Le domande Microfluidic per la diagnostica e getta

Mi chiamo Catherine CloudBridge e sono professoressa di produzione, ingegneria e ingegneria biomedica presso la Boston University. E sono il direttore del Laboratorio di Microdispositivi Biomedici e Microambienti. Lavoriamo principalmente alla realizzazione di strumenti diagnostici monouso per applicazioni in contesti con risorse limitate.

Quindi usiamo la microfluidica per realizzare questi dispositivi. Siamo interessati in realtà a due campi di studio. Principalmente siamo interessati a osservare come le biomolecole e le cellule interagiscono con le superfici dei polimeri plastici.

Questo è il nostro ombrello principale. Questo lavoro è incarnato nelle applicazioni microfluidiche per la diagnostica monouso. Quindi, in laboratorio, ciò che realizziamo sono dispositivi microfluidici.

Nei materiali termoplastici che non utilizziamo, in genere utilizziamo PDMS, che è il materiale gommoso che la maggior parte delle persone utilizza per realizzare la microfluidica in laboratorio. Realizziamo i nostri dispositivi in materiale termoplastico. Siamo interessati a utilizzare questi dispositivi termoplastici per fare biologia molecolare su microscala in modo tale che la biologia molecolare possa essere fatta sul campo, lontano da un laboratorio centralizzato.

In laboratorio stiamo realizzando piccole schede di plastica e all'interno di queste piccole schede di plastica ci sono colonne di estrazione in fase solida o colonne di lisi cellulare o colonne di miscelazione. Eseguiamo anche la reazione a catena della polimerasi sul chip come tecnica di rilevamento. Tutte queste cose sono integrate in un piccolo dispositivo che alla fine, nella prospettiva a lungo termine della ricerca, finirebbe per essere un dispositivo integrato che sarebbe in grado di essere portatile e portato sul campo o in ambienti in cui un laboratorio su larga scala con tutti i centri di fusione, e gli incubatori di riscaldamento e così via, non sarebbe disponibile.

Quindi vorremmo essere in grado di iniziare idealmente con un campione umano come sangue, urina, feci o un tampone nasofaringeo, per esempio, che sarebbe muco. E poi, all'uscita del chip, avere una risposta, che si o no, qualcuno è stato infettato da un particolare microrganismo. E il modo in cui lo facciamo è cercando il DNA di quel particolare o RNA, a seconda del microrganismo di quel particolare microrganismo nel campione del paziente.

Quindi le sfide tecniche che arrivano sono in gran parte nel lato della preparazione dei campioni di quell'equazione. Quindi, quando si inizia con il sangue, le feci o le urine, si deve passare da una situazione in cui si ha un campione umano disordinato con molto particolato potenzialmente contenuto o inibitori alla PCR o ad altre tecniche di amplificazione. E si vuole finire con un campione di acidi nucleici molto pulito e eluso che si può poi utilizzare per amplificare o cercare un particolare DNA o RNA che vi dirà se un microrganismo che state cercando era lì.

Quindi, per ripulire quei campioni, devi fare alcune cose. Innanzitutto, è necessario filtrare il campione che, a seconda del campione, può comportare una filtrazione del corso o una rapida fase di centrifuga prima che il campione vada sul chip. Quindi cerchiamo sempre di iniziare con i campioni man mano che provengono dal medico.

Quindi, con le urine, le feci e i tamponi nasofaringei, il nostro obiettivo è quello di far sì che il medico svolga il proprio lavoro come farebbe normalmente e prelevi il campione come farebbe normalmente. E poi prendiamo quel campione e lo mettiamo sui chip. Quindi, se è necessario eseguire un'ulteriore filtrazione in quella fase, tale filtrazione avverrà nel chip.

Il secondo passo prevede, poiché stiamo facendo saggi molecolari, di lisare le cellule e i microrganismi che si trovano in quel campione. Quindi eseguiamo una fase di lisi, che di solito comporta la forzatura del campione attraverso un filtro che ha una piccola dimensione dei pori. A volte quel filtro contiene anche nanoparticelle come i nanotubi di carbonio, che hanno bordi taglienti, che possono essere usati per fare a pezzi alcuni degli organismi che hanno pareti cellulari più robuste come il C difficile, che è un batterio gram-positivo con cui lavoriamo, che è molto difficile da misticare.

Quindi dobbiamo avere colonne di lisi più robuste. Ma in genere eseguiamo una lisi chimica e meccanica combinata all'interno del chip. Dopodiché, il nostro obiettivo è quello di prelevare il lisato e poi estrarre gli acidi nucleici purificati.

Quindi passiamo la lisi, passiamo il lisato su una colonna di estrazione in fase solida che è risonante nel chip microfluidico. E quella colonna di estrazione in fase solida è fatta di plastica ed è realizzata utilizzando la chimica avviata dalla fotografia all'interno del canale microfluidico dopo che è già stata fabbricata. Ed è anche impregnato di particelle di silice perché vogliamo legarsi e rilasciare gli acidi nucleici.

In alcuni casi, abbiamo incorporato perline oligo DT se vogliamo legare e rilasciare mRNA in modo specifico, ad esempio, o perline che hanno particolari anticorpi, se vogliamo legare e rilasciare particolari proteine. E possiamo creare colonne di estrazione che fanno tutte queste cose. Ma oggi vi mostreremo come fare la colonna di estrazione della sase con le perle di silice.

Quindi, dopo averlo fatto, passare il lisato sulla colonna di silice, funziona proprio come un kit kyogen funzionerebbe in un laboratorio su larga scala. Poi ci laviamo per sbarazzarci di tutte le altre cose che non vogliamo, tutti i carboidrati e i lipidi e altre cose nel lisato cellulare e nel resto del campione umano che non vogliamo. E poi, proprio alla fine, stiamo alludendo all'acqua.

E la cosa bella di queste colonne di estrazione in fase solida su microscala è che possiamo eluire con una quantità molto piccola di acqua, di solito nell'ordine di uno o cinque microlitri. E stiamo recuperando quasi tutti gli acidi nucleici che abbiamo inserito. Abbiamo un tasso di efficienza compreso tra il 70 e il 90% e i primi 10 microlitri che otteniamo da quel canale.

Quindi, se ci laviamo due volte con due o 10 microlitri, recuperiamo quasi tutti gli acidi nucleici che abbiamo messo lì. Quindi non si tratta solo di un campione pulito in grado di eseguire la PCR, ma anche di un campione molto più concentrato di quello che si potrebbe ottenere con un kit da banco standard. Quindi l'obiettivo finale di tutte queste tecniche di preparazione dei campioni è quello di creare cose che siano compatibili con alcuni degli altri lavori che le persone hanno svolto.

Ottimo lavoro sul campo che dimostra che è possibile eseguire l'amplificazione PCR su un chip. È possibile eseguire la reazione di trascrittasi inversa su un chip se si ha a che fare con un virus a RNA o se si desidera eseguire un esperimento di espressione genica. Le nostre tecniche di preparazione dei campioni possono essere accoppiate direttamente con la PCR su chip, in modo da non dover eseguire alcuna pulizia e preparazione dei campioni al banco.

E, e, e anche la fase di concentrazione che si dovrebbe fare per ottenere i piccoli volumi necessari per eseguire la PCR multiplexata su un piccolo chip. Quindi gli esperimenti che vi mostreremo oggi mostrano come assembliamo il chip microfluidico, che è fatto di materiale termoplastico e non di PDMS. Quindi richiede un processo di fabbricazione un po' diverso da quello tipicamente utilizzato, il modo in cui questi chip vengono sigillati.

E poi come facciamo la chimica avviata dalla luce all'interno del chip per creare i monoliti polimerici che vengono utilizzati sia per la lisi cellulare che per l'estrazione in fase solida. E alla fine di questo processo, che in questo momento sono processi modulari in laboratorio, ma possono essere e sono stati integrati, si ottiene alla fine un campione altamente concentrato di acidi nucleici, RNA e DNA in acqua, che può poi andare a valle verso un modulo PCR o un altro modulo di amplificazione dove può avvenire l'identificazione di un microrganismo o di un'infezione. Quindi in realtà abbiamo una sovvenzione su cui stiamo lavorando in questo momento, dove stiamo iniziando a raccogliere campioni umani dal Boston Medical Center da pazienti che possono o non possono essere infettati dall'influenza A.So dato che è la stagione influenzale, questi sono i campioni che stiamo raccogliendo.

E poi in laboratorio, stiamo facendo i test gold standard per verificare se qualcuno è infetto o meno dall'influenza A, che è fondamentalmente un test colturale, che richiede diversi giorni per essere eseguito. E accanto a questo, stiamo mettendo questi campioni attraverso i nostri, in questo momento, i moduli del nostro chip. Quindi li mettiamo attraverso la colonna di lisi, li mettiamo attraverso la colonna di estrazione in fase solida e poi eseguiamo la PCR per vedere quanto bene facciamo rispetto ai metodi gold standard.

Quindi questa è la fase in cui ci troviamo in questo momento. Se questi esperimenti andranno a buon fine, penso che nei prossimi quattro o sei anni forse ci troveremo in una situazione in cui avremo un chip integrato e un test completo per l'influenza A e stiamo anche lavorando su campioni di clostridium difficile e feci. E siamo, siamo, siamo anche molto vicini ad avere non solo il dispositivo integrato, ma anche il test integrato.

Pertanto, sia lo sviluppo del test che la progettazione del chip devono avvenire di pari passo. Quindi, per una particolare applicazione, arrivare al letto del paziente, è davvero un processo orientato al target. Devi conoscere, sai, il campione con cui stai iniziando e il microrganismo che stai cercando per ottimizzare il chip per un uso al letto del paziente.

Quindi, non credo che siamo così lontani dal farlo accadere in modo prototipale. Questi sono i nostri obiettivi finali, quindi spero che ci arriveremo.