Name: Trasfezione scalabile dei protoplasti mesofilli di mais (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Impara la trasfezione scalabile di milioni di protoplasti mesofilli di mais usando PEG. Questo protocollo ad alto rendimento permette efficienze del 20-50% per testare librerie di plasmidi in biotecnologia vegetale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 training grant no. HG000035 to J.T.) e dal National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 to C.Q.) e dalla National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 e PlantSynBio 2240888 to CQ). Ringraziamo Andrea Gallovatti della Rutgers University per il dono dei semi di mais.

1. Crescita del materiale vegetale
<ol><li>Risciacquare i chicchi di mais due volte con acqua di rubinetto. Immergere i chicchi in acqua di rubinetto durante la notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Il giorno dopo, riempire un vassoio di avviamento di semi da 72 celle con vermiculite: muschio di torba 1: 1 bagnato. Risciacquare i chicchi una volta e piantarli a punta verso il basso, un kernel per cella.</li>
	<li>Crescere in condizioni di lunga giornata (16 ore di luce, 8 ore di buio) a 25 °C per 3 giorni.</li>
	<li>Trasferire al buio costante a 25 °C e crescere per 9-11 giorni.</li>
</ol>2. Isolamento plasmidico
<ol><li>Trasformare E. coli chimicamente competente commerciale con il plasmide o i plasmidi di interesse secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Coltivare l'E. coli trasformato in 50 ml di terreno liquido LB con antibiotici appropriati durante la notte a 37 °C con agitazione.</li>
	<li>Pellettare l'E. coli centrifugando per 10 minuti a 3.000 x g a temperatura ambiente. Estrarre i plasmidi utilizzando un kit di isolamento del DNA del plasmide midiprep disponibile in commercio.</li>
	<li>Stimare la concentrazione di DNA plasmidico utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. NOTA: Il materiale adatto alla trasfezione deve avere una concentrazione di ≥800 ng/μL e un A260/A280 di ≥1,8.</li>
</ol>3. Isolamento del protoplasto
<ol><li>Preparare 20 ml di soluzione enzimatica.<ol><li>Aggiungere 2,18 g di mannitolo, 0,30 g di cellulasi R-10 e 0,06 g di macerozima R-10 in una provetta da centrifuga da 50 ml. Capovolgere per mescolare le polveri. Aggiungere H2O deionizzato a 15 ml. Aggiungere 200 μL di 1 M MES, pH 5,7. Vortice da mescolare.</li>
		<li>Riscaldare la soluzione a 55 °C per 10 min. Raffreddare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere 20 μL di 1 M CaCl2, 0,02 g di albumina sierica bovina e 100 μL di 1 M β-mercaptoetanolo.</li>
		<li>Riempire fino a 20 ml con H2O deionizzato. Versare in un becher da 250 mL avvolto in un foglio.</li>
	</ol></li>
	<li>Togliete le piantine di mais dal buio. Tagliali a pochi centimetri dal terreno usando una nuova lama di rasoio. Posizionare le estremità tagliate in acqua. Tenerli al buio a temperatura ambiente mentre non sono in uso.</li>
	<li>Seleziona la seconda e la terza foglia di ogni piantina, avendo cura di escludere foglie con zone marroni o danneggiate. Seleziona 12-16 foglie. Tagliare ~ 1 cm dalla punta di ogni foglia e scartare. Quindi, tagliare una sezione di 10 cm da ogni foglia. NOTA: Se è necessario più tessuto, utilizzare un ulteriore volume di 20 ml di soluzione enzimatica in un becher aggiuntivo da 250 ml. Troppo materiale fogliare in una data quantità di soluzione enzimatica può ridurre la vitalità.</li>
	<li>Impilare le sezioni fogliari una sopra l'altra con le estremità basali insieme. Fissare il fascio insieme all'estremità basale usando una clip legante. Metti il fascio di foglie su un pezzo di carta bianca.</li>
	<li>Afferrare le foglie ~ 1 cm dall'estremità distale. Usando una nuova lama di rasoio, tagliare le foglie dall'estremità distale perpendicolare alle vene in fette sottili (0,5-1 mm). Evitare di tagliare dritto verso il basso, ma piuttosto fare fette corte e in avanti attraverso il tessuto.<ol><li>Scambia le lamette ogni volta che residui visibili iniziano a depositarsi sulla carta. Il residuo visibile indica l'ammostamento del tessuto a causa di una lama opaca o di una tecnica scadente.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo aver tagliato ~ 2 cm della lunghezza del fascio fogliare, trasferire prontamente le fette nel becher della soluzione enzimatica. Non lasciare asciugare il materiale, in quanto ciò ridurrà il numero di protoplasti ottenuti. Ruotare delicatamente la soluzione enzimatica per bagnare il materiale.<ol><li>Posizionare un coperchio di alluminio sul becher per bloccare la luce. Ripetere il processo di affettatura e trasferimento fino a quando l'intero pacchetto non viene tagliato vicino alla clip raccoglitrice.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire il becher della soluzione enzimatica in un barattolo a campana. Infiltrato sotto vuoto tra -50,8 kPa e -67,7 kPa rispetto alla pressione ambiente per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire il becher su uno shaker da tavolo. Agitare a 40 RPM per 2,5 ore a temperatura ambiente. Ruotare delicatamente il becher a mano. Quando completamente digerita, la soluzione enzimatica apparirà leggermente lattiginosa. Se la soluzione è ancora limpida, continuare a agitare a 40 RPM per un massimo di un'ora aggiuntiva. Non superare le 3,5 ore.</li>
	<li>Durante la digestione, preparare una soluzione di mannitolo + MES + MgCl2 (MMG), una soluzione di glicole polietilenico (PEG) e una soluzione di incubazione.<ol><li>MMG: aggiungere 5,47 g di mannitolo, 200 μL di 1 M MES, pH 5,7 e 750 μL di 1 M MgCl2 in una provetta da centrifuga da 50 ml. Riempire a 50 ml con H2O. Vortex distillato per sciogliere. Mettere sul ghiaccio.</li>
		<li>Soluzione di incubazione: aggiungere 5,47 g di mannitolo, 200 μL di 1 M MES a pH 5,7 e 200 μL di 1 M KCl in una provetta da centrifuga da 50 ml. Riempire a 50 ml con H2O. Vortex distillato per sciogliere. Mettere sul ghiaccio.</li>
		<li>Soluzione PEG: aggiungere 0,44 g di mannitolo, 1,0 g di PEG e 400 μL di 1 M CaCl2 in una provetta da centrifuga da 15 ml. Riempire a 4 mL con H2O distillato. Vortex per mescolare. Incubare a 37 °C agitando per 30 minuti fino a completa dissoluzione. Conservare a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Agitare la soluzione enzimatica a 80 RPM per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare il becher con la soluzione enzimatica sul ghiaccio. Non rimuovere il rivestimento in alluminio. Aggiungere 20 ml di MMG ghiacciato alla soluzione enzimatica. Filtrare attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta da centrifuga da 50 ml. NOTA: Tenere tutte le soluzioni in ghiaccio per i passaggi successivi fino all'aggiunta del PEG. Tenere i protoplasti coperti con un foglio per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.</li>
	<li>Dividere il filtrato in volumi uguali di 10 ml ciascuno. Versare ogni volume in un tubo di centrifuga di vetro a fondo rotondo e centrifugare per 4 minuti a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Eliminare il surnatante e aggiungere 1 mL di MMG ghiacciato a ciascuna provetta. Risospendere i pellet ruotando delicatamente e picchiettando i tubi. Unire i campioni in un unico tubo di centrifuga di vetro a fondo rotondo. Aggiungere MMG ad un volume totale di 5 ml. Centrifugare per 3 minuti a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare con 5 ml di MMG e centrifugare per 3 minuti a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Ripetere il lavaggio con 5 ml di MMG e centrifugare per 3 minuti a 100 x g a temperatura ambiente. Dopo aver girato il secondo lavaggio, osservare se il surnatante è chiaro. Se rimane nuvoloso, eseguire un terzo lavaggio.</li>
	<li>Risospendere i protoplasti in 1 mL di MMG. Coprire liberamente con un foglio e tenere in ghiaccio.</li>
	<li>Determinare la resa del protoplasto e verificare la vitalità.<ol><li>In una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, sommare 4 μL di protoplasti e 72 μL di MMG.</li>
		<li>In una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 1 μL di soluzione madre di diacetato di fluoresceina allo 0,5% (FDA) a 49 μL di MMG per ottenere una soluzione di lavoro 20x. Aggiungere 4 μL di soluzione di lavoro FDA al tubo con i protoplasti diluiti. Incubare per 5 minuti al buio a temperatura ambiente.</li>
		<li>Caricare 11 μL della miscela di protoplasti su un emocitometro. Mettere sotto un microscopio ottico a campo chiaro. Confermare visivamente che le cellule mancano di pareti cellulari. Quindi, conta il numero di protoplasti. Utilizzare questo conteggio per stimare il numero totale di protoplasti ottenuti. Quindi, conta il numero di protoplasti che diventano verdi fluorescenti sotto la luce UV quando sono colorati con FDA. Gli isolamenti di protoplasti di successo producono una vitalità del 70% -90%.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Trasfezione mediata da PEG
<ol><li>A partire dalla concentrazione stimata di protoplasti dal punto 3.17, regolare a ~10.000 protoplasti / μL. Se la concentrazione è bassa, centrifugare per 3 minuti a 100 x g e risospendere in MMG fino a una concentrazione di ~10.000 protoplasti/μL.</li>
	<li>Mescolare ~1.000.000 di protoplasti con 15 μg di DNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Rabboccare la miscela con MMG a 114,4 μL e incubare su ghiaccio per 30 minuti.</li>
	<li>Risospendere i protoplasti toccando il lato del tubo. Aggiungere 105,6 μL di soluzione PEG al 25% ai protoplasti per raggiungere un peso/volume finale del 12% di PEG. Mescolare delicatamente capovolgendo 5-10 volte. I protoplasti in soluzione di PEG sono fragili; Non scuotere il tubo. Incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente. NOTA: La trasfezione può essere scalata in multipli dei volumi indicati nei passaggi 4.2 e 4.3. Ad esempio, 10 milioni di protoplasti e 150 μg di DNA possono essere sospesi in 1.444 μL di MMG e trattati con 1.056 μL di soluzione di PEG in una provetta da centrifuga da 50 ml.</li>
	<li>Diluire con 5 volumi di soluzione di incubazione. Mescolare delicatamente per inversione. Centrifugare per 4 minuti a 100 x g a temperatura ambiente. NOTA: In caso di ingrandimento, dividere i protoplasti in più tubi di vetro a fondo rotondo contenenti non più di 10 ml ciascuno per garantire la completa pellettizzazione. Aumentare proporzionalmente il volume della soluzione di incubazione utilizzata per il lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Lavare con 1-5 ml di soluzione di incubazione e centrifugare per 3 minuti a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere i protoplasti nella soluzione di incubazione ad una concentrazione di 500-1.000 cellule/μL.</li>
	<li>Incubare i protoplasti al buio durante la notte (~16 h) a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. Recupero dei protoplasti e verifica dell'espressione
<ol><li>Girare i protoplasti per 4 minuti a 100 x g a temperatura ambiente. NOTA: In caso di ingrandimento, dividere i protoplasti in più tubi di vetro a fondo rotondo contenenti non più di 10 ml ciascuno.</li>
	<li>Lavare con 1-5 ml di soluzione di incubazione e centrifugare per 3 minuti a 100 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere e unire in 1-5 ml di soluzione di incubazione.</li>
	<li>Se i protoplasti sono trasfettati con un gene reporter fluorescente (ad esempio, GFP), prendere un'aliquota per verificare l'efficienza di trasfezione. Utilizzando un emocitometro, contare prima il numero totale di protoplasti utilizzando la microscopia a luce a campo chiaro. Quindi, contare la frazione di protoplasti fluorescenti sotto luce UV.</li>
	<li>Centrifugare i protoplasti per 3 minuti a 100 x g a temperatura ambiente. NOTA: I protoplasti sono ora pronti per applicazioni a valle come l'estrazione dell'RNA con fenolo e isotiocianato di guanidina.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Come riportato in precedenza, la qualità del materiale vegetale utilizzato per la protoperdurtura è essenziale per ottenere protoplasti di alta qualità16,17,18. È fondamentale selezionare foglie sane senza macchia. Questo lavoro ha utilizzato la popolare cultivar di mais di ricerca B73. Non abbiamo testato altre cultivar. Le piantine di mais utilizzate per questo protocollo sono state coltivate al buio perché le foglie etiolate producono protoplasti con maggiore vitalità 16 ore dopo la trasfezione rispetto ai protoplasti da foglie verdi. Per le applicazioni che non richiedono l'incubazione notturna, sarebbe possibile utilizzare materiale fogliare verde o verde.
Un passaggio critico è tagliare correttamente il materiale fogliare in fette sottili prima della digestione enzimatica. Questo processo aumenta la superficie per le cellule mesofille da esporre alla soluzione enzimatica, che aumenta il numero di protoplasti recuperati. Le punte delle foglie distali vengono scartate e le fette sottili (≤1 mm) vengono tagliate con nuove lamette da barba, che vengono sostituite immediatamente quando iniziano a opacizzarsi. Per una data quantità di tessuto, fette più sottili producono più protoplasti a condizione che venga impiegata la tecnica corretta per ridurre al minimo lo schiacciamento delle foglie.
Anche lavare correttamente i protoplasti è importante, poiché sono piuttosto delicati dopo aver subito la rimozione della parete cellulare. Dopo la digestione, tutte le soluzioni vengono mantenute sul ghiaccio e i protoplasti cresciuti scuri sono protetti dalla luce. L'osmolarità e il pH vengono tamponati eseguendo i lavaggi in soluzione MMG. Per isolare i protoplasti dai detriti cellulari meno densi, la centrifugazione avviene a 100 x g. I protoplasti centrifugati a 200 x g mostrano una vitalità simile dopo l'isolamento, ma una minore vitalità il giorno seguente, e trasformano anche circa la metà. Si consiglia di verificare la vitalità dei protoplasti mediante colorazione con FDA (diacetato di fluoresceina) subito dopo l'isolamento; La normale vitalità varia tra il 70% e il 90%. I protoplasti con vitalità inferiore al 40% dopo l'isolamento producono pochi trasformanti.

La pellettizzazione e il lavaggio sono più facili quando si lavora con molti protoplasti perché dopo la trasfezione si ottiene un pellet ben visibile. Per questo motivo, la trasfezione viene eseguita con 1 milione o più di protoplasti. Quando si amplia il protocollo, è necessario selezionare un recipiente di dimensioni appropriate per le fasi di incubazione (provetta da centrifuga da 1,5 ml, 15 ml o 50 ml) e il volume di soluzione utilizzato per le fasi di lavaggio deve essere scalato di conseguenza. In ogni caso, è utile centrifugare in ≤10 ml di aliquote per assicurarsi che i protoplasti non rimangano nel surnatante. Un'innovazione di questo protocollo è la rimozione della fase di incubazione e lavaggio di 1 ora nella soluzione W5 che è elencata in altri protocolli14,19, che si è rivelata inutile nelle nostre mani.
Come visto in altri studi, la quantità e la qualità del DNA sono entrambe fondamentali per il successo della trasfezione19. Per i plasmidi nell'intervallo 4-6 kb, vengono utilizzati 15 μg di DNA per 1 milione di protoplasti. Preparazioni di DNA di scarsa qualità possono comportare una ridotta vitalità dopo la trasfezione, quindi si consiglia di utilizzare un kit di estrazione del DNA commerciale quando si isolano i plasmidi dai batteri. L'incubazione dei protoplasti durante la notte viene effettuata a temperatura ambiente al buio per consentire la trascrizione del plasmide o della libreria plasmidica riducendo al minimo lo stress. Dopo l'incubazione durante la notte, viene recuperata circa la metà del numero di protoplasti originariamente trasfettati. I protoplasti sono diluiti ad una concentrazione di 500-1.000 cellule/μL per l'incubazione notturna. I protoplasti lasciati incubare durante la notte a concentrazioni superiori a 1.000 cellule / μL hanno tassi di recupero più bassi e una minore vitalità. A concentrazioni più elevate, i detriti di protoplasti danneggiati e morti possono contribuire alla morte dei protoplasti vicini. Lavare i protoplasti dopo l'incubazione notturna serve sia a rimuovere questi detriti che a rimuovere il plasmide in eccesso.
Protocolli come questi hanno la limitazione che non tutte le specie vegetali o i tipi di tessuto sono suscettibili di protoplasti. Inoltre, le differenze di espressione genica possono essere indotte dal processo di protoblasting.
In sintesi, abbiamo dettagliato un protocollo semplice e scalabile per isolare e trasfettare milioni di protoplasti vitali dalla coltura agricola di base Z. mays. Questo metodo può trasfettare molti più protoplasti usando PEG, con un'efficienza di trasformazione quasi pari a quella dei metodi basati sull'elettroporazione15. Il maggior numero netto di trasformanti consente di testare centinaia o migliaia di costrutti in esperimenti su larga scala come i saggi reporter massivamente paralleli12,13. I futuri esperimenti su scala genomica nel mais consentiranno agli scienziati di comprendere meglio l'espressione genica del mais e la regolazione genica.

L'espressione genica transitoria è un potente strumento in biologia vegetale. Tuttavia, le cellule vegetali sono difficili da trasfettare perché sono circondate da una parete cellulare. Questa barriera all'ingresso del DNA non è presente in altri tipi di cellule comunemente studiate come le cellule dei mammiferi o degli insetti. La ricerca precedente ha affrontato questa sfida impiegando protoplasti: cellule vegetali le cui pareti cellulari sono state digerite e rimosse. A differenza del tessuto fogliare non trasformato, i protoplasti vegetali sono facili da lavorare in sospensione e suscettibili di tecniche di trasfezione mediate dall'elettroporazione o dal glicole polietilenico (PEG)1. Le cellule vegetali mantengono gran parte della loro funzionalità anche dopo la rimozione della parete cellulare. Pertanto, i protoplasti sono utilizzati in una varietà di piante per studiare la funzione genica e proteica2,3, per comprendere la trasduzione del segnale4 e per identificare possibili bersagli per la selezione delle piante5. I protoplasti sono anche un veicolo conveniente per lo screening dei costrutti di modifica del genoma in diverse specie di colture tra cui grano e patate 6,7. In breve, i saggi transitori nei protoplasti sono indispensabili per la biotecnologia agricola.
Il mais (Zea mays L.) è la coltura cerealicola leader mondiale per tonnellaggio; Come tale, è un obiettivo importante della ricerca scientifica vegetale di base e applicata8. Tuttavia, a differenza delle piante modello come la Nicotiana tabacum9, l'espressione transgenica transitoria nelle foglie di mais intatte non viene eseguita di routine. Protoplasting è stato utilizzato per ottenere e trasfettare cellule di mesofillo delle foglie di mais10,11. I metodi precedenti hanno raggiunto efficienze di trasfezione fino al 75% utilizzando l'elettroporazione e prodotto protoplasti trasfettati su una scala di decine di migliaia10,15.
Questo protocollo descrive in dettaglio come protoplastare milioni di cellule di mesofillo di mais e trasfettarle con un'efficienza paragonabile ai metodi precedenti. Le fasi principali sono la crescita di piantine di mais etiolato, la raccolta del tessuto fogliare, la digestione della parete cellulare vegetale e la consegna del DNA plasmidico nelle cellule utilizzando PEG. Il contributo chiave di questo protocollo è la capacità di aumentare la trasfezione dei protoplasti mantenendo la vitalità cellulare richiesta per i saggi funzionali. Ciò consente l'uso di esperimenti su scala genomica, come saggi reporter massivamente paralleli, che possono testare la funzione di centinaia di migliaia di regioni in tutto il genoma del mais. Questo metodo è stato recentemente utilizzato per studiare grandi librerie di elementi del DNA cis-regolatori, inclusi potenziatori e promotori12,13,14.

<table><tbody><tr><td>Provette graduate per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>490004-444</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga conica Falcon da 15 mL</td><td>Corning</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere in vetro Pyrex da 250 mL</td><td>Fisher</td><td>50-121-5005</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per celle a rete in nylon da 40 um</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 50 mL</td><td>Corning</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>72 vassoio di propagazione cellulare</td><td>T.O. Plastics</td><td>725607C</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>VWR</td><td>89107-732</td><td></td></tr><tr><td>Campana</td><td>Bel-Art</td><td>F42022-0000</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-250ML</td><td>Sciogliere in H2O ultrapuro per ottenere una soluzione madre 1M. Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2*2H2O)</td><td>PhytoTech Labs</td><td>C135</td><td>Sciogliere in H2O ultrapuro per ottenere una soluzione madre 1M. Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Cellulasi Onozuka R-10</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C8001.0010</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitolo</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M562</td><td></td></tr><tr><td>Ambito di dissezione</td><td>Reichert</td><td>Microstar IV</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato di fluoresceina (FDA)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>F1303</td><td>Sciogliere in acetone allo 0,5% peso/volume per ottenere una soluzione stock 1000X. Proteggere dalla luce e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Sistemi di illuminazione a fluorescenza</td><td>Prior</td><td>Lumen200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>MDG36</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga ad alta capacità</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M8002.0005</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M292-1KG</td><td>Sciogliere in H2O ultrapuro per ottenere uno stock di 1M soluzione. Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Semi di mais</td><td>B73</td><td>USDA-ARS</td><td>https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473</td></tr><tr><td>Clip legante medio</td><td>Uline</td><td>S-24649</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5287-250G</td><td>Sciogliere in H2O ultrapuro per ottenere una soluzione madre 1M. Regolare il pH a 5,7 utilizzando KOH. Proteggere dalla luce e conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Micropipetta 20-200 uL</td><td>Gilson</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro per microvolumi</td><td>Nanodrop Thermofischer Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa E. coli competente</td><td>New England BioLabs</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro Neubauer</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>No. 9 Lama di rasoio a filo singolo</td><td>Excel</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>VWR</td><td>89032-104</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilene) glicole 4.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81240-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1KG</td><td>Sciogliere in H2O ultrapuro per ottenere una soluzione madre 1M. Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr>Prato e prato in <td>vermiculite</td> NK di grado professionale <td> Garden</td><td>G208</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga in vetro a fondo tondo 30 mL</td><td>Kimble Chase</td><td>45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore in gomma per provette da centrifuga Corex</td><td>Corning</td><td>CLS8445AO</td><td></td></tr><tr><td>Muschio di torba di sfagno</td><td>Premier Horticulture</td><td>0128P</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubo per vuoto</td><td>VWR</td><td>76336-844</td><td></td></tr><tr><td>Vacuometro</td><td>Wika</td><td>4269978</td><td></td></tr></tbody></table>

trasfezione scalabile dei protoplasti mesofilli di mais

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

La trasfezione delle cellule di mesofillo del mais spesso comporta la digestione delle pareti cellulari vegetali per creare protoplasti e quindi l'inserimento di DNA tramite elettroporazione o glicole polietilenico (PEG). I metodi precedenti sono stati sviluppati per produrre decine di migliaia di protoplasti trasfettati contemporaneamente. Qui, descriviamo un metodo semplice per isolare e trasfettare milioni di protoplasti di mesofillo fogliare nel mais (Zea mays L.). Questo processo semplificato rimuove alcuni passaggi comuni di protodurata, come il lavaggio in W5. Inoltre, passaggi come la centrifugazione, la trasfezione mediata da PEG e l'incubazione sono stati modificati per funzionare con un numero maggiore di protoplasti. La capacità di esprimere grandi librerie di costrutti plasmidi consente esperimenti su scala genomica, come saggi reporter massivamente paralleli nel mais.

Il tessuto più adatto per l'isolamento del protoplasto è la seconda e la terza foglia di piantine di 10-11 giorni (Figura 1). In questo lavoro, abbiamo ottenuto circa 10 milioni di protoplasti da 16 sezioni fogliari, ognuna delle quali era lunga 10 cm. Il numero di protoplasti isolati dipende dalla massa del materiale fogliare e dalla larghezza delle fette fogliari che vengono digerite nella soluzione enzimatica.
Sotto un microscopio ottico a campo chiaro, i protoplasti non danneggiati appaiono approssimativamente sferici, con plastidi che punteggiano la superficie (Figura 2A). Prima di procedere alla trasfezione, la vitalità può essere verificata colorando una piccola aliquota di protoplasti con diacetato di fluoresceina (FDA). I protoplasti colorati con FDA che fluoreggiano sotto la luce UV sono considerati vitali (Figura 2B, C). Non tutti i protoplasti che appaiono intatti sono ancora vitali e alcuni protoplasti vitali potrebbero essere in procinto di morire per evacuolazione (Figura 2C). In queste cellule, il vacuolo si gonfia e alla fine verrà espulso dalla membrana cellulare.
La figura 3 mostra protoplasti trasformati con pJT01, un plasmide di espressione di mais di 4,3 kb derivato da CD3-911 (ABRC)15. La trasfezione determina l'espressione di sGFP contrassegnato con un segnale di localizzazione nucleare C-terminale da c-Myc (Figura 3A). La proporzione di protoplasti che esprimono sGFP è stata misurata in più esperimenti utilizzando un emocitometro. L'efficienza mediana di trasfezione raggiunta con questo metodo è stata del 40% dopo l'incubazione notturna (n = 9, Figura 4, Tabella 1), che è paragonabile ai metodi precedentemente pubblicati15. A seconda dell'applicazione sperimentale, se il plasmide o la libreria di plasmidi manca di un reporter fluorescente, si raccomanda di includere un controllo positivo per confermare la trasfezione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig01.jpg"> Figura 1: Piantina di mais etiolata rappresentativa coltivata al buio per 10 giorni dopo la germinazione. Le frecce indicano la seconda e la terza foglia, che sono più adatte per la protoplasta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig02.jpg"> Figura 2: Microscopia a fluorescenza della vitalità del protoplasto dopo l'isolamento. (A) Immagine in campo chiaro dei protoplasti immediatamente dopo l'isolamento. (B) Il segnale di fluorescenza dei protoplasti colorati con FDA. (C) Sovrapposizione di campo chiaro e fluorescenza che mostra i protoplasti vitali. La freccia mostra un protoplasto in fase di evacuazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig03.jpg"> Figura 3: Microscopia a fluorescenza di protoplasti trasfettati con sGFP . (A) Immagine in campo chiaro dei protoplasti dopo la trasfezione. (B) Il segnale di fluorescenza dei protoplasti trasfettati nel canale GFP. (C) Sovrapposizione di campo chiaro e fluorescenza che mostra i protoplasti trasformati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig04.jpg"> Figura 4: Percentuale di protoplasti che mostrano fluorescenza GFP dopo 16 ore di incubazione. L'efficienza di trasfezione variava tra gli studi indipendenti, con l'efficienza più bassa intorno al 20% e la più alta vicina al 50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Prova</td>
			<td>Conteggio delle celle GFP</td>
			<td>Totale celle contate</td>
			<td>Percentuale GFP</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>104</td>
			<td>261</td>
			<td>39.8</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>148</td>
			<td>298</td>
			<td>49.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>84</td>
			<td>258</td>
			<td>32.6</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>137</td>
			<td>271</td>
			<td>50.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>127</td>
			<td>299</td>
			<td>42.5</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>107</td>
			<td>235</td>
			<td>45.5</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>83</td>
			<td>360</td>
			<td>23.1</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>134</td>
			<td>549</td>
			<td>24.4</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>61</td>
			<td>201</td>
			<td>30.3</td>
		</tr><tr><td>Significare</td>
			<td>109</td>
			<td>304</td>
			<td>36</td>
		</tr><tr><td>Deviazione standard</td>
			<td>29</td>
			<td>102</td>
			<td>10</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Efficienza rappresentativa della trasfezione dei protoplasti. Dati di nove recenti studi di prototipping nel laboratorio degli autori.
File supplementare 1: file di testo in formato GenBank con la sequenza di pJT01. Un plasmide di espressione sGFP di 4,3 kb funge da controllo positivo nei protoplasti di mais trasfettati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/pJT01_gfp_cmyc.gb.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Qui, presentiamo un protocollo ad alto rendimento per trasfettare transitoriamente milioni di protoplasti di mais per testare grandi librerie di plasmidi nelle cellule di mesofillo del mais.

Trasfezione scalabile dei protoplasti mesofilli di mais

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Hello.Today vi mostreremo un protocollo che protoplasme milioni di cellule di mesofillo di mais e le trasformeremo ad alta efficienza. I passaggi principali del protocollo sono prima di tutto digerire e rimuovere la parete cellulare della pianta, rilasciare i protoplasti e quindi trasformare il protoplasto usando PEG. La grande differenza tra questo protocollo e gli altri è la scala di trasformazione.La maggior parte dei protocolli finisce con tra 1.000 e 10.000 protoplasti trasformati. Tuttavia, il nostro protocollo fornisce milioni di protoplasti di mais trasformati. Qui abbiamo piantine di mais coltivate al buio da nove a 11 giorni dopo la germinazione.Tagliare le piantine appena sopra il livello del terreno e metterle in acqua. Tenere le piante al buio quando non in uso. Seleziona la seconda e la terza foglia di ogni piantina, avendo cura di escludere foglie con zone marroni o danneggiate.Seleziona da 12 a 16 foglie e taglia un centimetro dalle punte. Quindi tagliare una sezione di 10 centimetri da ogni foglia. Impilare le sezioni fogliari una sopra l'altra con le estremità basali insieme.Fissare il fascio insieme all'estremità basale usando una clip legante. Metti il fascio di foglie su un pezzo di carta bianca. Tagliare fette di foglie larghe da 0,5 a un millimetro.È importante tagliare fette sottili e consistenti. Dopo aver tagliato parte del fascio fogliare, trasferire le fette nella soluzione enzimatica. Non lasciare che il materiale si asciughi.Ruotare delicatamente la soluzione enzimatica per bagnare il materiale. Posizionare un foglio sopra il becher per bloccare la luce. Ripetete questo processo fino a quando l'intero pacchetto non viene tagliato vicino alla clip raccoglitrice.Dopo il taglio, la soluzione dovrebbe assomigliare a questa. Trasferire il becher della soluzione enzimatica in un barattolo a campana. Infiltrarsi sottovuoto per tre minuti a temperatura ambiente.Incubare su uno shaker da tavolo a 40 RPM a temperatura ambiente per due ore e mezza. Dopo l'incubazione, dare alla soluzione un vortice. Dovrebbe apparire lattiginoso, indicando una digestione di successo.Incubare sullo shaker da tavolo a 80 RPM a temperatura ambiente per altri 10 minuti. Posizionare il becher con la soluzione enzimatica sul ghiaccio. Interrompere la digestione aggiungendo un volume di MMG ghiacciato.Filtrare attraverso un filtro a celle da 40 micron in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Dividere la soluzione in aliquote di non più di 10 millilitri ciascuna. Versare nei tubi di vetro con fondo rotondo refrigerato.Centrifugare i tubi a 100 g per quattro minuti. Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere, quindi raggruppare i campioni per i lavaggi successivi.Lavare i protoplasti due volte con cinque millilitri di MMG. Girare ogni volta a 100 G per tre minuti. Il pellet dovrebbe essere di un bel colore verde giallo brillante.Sarai in grado di risospendere il pellet ruotando delicatamente il tubo. Risospendere in un millilitro di MMG e diluire una piccola aliquota da 10 a 20x per il conteggio. È importante risospendere bene prima dell'aliqouting, poiché i protoplasti si stabilizzeranno rapidamente.Caricare i protoplasti diluiti nell'emocitometro. Contare i protoplasti al microscopio ottico. Una buona preparazione non avrà molti detriti in eccesso che galleggiano dopo il lavaggio.I protoplasti buoni sono circolari con plastidi visibili. Utilizzare il conteggio delle celle per calcolare il numero totale. Questa preparazione ha portato a poco più di 10 milioni di protoplasti.Si consiglia di verificare la vitalità utilizzando colorante diacetato di fluoresceina. Gli isolamenti dei protoplasti di successo producono una vitalità tra il 70 e il 90%Mescolare i protoplasti con il plasmide di interesse. Questo esempio utilizza 1 milione di protoplasti e 15 microgrammi di DNA.Incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Risospendere toccando il lato del tubo. Aggiungere la soluzione PEG per raggiungere una concentrazione finale del 12% di PEG.Mescolare delicatamente capovolgendo più volte. I protoplasti e la soluzione PEG sono fragili, quindi non agitare il tubo. Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti.Diluire con cinque volumi di soluzione di incubazione e mescolare delicatamente per inversione. Centrifugare i tubi a 100 g per quattro minuti. Lavare una volta con un millilitro di tampone di incubazione.Fare attenzione a non disturbare il pellet. Girare a 100 G per tre minuti. Risospendere nel tampone di incubazione ad una concentrazione da 500 a 1000 cellule per microlitro.Incubare al buio durante la notte a temperatura ambiente. Il giorno dopo, girare a 100 G per quattro minuti. Lavare due volte con una soluzione di incubazione refrigerata.Centrifugare ogni volta per tre minuti a 100 G a temperatura ambiente. Risospendere, quindi caricare una piccola aliquota sull'emocitometro per il controllo finale. Innanzitutto, conta il numero totale di protoplasti sotto campo luminoso.Ora, osservate la frazione di protoplasti che fluoreggiano sotto UV per verificare la trasfezione. I protoplasti stanno esprimendo il nostro reporter GFP. Ora, otteniamo alcune metriche sull'efficienza della trasfezione.In questa preparazione, abbiamo ottenuto 10 milioni di protoplasti totali, di cui abbiamo trasfettato 1 milione. Il giorno dopo, ne abbiamo recuperati 335.000. Di questi, abbiamo avuto un tasso di trasformazione del 30,3% Questo ci lascia con il nostro totale di circa 100.000 protoplasti che esprimono GFP.L'efficienza della trasfezione può variare. Come si può vedere nel grafico, vediamo regolarmente efficienze tra il 20 e il 50% tra i preparativi ripetuti. Questo protocollo consente la raccolta e la trasformazione di milioni di protoplasti di mesofillo di mais.Una delle parti migliori del protocollo è la sua capacità di scalare. Scalando la quantità di volume e il numero di protoplasti utilizzati nella trasformazione, è possibile aumentare la trasformazione di oltre un ordine di grandezza rispetto a quanto mostrato oggi. Ad oggi, il nostro più grande esperimento a tubo singolo è iniziato con 20 milioni di protoplasti e 200 microgrammi di DNA e si è concluso con 3,1 milioni di protoplasti trasformati il giorno successivo.Questo protocollo ad alto rendimento è particolarmente utile quando è necessario testare molti diversi costrutti plasmidici, ma i collaboratori hanno utilizzato questo protocollo per scopi che non richiedono la capacità di scalare, come la progettazione di circuiti genici sintetici e mais. Grazie per aver guardato il nostro video. Speriamo che sia stato d'aiuto.

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