Ottimizzazione dell'isolamento e della purificazione delle cellule mesangiali glomerulari murine

Una delle nostre ricerche si concentra sull'insufficienza renale correlata al mieloma multiplo. Per supportare la nostra ricerca, abbiamo sviluppato e ora ottimizzato protocolli per la coltura primaria di cellule mesangiali murine. L'attrezzatura necessaria per le procedure è facilmente accessibile e le fasi procedurali sono semplici.

L'acquisizione delle cellule bersaglio richiede solo due o tre settimane. Questa tecnica facilita la ricerca sui reni e supporta gli studi che indagano la funzione delle cellule mesangiali in modelli di malattia, lo sviluppo terapeutico o la ricerca sulla trasduzione del segnale. Per iniziare l'isolamento delle cellule mesangiali murine, o MC, dall'animale correttamente soppresso, utilizzando forbici e pinzette, rimuovere asetticamente i reni dal topo e metterli in una capsula di Petri.

Sciacquare i reni con la soluzione salina bilanciata di Earle, quindi utilizzare una pinzetta per rimuovere con cura il tessuto connettivo e la capsula renale. Tagliare verticalmente a metà il rene usando un bisturi. Aggiungere tre o quattro millilitri di soluzione di collagenasi I alla capsula di Petri e macinare accuratamente il tessuto con un pestello di plastica.

Pipettare tutto il tessuto e la soluzione dalla capsula di Petri in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Sciacquare la capsula di Petri con uno o due millilitri di soluzione di collagenasi I per garantire il completo trasferimento dei tessuti. Mettere il tubo in uno shaker a 37 gradi Celsius, agitando a 120 giri al minuto per 30 minuti.

Quindi, aggiungere alla miscela un volume uguale di soluzione di arresto o di terreno di coltura. Pipettare la soluzione dalla provetta da centrifuga e passarla attraverso un filtro cellulare da 100 micron. Raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Far passare il filtrato attraverso un filtro cellulare da 40 micron, trattenendo solo le cellule sul filtro. Sciacquare ripetutamente il colino con un terreno di coltura per massimizzare la raccolta cellulare. Trasferire le cellule raccolte dal filtro in una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Centrifugare la sospensione a 600 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in una piastra di coltura cellulare in base alla densità cellulare desiderata. Metti i piatti in un incubatore cellulare a 37 gradi Celsius con il 95% di aria e il 5% di anidride carbonica.

Aggiungere uno o due millilitri di PBS lungo il bordo interno della piastra di coltura per sciacquare le cellule. Utilizzare una pipetta per rimuovere tutto il PBS dal fondo della piastra, quindi aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura uno lungo il bordo interno della piastra. Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, di solito entro sette-10 giorni, lavare le cellule due volte con PBS sterile.

Aggiungere una soluzione di tripsina allo 0,25% al piatto per tripsinizzare le cellule. Metti il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Quando la maggior parte delle cellule mostra una morfologia arrotondata e si stacca dalla superficie, terminare la tripsinizzazione aggiungendo un volume uguale di terreno due.

Centrifugare le celle a 600 g per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi risospenderle nel terreno due. I MC isolati in questo studio hanno mostrato un'espressione significativamente elevata di alfa-SMA, fibronectina e vimentina. La colorazione immunofluorescente di MC purificati e in coltura eseguita dopo 10 giorni di coltura nel secondo terreno ha mostrato che oltre il 95% delle cellule esprimeva sia alfa-SMA che vimentina.