Le domande Microfluidic per la diagnostica e getta

Il mio nome è Catherine CloudBridge e sono professoressa di produzione, ingegneria e ingegneria biomedica presso la Boston University. Sono inoltre direttrice del Biomedical Micro Devices and Microenvironments Laboratory. Il nostro lavoro riguarda principalmente la realizzazione di dispositivi diagnostici monouso per applicazioni in contesti con risorse limitate.

Pertanto, utilizziamo la microfluidica per realizzare questi dispositivi. Siamo interessati a due campi di studio. Principalmente, ci interessa analizzare come le biomolecole e le cellule interagiscono con superfici polimeriche in plastica.

Questo è il nostro principale ombrello. Tale lavoro si concretizza in applicazioni microfluidiche per diagnostica monouso. Dunque, in laboratorio, realizziamo dispositivi microfluidici.

Nei materiali termoplastici non utilizziamo, tipicamente, il PDMS, che è il materiale gommoso usato dalla maggior parte delle persone per realizzare dispositivi microfluidici in laboratorio. Realizziamo i nostri dispositivi in termoplastici. Siamo interessati a utilizzare questi dispositivi termoplastici per eseguire biologia molecolare su scala microscopica in modo tale che tale biologia molecolare possa essere effettuata sul campo, lontano da un laboratorio centralizzato.

Il funzionamento in laboratorio prevede la realizzazione di piccole schede di plastica all'interno delle quali sono presenti colonne per l'estrazione in fase solida, colonne per la lisi cellulare o colonne per il mescolamento. Eseguiamo inoltre la reazione a catena della polimerasi sul chip come tecnica di rilevamento. Tutte queste operazioni sono integrate in un dispositivo di piccole dimensioni che, nell'ottica a lungo termine della ricerca, potrebbe diventare un dispositivo integrato utilizzabile in modo portatile sul campo o in contesti in cui non è disponibile un laboratorio di grandi dimensioni con centrifughe, incubatori termici e altri strumenti analoghi.

Pertanto, idealmente vorremmo partire da un campione umano come sangue, urina, feci o un tampone nasofaringeo, ad esempio, che consisterebbe in muco. E in uscita dal chip ottenere una risposta chiara, sì o no, riguardo all'eventuale infezione di una persona da parte di un particolare microrganismo. Per farlo, analizziamo il DNA o l'RNA, a seconda del microrganismi, di quel particolare microrganismo presente nel campione del paziente.

Le sfide tecniche che si presentano riguardano principalmente la preparazione del campione in questa procedura. Quando si parte da sangue, feci o urina, è necessario passare da una situazione in cui si ha un campione biologico umano complesso, contenente potenziali particelle o inibitori della PCR o di altre tecniche di amplificazione. L'obiettivo finale è ottenere un campione di acidi nucleici ben purificato, che possa essere utilizzato per amplificare o ricercare un particolare DNA o RNA, consentendo di determinare la presenza o meno del microrganismo ricercato.

Per pulire questi campioni, è necessario eseguire alcuni passaggi. Innanzitutto, occorre filtrare il campione, operazione che, a seconda del tipo di campione, può richiedere una filtrazione grossolana o una breve centrifugazione prima dell'applicazione sul chip. Pertanto, cerchiamo sempre di iniziare con i campioni così come vengono forniti dal clinico.

Quindi, con campioni di urina, feci e tamponi nasofaringei, il nostro obiettivo è semplicemente quello di far sì che il clinico svolga il proprio lavoro come farebbe normalmente, prelevando il campione secondo le consuete procedure. Successivamente, preleveremo tale campione e lo depositeremo sui chip. Eventuali ulteriori fasi di filtrazione necessarie a questo stadio avverranno direttamente all'interno del chip.

Il secondo passaggio prevede, poiché stiamo eseguendo saggi molecolari, la lisi delle cellule e dei microrganismi presenti nel campione. Si esegue quindi un passaggio di lisi, che di solito consiste nel forzare il campione attraverso un filtro con dimensioni dei pori molto ridotte. A volte, questo filtro contiene anche nanoparticelle come nanotubi di carbonio, dotati di bordi affilati, che possono essere utilizzati per rompere alcuni organismi con pareti cellulari più resistenti, come C difficile, un batterio gram-positivo con cui lavoriamo e che è molto difficile da lisare.

Pertanto, dobbiamo disporre di colonne di lisi più robuste. Tuttavia, in genere eseguiamo una lisi combinata chimica e meccanica all'interno del chip. Successivamente, il nostro obiettivo consiste nel prelevare il lisato ed estrarre gli acidi nucleici purificati.

Quindi passiamo la lisi, facciamo passare il lisato attraverso una colonna di estrazione in fase solida che è integrata nel chip microfluidico. Questa colonna di estrazione in fase solida è realizzata in plastica e prodotta mediante chimica avviata da fotoiniziazione all'interno del canale microfluidico, dopo che questo è già stato fabbricato. Inoltre, è generalmente impregnata con particelle di silice, poiché desideriamo legare e rilasciare gli acidi nucleici.

In alcuni casi, abbiamo utilizzato delle perle con oligo DT se desideriamo legare e rilasciare specificamente l'mRNA, ad esempio, oppure perle che presentano particolari anticorpi, se vogliamo legare e rilasciare proteine specifiche. Possiamo realizzare colonne di estrazione in grado di svolgere tutte queste funzioni. Ma oggi vi mostreremo come preparare la colonna di estrazione sase con le perle di silice.

Dopo averlo fatto, far passare il lisato sulla colonna di silice, che funziona esattamente come un kit kyogen in un laboratorio su scala macro. Successivamente si effettua un lavaggio per rimuovere tutte le sostanze indesiderate, come carboidrati, lipidi e altri componenti presenti nel lisato cellulare e nel resto del campione umano che non ci interessano. Alla fine, eluiamo con acqua.

E ciò che è vantaggioso di queste colonne di estrazione in fase solida su scala microscopica è che possiamo eluire con una quantità molto ridotta di acqua, solitamente nell'ordine di uno a cinque microlitri. E recuperiamo quasi tutti gli acidi nucleici che abbiamo inserito. Abbiamo un'efficienza del 70-90% nei primi 10 microlitri recuperati da quel canale.

Pertanto, se eseguiamo due lavaggi con due-trenta microlitri, recuperiamo quasi tutti gli acidi nucleici che abbiamo inserito. Quindi non si tratta solo di un campione purificato idoneo per la PCR, ma anche di un campione molto più concentrato rispetto a quanto ottenibile con un kit standard da banco. L'obiettivo finale di tutte queste tecniche di preparazione del campione è produrre materiali compatibili con altri tipi di analisi già sviluppati da altri ricercatori.

Lavoro molto accurato nel campo che dimostra come sia possibile eseguire l'amplificazione PCR su un chip. È possibile effettuare la reazione di trascrittasi inversa su un chip se si lavora con un virus a RNA o se si desidera condurre un esperimento di espressione genica. Le nostre tecniche di preparazione del campione possono essere direttamente accoppiate alla PCR su chip, pertanto non sarebbe necessario eseguire alcuna purificazione o preparazione del campione in laboratorio.

E, inoltre, anche il passaggio di concentrazione che sarebbe necessario eseguire per ottenere i piccoli volumi richiesti per effettuare una PCR multiplex su un chip di piccole dimensioni. Gli esperimenti che vi mostreremo oggi illustrano come assembliamo il chip microfluidico, realizzato in materiale termoplastico e non in PDMS. Pertanto, il processo di fabbricazione richiede alcune differenze rispetto a quello comunemente utilizzato, nonché il metodo di sigillatura di questi chip.

E poi come eseguiamo la chimica avviata dalla luce all'interno del chip per produrre i monoliti polimerici utilizzati sia per la lisi cellulare che per l'estrazione in fase solida. E al termine di tale processo, che attualmente in laboratorio consiste in procedure modulari, ma che possono essere integrate – e sono state già integrate – si ottiene un campione altamente concentrato di acidi nucleici, RNA e DNA in acqua, che può successivamente essere inviato a un modulo PCR o a un altro modulo di amplificazione, dove può avvenire l'identificazione di un microrganismo o di un'infezione. Attualmente stiamo lavorando a un progetto finanziato in cui abbiamo iniziato a raccogliere campioni umani presso il Boston Medical Center da pazienti che potrebbero essere infettati o meno dal virus dell'influenza A. Poiché è stagione influenzale, questi sono i campioni che stiamo raccogliendo.

E poi, in laboratorio, eseguiamo i saggi considerati standard di riferimento per determinare se una persona è infetta dal virus dell'influenza A, che fondamentalmente consiste in un saggio di coltura, il quale richiede diversi giorni per essere completato. Parallelamente a questo, sottoponiamo questi campioni ai moduli del nostro chip, al momento disponibili. Quindi li sottoponiamo alla colonna di lisi, li facciamo passare attraverso la colonna di estrazione in fase solida e infine eseguiamo la PCR per valutare la nostra resa in confronto ai metodi standard di riferimento.

Questo è dunque il punto a cui siamo arrivati al momento. Se questi esperimenti daranno esito positivo, credo che nei prossimi, diciamo, quattro o sei anni potremmo trovarci nella situazione di avere un chip integrato e un saggio completo per l'influenza A, e inoltre stiamo lavorando anche sul clostridium difficile e sui campioni di feci. E siamo, siamo, siamo anche molto vicini al traguardo di avere non solo il dispositivo integrato, ma anche il saggio completamente integrato.

Pertanto, lo sviluppo del saggio e la progettazione del chip devono procedere di pari passo. Per una specifica applicazione rivolta all'uso al letto del paziente, si tratta effettivamente di un processo orientato al bersaglio. È necessario conoscere il campione di partenza e il microrganismo che si intende rilevare, al fine di ottimizzare il chip per un utilizzo al letto del paziente.

Quindi, non credo che siamo così lontani dal realizzarlo in maniera prototipale. Questi sono i nostri obiettivi finali, quindi spero che ci riusciremo.