Chip Fabrication Microfluidic e metodo per rilevare l'influenza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare il virus dell'influenza A utilizzando un chip microfluidico. Innanzitutto, eseguire il campione con il tampone di lisi attraverso il canale SPE per licare il virus ed estrarre l'RNA, caricare il reagente R-T-P-C-R con l'RNA estratto ed eseguire il canale di trascrizione inversa per convertire l'RNA virale in CDNA. Successivamente, eseguire la miscela nel canale PCR per amplificare i risultati del DNA ottenuti che mostrano le dimensioni e la concentrazione dell'amplicone in base al segnale di fluorescenza dell'elettroforesi capillare.

Il vantaggio principale di questa tecnologia è che accetta il campione grezzo del paziente e integra l'estrazione dell'acido nucleico, la purificazione, la trascrizione inversa e l'amplificazione in un unico chip Per creare due placche, distribuire uniformemente circa nove grammi di pellet XN X al centro di una piastra metallica, posizionarla su una pressa riscaldata a 198 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi applicare lentamente la pressione a 2.500 PSI per altri cinque minuti. Ora, posiziona una placca sullo stampo epossidico preriscalda a 157 gradi Celsius per 10 minuti e applica lentamente una pressione a 1000 PSI per altri 10 minuti.

Successivamente, indossando guanti termici, rimuovere la placca e lo stampo dalla pressa a caldo, quindi rimuovere la placca dallo stampo prima che si raffreddi. Praticare tre fori nel chip goffrato, uno all'ingresso, uno all'apertura di scarico e uno all'uscita del canale microfluidico. Quindi lavare le patatine con l'alcool isopropilico seguito dagli RNA e dall'acqua di Dianna.

Asciugare le patatine con aria per legare le patatine, prima preriscaldare a 131 gradi Celsius per 10 minuti, quindi premere a 350 PSI per altri 10 minuti. Utilizzando JB Weld Epoxy, collegare le nano porte ai rifiuti di ingresso e le porte di uscita polimerizzano separatamente per 15-24 ore. Secondo le istruzioni del produttore, sciacquare il canale SPE con 50 microlitri di RNA seguito da 100 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Ora caricare il canale SPE con quattro microlitri di soluzione di innesto appena preparata per reticolare il metacrilato incubare per 10 minuti in un forno UV, rimuovere la soluzione di innesto residua con un vuoto. Rompere il pellet di microsfere essiccato picchiettando sul tubo con il coperchio chiuso. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di colonna SPE preparata fresca e vortice per mescolare.

Caricare quattro microlitri della soluzione SPE nello stesso canale reticolato mediante irradiazione UV per 2,5 minuti su ciascun lato, ottenendo una colonna SPE polimerizzata bianca opaca. Lavare il canale con 500 microlitri di metanolo al 100% per sciacquare via i reagenti in eccesso e i solventi pirogeni intrapolimerici. Fissare due riscaldatori a film sottile alla parte inferiore del chip con nastro termoconduttivo.

Si noti che i lati dei riscaldatori devono essere allineati con il bordo dei canali larghi per la durata di Dene e un inginocchiamento separato, posizionare cinque termocoppie nel chip attraverso i canali laterali aperti senza uscita di ciascun nastro del chip. Per fissare la posizione delle termocoppie, aggiungere quattro microlitri di 25 XRNA secure a 96 microlitri di etanolo al 70% in un tubo e al 100% di etanolo in un secondo tubo. Inoltre, preparare 300 microlitri di tampone canale e 316 microlitri di tampone di lisi.

Riscaldare le soluzioni a 60 gradi Celsius per 15 minuti. Per attivare l'RNA sicuro, quindi per equilibrare il canale microfluidico. Far scorrere il buffer del canale attraverso il canale SPE a una velocità di flusso di 0,8 millilitri all'ora.

Ora campione di prova rapida delle fave in VTM a 37 gradi Celsius. Rimuovere il campione non appena viene scongelato. Centrifugare il campione a 13.000 giri/min per 10 minuti.

Trasferire 100 microlitri di surnatante in 300 microlitri di tampone di lisi e aggiungere sei microlitri di un microgrammo per microlitro di vettore, vortice di RNA da mescolare. Quindi centrifuga per cinque secondi e carica l'intero lisato in una siringa CC con blocco esca. Far scorrere il lisato attraverso il canale SPE a una velocità di flusso di 0,8 millilitri all'ora.

Quindi lavare il canale SPE con 100 microlitri di etanolo al 70%, seguiti da 100 microlitri di etanolo al 100% a un millilitro all'ora. Posizionare una siringa vuota alla tacca di 0,5 millilitri e spingere l'aria attraverso il canale per asciugarla a un millilitro all'ora. Ora fai scorrere 67,5 microlitri di acqua priva di nucleasi attraverso il canale per eluire gli acidi nucleici legati a 0,5 millilitri all'ora e raccogliere 13,5 microlitri dalla nano porta alla porta di scarico.

Carica 36,5 microlitri del master R-T-P-C-R. Mescolare nella nano porta alla porta di scarico e mescolare con l'RNA stampo per una reazione R-T-P-C-R da 50 microlitri. Quindi caricare la miscela R-T-P-C-R nel canale RT con un leggero aspirapolvere.

Sigillare la porta nano con un raccordo chiuso. Applicare 35 volt a quello del riscaldatore. Mantenere i reagenti nel canale RT per 30 minuti dopo che il riscaldatore si è stabilizzato a 50 gradi Celsius.

Mantenere i reagenti nel canale RT per 15 minuti dopo che il riscaldatore uno si è stabilizzato a 95 gradi Celsius. Quindi, applicare 27 volt al riscaldatore uno e 50 volt al riscaldatore, due per equilibrare il riscaldatore, uno a 60 gradi Celsius e il riscaldatore due a 95 gradi Celsius. Spingere i reagenti nel canale PCR a 0,5 microlitri al minuto.

Circa 20 minuti dopo, quando i reagenti si sono avvicinati all'estremità del canale a serpentina, raccogliere i prodotti PCR all'uscita utilizzando un pipettatore e una punta di dimensioni adeguate per il test del DNA ad alta sensibilità Agilent. Rimuovere il kit DNA ad alta sensibilità Agilent dal frigorifero 30 minuti prima del test. Accendi il bioanalizzatore e apri il software esperto 2.100.

Caricare un microlitro di prodotti PCR per il test e seguire il protocollo Agilent. Analizzare e registrare i dati in questo flusso di lavoro. Il campione nasale faringeo del paziente viene miscelato con il tampone di lisi e applicato al chip.

Il chip viene eseguito e i prodotti PCR del virus dell'influenza vengono utilizzati utilizzando un chip di elettroforesi capillare commerciale. A causa delle diverse quantità di virus dell'influenza nel campione di ciascun paziente, la concentrazione finale del prodotto PCR varierà. Un buon risultato dovrebbe avere un basso rumore per eliminare i picchi della scala a 35 e 10, 380 coppie di basi e un singolo picco del prodotto alla dimensione del prodotto progettata di 107 coppie di basi per il campione positivo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare ed eseguire il chip del micro fluido per rilevare il virus dell'influenza A.