Isolamento di cellule endoteliali glomerulari di topo condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti

Le cellule endoteliali glomerulari immortalizzate con mitocondri fluorescenti stabili sono un ottimo strumento per esaminare l'effetto di diversi stimoli sulla struttura mitocondriale in vitro. Il metodo descritto nell'articolo corrente produce un numero elevato di cellule endoteliali glomerulari. Testando piccole molecole su un GEC, potremmo schermare la monoterapia per la malattia renale diabetica in cui i GEC sono interessati.

Il metodo descritto è facile da eseguire e non richiede attrezzature specifiche. Tuttavia, è importante seguire i passaggi descritti e sterilizzare l'apparecchiatura per evitare la contaminazione. Per iniziare, posizionare i materiali di perfusione e isolamento necessari per isolare le cellule glomerulari renali in uno spazio di lavoro.

Filtrare la soluzione salina bilanciata di Hanks appena preparata, o HBSS, con un filtro da 0,2 micron e tenerla sotto il cofano per evitare contaminazioni. Quindi, mescolare 200 microlitri di perline magnetiche con 20 millilitri di HBSS. Preriscaldare l'RPMI con FCS al 10% e terreno di coltura cellulare endoteliale a bagnomaria a 37 gradi Celsius.

Quindi, pre-rivestire due pozzetti di una piastra a sei pozzetti con due millilitri di 10 microgrammi per millilitro di collagene IV per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare la piastra due volte con PBS per rimuovere l'acido acetico utilizzato per diluire il collagene. Utilizzare immediatamente le piastre rivestite o conservarle da due a otto gradi Celsius per un massimo di quattro settimane.

Pulire gli strumenti chirurgici e lo spazio di lavoro con etanolo al 70%. Successivamente, autoclavare gli strumenti chirurgici per 30 minuti. Dopo aver aperto l'addome di un topo anestetizzato, inserire un ago a farfalla nel ventricolo sinistro.

Per iniettare 100 microlitri della soluzione di perline per espandere la circolazione sanguigna, rompere con cura la vena cava inferiore sotto i reni con un ago di calibro 19 e continuare la perfusione della soluzione di perline. Quindi, rimuovere delicatamente il tessuto adiposo con una pinzetta, asportare entrambi i reni con sottili forbici chirurgiche C e metterli su un piatto con un millilitro di HBSS sul ghiaccio. Tritare il rene con un bisturi sterile in piccoli pezzi di un millimetro.

Incubare il rene tritato con un millimetro di collagenasi di tipo II appena preparata per 35 minuti a 37 gradi Celsius con una leggera inclinazione su uno shaker orizzontale. Dopo la digestione, aggiungere quattro millilitri di RPMI con 10% FBS per neutralizzare la collagenasi. Filtrare il tessuto digerito attraverso un filtro cellulare sterile da 100 micron in un tubo da 50 millilitri.

Utilizzare il fondo di un tubo sterile da 1,5 millilitri per mescolare il tessuto digerito contro il colino, consentendo ai glomeruli di passare. Risciacquare il filtro cellulare con 15 millilitri di HBSS. Quindi, centrifugare il flusso a 200 XG per cinque minuti a temperatura ambiente.

In questa fase, il tubo contiene tre strati. Lo strato superiore contiene strutture più piccole come tubuli, lo strato intermedio è perline con glomeruli e lo strato inferiore contiene detriti. Aspirare con cura il surnatante e lo strato bianco superiore.

Quindi, risospendere il pellet contenente perline contenenti glomeruli e detriti in 1,5 millilitri di HBSS e trasferirlo in un tubo da due millilitri. Posizionare il tubo in un concentratore magnetico e aspirare il surnatante prima di lavare le perle due volte con un millilitro di HBSS. Posizionare 20 microlitri di sospensione cellulare su un vetrino.

Quindi, osserva il vetrino al microscopio per la presenza di glomeruli. Quindi, risospendere il pellet in un mezzo di crescita delle cellule endoteliali e trasferire la sospensione in un tubo da due millilitri. Aggiungere un microlitro di interferone gamma per ogni tre millilitri di terreno e posizionare le cellule in una piastra a sei pozzetti per l'incubazione a 33 gradi Celsius.

Dopo tre giorni di coltura, sostituire con cura il mezzo da un millilitro con un mezzo fresco. In questa fase, le cellule sono eterogenee con una miscela di cellule glomerulari. Dopo sette giorni, sostituire il terreno con due millilitri di terreno di crescita cellulare endoteliale fresco, integrato con interferone gamma per avviare la proliferazione cellulare.

Dopo 10 giorni, quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, passarle usando tripsina e trasferirle in un pallone T-25 rivestito di collagene IV.Dopo 21 giorni di coltura, trasferire le cellule in un matraccio T-75. Aggiungere tre millilitri di tripsina allo 0,25% in un pallone T-75 e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, neutralizzare la tripsina con tre millilitri di terreno di crescita endoteliale e trasferire la sospensione in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione a 200 XG per cinque minuti.

Aspirare il surnatante e lavare le cellule in un millilitro di PBS contenente 1% BSA, EDTA bimolare, 1% penicillina / streptomicina. Ancora una volta, centrifugare e risospendere il pellet in 200 microlitri di perle rivestite di anticorpi CD31 e 800 microlitri di PBS. Incubare le cellule per 45 minuti con agitazione continua a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Quindi, posizionare il tubo nel concentratore magnetico e lavare le cellule quattro volte con PBS contenente BSA, EDTA e penicillina / streptomicina. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in tre millilitri di terreno di crescita endoteliale, integrato con interferone gamma. Piastra 1,5 millilitri di cellule per pozzetto in pozzetti rivestiti di collagene IV su una piastra a sei pozzetti e coltura in condizioni permissive a 33 gradi Celsius.

Dopo quattro giorni, sostituire 750 microlitri del mezzo con un mezzo di crescita endoteliale fresco, integrato con interferone gamma. Dopo 10-14 giorni di coltura, utilizzando un microscopio a epifluorescenza con un filtro a 488 nanometri, osservare per la crescita le cellule endoteliali glomerulari CD31 positive, o GEC, colonie che esprimono mitocondri fluorescenti. Dopo 21 giorni, o quando le cellule hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, trasferirle in un pallone T-25.

Mantenere la coltura con un mezzo di crescita RPMI contenente il 10% di FCS. In alternativa, le cellule possono essere crioconservate. Cellule di passaggio usando tripsina, come dimostrato in precedenza.

Quindi, centrifugare le celle e risospendere il pellet in tre millilitri di mezzo di congelamento. Aliquotare le cellule in tubi criogenici e conservarle in azoto liquido, temperatura di vapore. Questo protocollo descriveva un metodo per l'isolamento delle cellule endoteliali glomerulari.

Dai glomeruli isolati, le cellule hanno iniziato a crescere lentamente dopo tre giorni di coltura. Dopo sette giorni, le cellule apparivano eterogenee e mostravano altri tipi di cellule glomerulari, come podociti, cellule parietali, epiteliali e mesangiali. Dopo aver raggiunto il 70-80% di confluenza, altre cellule glomerulari sono state rimosse utilizzando una selezione positiva di cellule endoteliali.

I GEC di MitoDendra2 esprimevano CD31 ed erano negativi per il marcatore podocita, come mostrato dalla colorazione negativa della sinaptopodina. È stato esaminato l'effetto della concentrazione di glucosio sulla struttura dei mitocondri. Rispetto ai mitocondri allungati visibili nelle cellule sotto glucosio normale, l'alta frammentazione indotta dal glucosio o la fissione dei mitocondri, come osservato dai mitocondri prominenti a forma di sferoide.

Inoltre, un laser a 405 nanometri è stato utilizzato per fotoconvertire una sottopopolazione selezionata di mitocondri in un singolo MitoDendra2 GEC vivo. Viene mostrato un fotopassaggio riuscito dei mitocondri da verde a rosso nell'area selezionata per le cellule trattate con concentrazione di glucosio normali e elevate. Questa commutazione ha permesso di assistere agli eventi di fusione nei GEC di MitoDendra2.

Sotto glucosio normale, la fluorescenza gialla si è fusa verde e rossa a causa della fusione della matrice mitocondriale. Al contrario, nei GEC trattati con alto glucosio, i mitocondri erano principalmente frammentati. Posizionare le cellule in un pozzetto di piastra a sei pozzetti con un piccolo volume di terreno di crescita è essenziale per consentire alle cellule di attaccarsi al piatto.

Le cellule endoteliali isolate potrebbero essere utilizzate per eseguire studi sulla funzione mitocondriale e strutturale. L'uso di cellule endoteliali immortalizzate con caratteristiche mitocondriali fluorescenti aprirà la strada alla scoperta di farmaci. Le piccole molecole potrebbero essere testate sulle cellule e viene eseguita l'imaging dal vivo per esaminare il loro effetto sulla funzione dei mitocondri.