Name: Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Scopri come ottimizzare la microscopia a fluorescenza per visualizzare il trasporto assonale di carichi endogeni in Caenorhabditis elegans. Questo protocollo migliora l'imaging di proteine citosoliche abbondanti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Miglioramento dell'analisi del trasporto assonale in C . elegans vivente utilizzando RAB-3 con tag GFP

<ol><li>Millecamps, S., Julien, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axonal+cytoskeleton%3A+from+organization+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The axonal cytoskeleton: from organization to function.</a> Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).</li>
<li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+unseen%3A+the+hidden+world+of+slow+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport.</a> Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).</li>
<li>Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+proteins+are+selectively+delivered+to+axons+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons.</a> Elife. 12, e82568(2023).</li>
<li>Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap%2C+a+toolkit+for+high-throughput+CRISPR%2FCas9+gene+modification+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).</li>
<li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+to+analyze+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons.</a> J Vis Exp. (128), e56690(2017).</li>
<li>Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cgc.umn.edu/">https://cgc.umn.edu/</a> (2023).</li>
<li>Ghanta, K. S., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melting+dsDNA+donor+molecules+greatly+improves+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).</li>
<li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NATF+%28Native+and+Tissue-Specific+Fluorescence%29%3A+A+strategy+for+bright%2C+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+Project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Taylor, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+topography+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular topography of an entire nervous system.</a> Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Takihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Li, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+kinesin+UNC-104%2FKIF1A+is+a+key+regulator+of+synaptic+aging+and+insulin+signaling-regulated+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory.</a> Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).</li>
<li>Viancour, T. A., Kreiter, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+fast+axonal+transport+rates+in+young+and+old+rat+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons.</a> Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).</li>
<li>Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decrease+in+axonal+transport+measured+by+MR+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo.</a> Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).</li>
<li>Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Lissencephaly-1+levels+augments+mitochondrial+transport+and+has+a+protective+effect+in+adult+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons.</a> J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Hall, D. H., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+posterior+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+serial+reconstruction+of+identified+neurons+and+complete+pattern+of+synaptic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions.</a> J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+ventral+nerve+cord+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-binding+protein+1+promotes+specific+motor-cargo+association+in+the+cell+body+prior+to+axonal+delivery+of+dense+core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles.</a> Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+homology-directed+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-wrmScarlet+and+split-sfGFP%3A+tools+for+faster%2C+easier+fluorescent+labeling+of+endogenous+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 217 (4), (2021).</li>
<li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap+assembly+of+Caenorhabditis+elegans+MosSCI+transgene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors.</a> G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).</li>
<li>Glomb, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-1+adaptor+complex+controls+bimodal+slow+axonal+transport+of+spectrin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti (22 mm x 22 mm, No1); Vetro copri sigillo d'oro</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A14</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>ChemCruz</td><td>sc-205730</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio: microscopio invertito Nikon Ti2, testina di scansione Yokogawa CSU-W1 SoRa, fotocamera Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, obiettivo a immersione in olio Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA, scanner per fotostimolazione Nikon a 488 nm con filtro di emissione ET525/36</td><td>Microscopio</td><td></td> confocale a disco rotante Nikon <td></td></tr><tr><td>&nbsp; NIS-elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software per la Nikon Ti2&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopia semplici prepuliti</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo di nematodi</td><td>Identificatore</td><td>Fonte</td><td></td></tr><tr><td>rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)</td><td>Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)</td><td>MTS1161&nbsp;</td><td>Sarà depositato presso CGC (https://cgc.umn.edu/)</td></tr></tbody></table>

ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in caenorhabditis elegans vivente

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Panoramica del sistema modello e della procedura di misurazione Per visualizzare il trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche, abbiamo tracciato endogenamente il RAB-3 marcato con GFP. Qui facciamo uso di un ceppo6 di GFP::Flip-on::RAB-3 generato di recente, in cui l'espressione della ricombinasi Flippasi sotto un promotore specifico cellulare (glr-4p) etichetta il RAB-3 endogeno nel motoneurone DA9. DA9 è un motoneurone bipolare, con il suo corpo cellulare situato nella parte posteriore dell'animale sul lato ventrale, vicino all'ano (Figura 1A). Contiene un corto dendrite che corre anteriormente lungo il cordone nervoso ventrale e un lungo assone che corre posteriormente, forma una commessura e poi corre anteriormente lungo il cordone nervoso dorsale, dove forma sinapsi en passant che innervano il muscolo dorsale e il neurone VD 22,23,24. Visualizziamo il trasporto assonale nella regione asinaptica; la maggior parte degli eventi di trasporto può essere catturata con un singolo piano focale (Figura 1A). Viene attuata una fase iniziale di foto-sbiancamento per ridurre lo sfondo delle vescicole stazionarie in quest'area, che spesso tendono a fermarsi in questa regione (Figura 1B). I video time-lapse vengono registrati nell'arco di 3 minuti e il segnale RAB-3 lungo la regione asinaptica viene tracciato in un chimografo per estrarre i singoli eventi di trasporto (Figura 1C).
Regolazione dei parametri di acquisizione per ottimizzare la visualizzazione del trasporto assonale Per superare la bassa intensità del segnale di molte proteine marcate con fluorescenza endogena, i parametri di acquisizione del microscopio devono essere ottimizzati. Per una solida quantificazione degli eventi di trasporto, l'intensità del segnale dei singoli eventi di trasporto deve essere il più luminosa possibile sul fondo citoplasmatico o in pausa e sul carico stazionario. I precursori delle vescicole sinaptiche spesso si fermano nella regione asinaptica in pool di vescicole distinte, che interferiscono con l'individuazione di nuove vescicole in arrivo e rendono difficile seguire le loro tracce di trasporto7.
Una singola fase iniziale di sbiancamento della fluorescenza può ridurre fortemente il segnale di fluorescenza derivante dai pool di vescicole per migliorare il rilevamento del movimento di nuove vescicole in arrivo (Figura 2A). La fase di sbiancamento ha solo leggermente aumentato il segnale del movimento delle vescicole di RAB-3 oltre l'intensità del fondo citoplasmatico, probabilmente perché la frazione citoplasmatica di RAB-3 è molto bassa (Figura 2D).
L'uso del binning fornisce un livello aggiuntivo per migliorare il segnale sullo sfondo dei singoli eventi di trasporto combinando una matrice di pixel in un singolo pixel. Un binning 2 x 2 dimezzerà la risoluzione spaziale (qui da 108,33 nm/pixel a 216,7 nm/pixel), che è ancora sufficiente per tracciare le singole particelle di trasporto RAB-3 (Figura 2B) ma migliora notevolmente l'intensità del segnale delle singole vescicole (Figura 2D). A meno che non sia richiesta una risoluzione spaziale molto elevata, il binning può essere applicato anche per visualizzare molti altri carichi assonali.
Successivamente, ci siamo chiesti in che modo le variazioni del tempo di esposizione possono migliorare l'intensità del segnale dei singoli eventi di trasporto. Abbiamo incluso in particolare il tempo di esposizione nell'analisi per dimostrare che un tempo di esposizione fino a 500 ms con 700 ms tra i successivi punti temporali di imaging fornisce ancora una risoluzione temporale alla quale i precursori delle vescicole sinaptiche possono essere tracciati (Figura 2C, D).
Generazione e analisi di chimografi con Fiji Per generare un chimografo e analizzare i singoli eventi di trasporto, attenersi alla procedura descritta nella Figura 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del sistema modello per visualizzare il trasporto assonale di RAB-3 fluorescente endogeno. (A) Pannello superiore: Panoramica del nematode con indicato l'asse posteriore-anteriore e ventrale-dorsale. Il motoneurone DA9 è etichettato in blu. Pannello centrale: ingrandisce la regione in scatola mostrata nel pannello superiore con la compartimentazione DA9 indicata. Le sinapsi en passant sono illustrate in verde, * indica l'ano. Si noti che l'assone continua nel cordone nervoso dorsale fino a quando non supera la vulva. La casella rossa indica la regione della zona asinaptica. Pannello inferiore: Immagine al microscopio confocale di GFP endogena marcata con RAB-3 nell'assone prossimale su un singolo piano focale. Si noti che ci sono pozzi di vescicole di RAB-3 in pausa più lunga nella regione asinaptica, sebbene la maggior parte dei gruppi di segnali RAB-3 nella regione sinaptica. La regione asinaptica è inscatolata in rosso. Scala: 20 μm. (B) Immagini rappresentative di una registrazione time-lapse per visualizzare il trasporto assonale. Per migliorare la tracciabilità delle singole particelle di trasporto su particelle stazionarie, la regione asinaptica viene inizialmente fotosbiancata. I pannelli inferiori nella regione del riquadro viola mostrano un esempio di un evento di movimento anterogrado (punta di freccia arancione) e retrogrado (punta di freccia blu). I pannelli dall'alto verso il basso rappresentano punti temporali consecutivi. (C) La registrazione time-lapse in (B) è stata tracciata come un chimografo (rappresentazione 2D del tempo sulla posizione). Le linee diagonali rappresentano eventi di movimento in cui la pendenza indica la velocità. Le linee verticali mostrano gli eventi stazionari. Il riquadro viola è uno zoom avanti del chimografo per evidenziare gli eventi di trasporto che sono mostrati anche in (B) e gli eventi di trasporto anterogrado (arancione) e retrogrado (blu) sono tracciati. Le linee verticali tratteggiate indicano gli eventi di pausa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig02.jpg"> Figura 2: Ottimizzazione delle fasi e dei parametri di acquisizione per migliorare la visualizzazione del carico assonale endogeno. Le GFP::RAB-3 endogene sono state visualizzate nella zona asinaptica dell'assone DA9 scattando immagini di un singolo piano focale su un microscopio confocale a disco rotante. I chimografi sono stati acquisiti per visualizzare i singoli eventi di trasporto in direzione anterograda (da destra a sinistra) e retrograda (da sinistra a destra) (A-C). (A) I chimografi mostrano gli eventi di trasporto RAB3 senza (chimografi sinistri) o con una fase di sbiancamento integrata. Si noti che la fase di sbiancamento migliora la visualizzazione degli eventi di pausa (indicati da punte di freccia gialle) tra eventi di trasporto consecutivi (punte di freccia arancioni). (B) L'implementazione del binning 2 x 2 aiuta a migliorare l'intensità del segnale degli eventi di trasporto RAB3 deboli. Le immagini sono state acquisite con un tempo di esposizione di 300 ms e con (C) un aumento incrementale del tempo di esposizione (da 100 ms all'estrema sinistra a 500 ms all'estrema destra) aiuta a migliorare l'intensità del segnale dei singoli eventi di trasporto. Le immagini sono state acquisite con binning 2 x 2 e utilizzando una fase iniziale di fotosbiancamento. Tutti i chimografi mostrano una durata totale di 3 minuti e sono disegnati alla stessa scala in modo che i chimografi con meno punti di tempo di acquisizione a causa di un intervallo di tempo più lungo tra punti di imaging consecutivi abbiano una lunghezza totale del chimografo più breve. (D) Quantificazione dell'intensità del segnale per evento di trasporto dopo sottrazione della fluorescenza di fondo dai chimografi in (A-C). Si noti che il binning e il passaggio di sbiancamento fotografico sono stati acquisiti con un tempo di esposizione di 300 ms. Confronto statistico utilizzando n eventi per 100 ms (neventi = 27 in nanimali = 2), 200 ms (neventi = 30 in nanimali = 2), 300 ms (neventi = 88 in nanimali = 6), 500 ms (neventi = 12 in nanimali = 1), 300 ms senza (w.o.) binning (neventi = 31 in nanimali = 3), 300 ms con (w) binning (neventi = 88 in nanimali = 6) e 300 ms, Binning 2 x 2 con sbiancamento (neventi = 88 in nanimali = 6) e senza sbiancamento. Ogni punto dati rappresenta l'intensità del segnale di un singolo evento di trasporto di RAB-3 dopo la sottrazione di fondo (citoplasma dell'assone) in un singolo punto temporale lungo la sua traccia che è stato scelto casualmente. Il tempo di esposizione è stato confrontato utilizzando un test di Kruskal-Wallis seguito dal confronto multiplo di Dunn, il binning e il photo bleaching sono stati confrontati utilizzando un test di Mann-Whitney a coppie. Le barre di errore indicano la deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig03.jpg"> Figura 3: Procedura passo passo per generare un chimografo e misurare i singoli eventi di trasporto. (A) Dopo aver caricato la registrazione video nelle Fiji, lo strumento della linea segmentata viene utilizzato per tracciare una linea lungo la lunghezza del segmento assonale che verrà analizzato. (B) Un chimografo (pannello di destra) viene generato utilizzando il plug-in Kymoreslicewide con i parametri illustrati nel pannello di sinistra. (C) I singoli eventi di trasporto vengono tracciati con lo strumento di linea lineare e memorizzati nel gestore del ROI. Il pannello di destra mostra le impostazioni di misurazione utilizzate per generare la tabella dei risultati. (D) I risultati nella tabella vengono utilizzati per calcolare il parametro di trasporto. Le caselle indicano i parametri importanti descritti nella sezione dei metodi del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

optimizing-visualization-axonal-transport-endogenous-cargo

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo protocollo descrive la dissezione dal vivo...

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

L'abbondanza dei recettori dei neurotrasmettitori a livello delle sinapsi cluster influenza fortemente la forza sinaptica. Questo metodo quantifica recettori dei neurotrasmettitori marcato in fluorescenza in tre dimensioni con un singolo sinapsi...

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Questo video dimostra come le vescicole neuronali siano marcate con specifiche proteine fluorescenti per visualizzare il loro movimento. In primo luogo, un plasmide codificante per una proteina fluorescente viene incubato con un agente di trasfezione e quindi introdotto in una coltura di neuroni. Successivamente, le immagini dei neuroni vengono acquisite e analizzate per tracciare il movimento delle vescicole.

Visualizzazione delle motilità delle vescicole nei neuroni mediante imaging a fluorescenza

Il trasporto intracellulare di carichi, come vescicole o organelli, è effettuato da proteine motrici molecolari che seguono i microtubuli polarizzati. Questo protocollo descrive la correlazione della direzionalità del trasporto delle singole particelle di carico che si muovono all'interno dei neuroni, con la quantità relativa e il tipo di proteine motorie associate.

Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell&#39;analisi &quot;Cargo Mapping&quot;

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l'analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Questo studio descrive le misurazioni quantitative delle dimensioni sinaptiche e della localizzazione, della morfologia muscolare e della forma mitocondriale in C. elegans utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini liberamente disponibili. Questo approccio consente a studi futuri in C. elegans di confrontare quantitativamente l'estensione dei cambiamenti strutturali dei tessuti e degli organelli a seguito di mutazioni genetiche.

Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

È stato presentato un protocollo per l'imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Utilizzando topi fluorescenti transgenici, vengono descritti protocolli dettagliati per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione all'interno di assoni motori e sensoriali del nervo sciatico intatto in animali vivi.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Questo protocollo fornisce un approccio standardizzato per l'imaging della morfologia mitocondriale in più tessuti di C. elegans durante l'invecchiamento .

Imaging e quantificazione della morfologia mitocondriale in C. elegans durante l'invecchiamento

Qui forniamo istruzioni su come utilizzare efficacemente SegElegans, un sistema di deep learning che abbiamo sviluppato per la segmentazione automatizzata di singoli vermi in immagini di microscopia a campo largo, per il successivo utilizzo in software di analisi delle immagini come ImageJ. Forniamo modi per utilizzare il sistema sia online che offline.

Analisi automatizzata delle immagini a fluorescenza di C. elegans utilizzando SegElegans

Scopri come ottimizzare la microscopia a fluorescenza per visualizzare il trasporto assonale di carichi endogeni in Caenorhabditis elegans. Questo protocollo migliora l'imaging di proteine citosoliche abbondanti.

Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente (Video) | JoVE Journal

Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente

Esplora altri video