ossigeno. Applicare il pomata oculare. Iniettare l'animale per via sottocutanea con tolfedina, 4 milligrammi per chilogrammo, buprenorfina, 2 milligrammi per chilogrammo, e Baytril, 5 milligrammi per chilogrammo, per prevenire rispettivamente infiammazione, dolore e infezione.

Somministrare all'animale dexametasona per via intramuscolare, zero virgola due milligrammi per chilogrammo, per prevenire il gonfiore cerebrale. Pulire la cute utilizzando tamponi di cotone sterili con betadina seguiti da etanolo al 70%. Cambiare i guanti e spruzzarli con etanolo al 70%.

Sollevare la pelle con una pinzetta e, utilizzando forbici microchirurgiche, effettuare un'incisione orizzontale lungo la base della testa e quindi obliqua fino al punto anteriore tra gli occhi. Rimuovere il lembo cutaneo. Applicare un unguento a base di lidocaina con un batuffolo sterile sul periostio per prevenire sanguinamenti eccessivi e dolore.

Utilizzare tamponi di cotone sterili o un bisturi per rimuovere il periostio. Asciugare il cranio con tamponi sterili. Utilizzando un ago sterile, applicare una colla densa a base di cianoacrilato sui margini della pelle per immobilizzarli e impedire ulteriori contatti con il cemento dentale.

Attendere che la colla si asciughi. Posizionare un vetrino sterile da tre millimetri sul cranio anteriormente alla sutura lambdoidea. Centrare il vetrino alle coordinate retrospleniali, anteriore-posteriore rispetto al bregma meno due virgola otto, mediale-laterale rispetto al bregma zero.

Segnare i bordi del vetrino graffiando la superficie del cranio con un ago sterile. Riposizionare il vetrino nel contenitore sterile contenente etanolo al 70%. Utilizzare un trapano dentale ad alta velocità con una fresa di piccolo diametro per delineare un cerchio di tre millimetri di diametro.

Pulire il sito di trapanazione dalla polvere ossea utilizzando tamponi sterili imbevuti di soluzione salina. Utilizzare la spugna di gel e i tamponi per arrestare eventuali sanguinamenti e pulire l'osso. Durante le pause della trapanazione, verificare lo spessore dell'osso con pinzette fini toccando delicatamente il cerchio osseo e controllandone la mobilità.

Tenendo presente che l'osso è più spesso nella zona delle suture, interrompere la perforazione quando il cerchio osseo è mobile e rimane solo uno strato sottile e uniforme di osso lungo la circonferenza. Pulire il campo operatorio da tutta la polvere ossea residua utilizzando tamponi imbevuti di soluzione fisiologica.

Lasciare cadere il soluzione salina sterile sull'area di trapanatura, coprendo il cerchio trapanato. Sollevare con attenzione il cerchio osseo con una pinzetta fine e quindi rimuoverlo delicatamente ma con fermezza sollevandolo verso l'alto. Prestare attenzione a non inclinare il cerchio osseo durante il sollevamento per evitare possibili danni alla dura madre.

Applicare delicatamente sulla dura il gel spugnoso imbevuto di soluzione salina sterile per aiutare a fermare l'emorragia. Attendere fino a quando l'emorragia si è arrestata completamente. Rimuovere con attenzione il gel spugnoso per non disturbare il processo di coagulazione.

Notare che l'area della sutura è altamente vascolarizzata, quindi il sanguinamento in questa sede potrebbe risultare abbondante. È essenziale attendere un tempo sufficiente affinché il sanguinamento si arresti. Collegare la pompa per infusione alla torre stereotassica e connettere il controllore.

Inserire l'ago da 35 gauge nella siringa di riempimento. Sciacquare la siringa 10 volte con etanolo per sterilizzarla e 10 volte con soluzione salina sterile per rimuovere le tracce di etanolo. Rimuovere le bolle d'aria dalla siringa.

Inserire la siringa nella pompa. Riempire una singola dose di preparato AV e mantenerla sul ghiaccio. Riempire la siringa con la soluzione virale.

Centrare l'ago sul bregma e quindi inserirlo delicatamente nell'ippocampo utilizzando le seguenti coordinate: anteriore, posteriore meno due, mediale laterale più meno uno, dorsale ventrale meno uno. Queste coordinate si troveranno vicino al margine del dominio cranico. Attendere cinque minuti per consentire la stabilizzazione del tessuto.

Iniettare zero virgola sette microlitri di soluzione AV al ritmo di 50 nanolitri al minuto. Attendere 10 minuti affinché il virus venga completamente assorbito. Rimuovere delicatamente l'ago.

Applicare con una spugna di gel in caso di sanguinamento. Ripetere sull'emisfero controlaterale. Posizionare il vetrino sterile e asciutto sulla dura madre all'interno del cerchio trapanato.

Tenere il vetrino con la pinzetta per appiattire delicatamente la dura madre e avvicinare i bordi del vetrino alla superficie del cranio. Utilizzando un ago sterile, applicare la colla densa a base di cianoacrilato sui bordi del vetrino per fissarli al cranio. Attendere che la colla si asciughi.

Posizionare una barra di fissaggio, un dado anton o un design personalizzato nella parte anteriore del cranio. Notare che la barra di fissaggio deve essere posizionata in una posizione che consenta il posizionamento orizzontale della finestra cranica durante la sessione di imaging. Applicare la colla lungo i bordi della barra.

Attendere che la colla si asciughi. Notare che la barra di fissaggio deve essere posizionata il più lontano possibile dalla finestra. Se posizionata troppo vicino alla finestra, la barra e la vite che la collega al supporto su misura potrebbero ostacolare l'obiettivo durante il processo di acquisizione delle immagini.

Preparare l'acrilico dentale e applicarlo sulla superficie del cranio intorno al vetro. È utile formare una struttura simile a un cratere intorno alla finestra. Questo creerà una cavità per l'acqua che verrà applicata successivamente durante l'imaging con l'obiettivo ad immersione in acqua.

Creare un cappuccio con l'acrilico dentale, ricoprendo il resto delle barre di fissaggio dei margini cutanei dell'area operativa e rinforzando il bordo attorno alla finestra cranica. Attendere che il cemento dentale si indurisca. Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e posizionarlo nella camera di recupero.

Attendere il recupero dell'animale dall'intervento chirurgico osservando le funzioni fisiologiche. Applicare l'anestesia postoperatoria cyroproferrin, 10 milligrammi per chilogrammo, e il trattamento antibiotico baytril, cinque milligrammi per chilogrammo, per 48 ore. Avviare il laser a ti zaffiro, accendere il microscopio.

Il sistema utilizzato in questo esperimento è dotato di un laser a due fotoni, un sistema OPO e un PMT a gallio arsenico duale falsificato. Posizionare l'animale nella camera di induzione e indurre l'anestesia. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posizionarlo sotto la maschera per l'anestesia gassosa al microscopio.

Ridurre il flusso di ossigeno a zero virgola tre litri al minuto e la concentrazione di isoflurano al 1,52%. Fissare l'animale al supporto microscopico personalizzato con una vite MT o un altro sistema personalizzato. Livellare la finestra cranica. Si noti che è possibile utilizzare il sistema di fissaggio della testa fornito dal produttore del microscopio, anche se il supporto personalizzato specifico offre risultati migliori, una maggiore stabilità della testa e un posizionamento costante in più sessioni durante un esperimento cronico.

Utilizzando le impostazioni del microscopio a campo luminoso e un obiettivo a basso ingrandimento, centrare la visione su uno dei lati della corteccia retrospleniale e mettere a fuoco sulla superficie del vetrino. Applicare una goccia d'acqua nel pozzetto acrilico di forma crateriforme. Passare a un obiettivo a immersione in acqua con lunga distanza di lavoro.

Spostare l'obiettivo verso la finestra cranica finché il menisco d'acqua non collega il campione e l'obiettivo. Passare alle impostazioni a due fotoni e iniziare a scansionare il campione dall'alto verso il basso utilizzando l'ingrandimento più basso. L'attraversamento della dura madre sarà visibile come un bagliore di segnale altamente non specifico.

Regolare le impostazioni di acquisizione del microscopio in entrambi i canali, GFP e mCherry, in base all'intensità del segnale proveniente dalle cellule fluorescenti, in modo da coprire l'intero intervallo dinamico. Dopo aver individuato un neurone adatto con l'albero dendritico separato da altre cellule, eseguire una scansione iniziale utilizzando soltanto i filtri GFP con l'ingrandimento più basso e una distanza Z di cinque micrometri. Ottenere una proiezione massima dello stack di scansione e stamparla per le annotazioni utilizzando colori invertiti.

Impostare lo zoom su un valore che consenta di acquisire i dettagli morfologici desiderati. Acquisire l’intero albero dendritico nei canali GFP e mCherry utilizzando la proiezione massima come guida. Utilizzando questo protocollo, sarà possibile monitorare ripetutamente sia le strutture pre- che post-sinaptiche nella corteccia retrospleniale.

Questo approccio potrebbe essere utilizzato in un esperimento cronico in cui manipolazioni comportamentali sono previste in correlazione con cambiamenti nella morfologia dei dendriti, delle spine sinaptiche o dei neuroni pre-sinaptici. Le sessioni di imaging possono essere eseguite con qualsiasi frequenza, ma si preferisce un intervallo di 24 ore al fine di consentire un adeguato recupero dell'animale e di minimizzare l'effetto dell'anestesia. Se applicata correttamente, questa tecnica permette di effettuare più sessioni di imaging nell'arco di diversi mesi.