Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari

Questa tecnica può essere utilizzata per generare sferoidi cellulari da singoli e più tipi di cellule utilizzando una piattaforma lab-on-a-CD, un sistema pionieristico per la rapida generazione di sferoidi. La tecnica utilizza la forza centrifuga per depositare le cellule in microliqui designati, permettendo l'euforia sequenziale di più tipi di cellule per la produzione di sferoidi diversi. Per la fabbricazione di chip di coltura CMS, realizzare prima stampi in policarbonato per gli strati superiore e inferiore del chip di coltura mediante lavorazione a controllo numerico computerizzato.

Quindi mescolare la base PDMS e l'agente di polimerizzazione PDMS a un rapporto 10 a uno per cinque minuti prima di posizionare la miscela in un essiccatore per un'ora per rimuovere le bolle d'aria. Versare la miscela PDMS degassata negli stampi del chip di coltura CMS e posizionare gli stampi nell'essiccatore per un'altra ora per rimuovere eventuali bolle d'aria. Alla fine del secondo degassamento, polimerizzarla in una camera termica a 80 gradi Celsius per due ore prima di posizionare i trucioli in un aspirapolvere con le superfici da legare rivolte verso l'alto.

Esporre i trucioli di coltura al plasma assistito dall'aria con una potenza di 18 watt per 30 secondi e legare i due strati del chip nella camera di calore a 80 gradi Celsius per 30 minuti per aumentare la forza di adesione. Quindi sterilizzare il chip di coltura CMS in un'autoclave a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Per preparare le cellule per la formazione di sferoidi, scongelare un flaconcino da un millilitro contenente da cinque a 10 volte 10 alle cinque cellule di interesse in un bagno d'acqua di 36,5 gradi Celsius per due minuti prima di aggiungere un millilitro di DMEM alle cellule con miscelazione delicata.

Aggiungere quindi le celle a una piastra di Petri di 150 millimetri di diametro contenente 15 millilitri di mezzo di 36,5 gradi Celsius e posizionare il piatto in un incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Il giorno dopo, sostituire il supernatante con 15 millilitri di DMEM fresco e riportare le cellule nell'incubatrice. Per staccare le cellule, creare la coltura con quattro millilitri di tripsiderina per quattro minuti a 36,5 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, fermando la reazione con mezzo fresco quando le cellule si sono alzate dal fondo del piatto.

Per etichettare le cellule, riscaldare un colorante a fluorescenza cellulare appropriato a temperatura ambiente prima di aggiungere 20 microlitri di solfossido di dimetile anidro al flaconcino per ottenere una soluzione millimolare. Diluire la fluorescenza ad una concentrazione di lavoro finale di un micromolare in DMEM e aggiungere il colorante alla sospensione cellulare di interesse con miscelazione delicata. Quindi posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 20 minuti.

Per la formazione di sferoidi monocoltura, aggiungere prima 2,5 millilitri di soluzione F-127 pluronica al foro di ingresso del chip di coltura CMS ruotando il chip a 500-1.000 rotazioni al minuto. Una volta aggiunta tutta la soluzione, ruotare il chip a 4.000 rotazioni al minuto per tre minuti utilizzando il sistema CMS. Al termine della rotazione, incubare il chip di coltura durante la notte a 36,5 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica.

La mattina seguente, rimuovere la soluzione Pluronic e lavare il chip di coltura con DMEM. Dopo aver asciugato il truciolo per 12 ore su una panca pulita, aggiungere 2,5 millilitri del mezzo alla porta di ingresso e ruotare il truciolo a 4.000 rotazioni al minuto per tre minuti. Al termine della rotazione, sostituire 100 microlitri del mezzo nella porta di ingresso con 100 microlitri della sospensione cellulare preparata mentre il chip ruota a 500 a 1.000 rotazioni al minuto.

Quindi ruotare il chip a 3.000 rotazioni al minuto per tre minuti per intrappolare le cellule in ogni microwell per forza centrifuga prima di posizionare il chip nell'incubatore di coltura cellulare per tre giorni, rinfrescando il mezzo come dimostrato ogni giorno. Per la generazione di cocultura sferoide concentrica, aggiungere la prima popolazione di cellule in 100 microlitri di mezzo alla porta di ingresso del chip mentre il chip ruota a 500-1.000 rotazioni al minuto seguite da tre minuti di rotazione a 3.000 rotazioni al minuto. Alla fine della rotazione, aggiungere 100 microlitri della seconda popolazione cellulare mentre il chip ruota a 500 a 1.000 rotazioni al minuto e ruotare il chip a 3.000 rotazioni al minuto per altri tre minuti.

Quando entrambi i volumi di cellule sono stati iniettati, posizionare il chip nell'incubatore di coltura cellulare a 1.000-2.000 rotazioni al minuto per 24 ore. Per la formazione di sferoidi Janus, aggiungere 100 microlitri della prima popolazione di cellule mentre il chip ruota a 500 a 1.000 rotazioni al minuto seguite da tre minuti a 3.000 rotazioni al minuto. Al termine della rotazione, posizionare il chip nell'incubatore di coltura cellulare per la rotazione a 1.000-2.000 rotazioni al minuto per tre ore.

Alla fine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri della seconda popolazione di cellule mentre il chip ruota da 500 a 1.000 rotazioni al minuto prima di ruotare il chip a 3.000 rotazioni al minuto per tre minuti. Quindi posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare a 1.000-2.000 rotazioni al minuto per 24 ore. Per la formazione di sferoidi sandwich, aggiungere prima 100 microlitri della prima popolazione cellulare mentre il chip ruota a 500 a 1.000 rotazioni al minuto seguito da tre minuti di rotazione a 3.000 rotazioni al minuto.

Alla fine della rotazione, posizionare il chip su un rotatore nell'incubatore di coltura cellulare per due ore a 1.000-2.000 rotazioni al minuto prima di aggiungere 100 microlitri della seconda popolazione di cellule mentre il chip ruota a 500-1.000 rotazioni al minuto. Ruotare il chip a 3.000 giri/min per tre minuti e riposizionare il chip nell'incubatore per un'incubazione di tre ore con rotazione. Quindi aggiungere altri 100 microlitri della prima popolazione cellulare mentre il chip ruota da 500 a 1.000 rotazioni al minuto e ruotare e colturare le cellule come appena dimostrato per 12 ore.

Seguendo il protocollo come dimostrato, è possibile fabbricare con successo un chip di coltura CMS di sei centimetri di diametro. Il canale del chip di coltura CMS comprende una porta di ingresso e regioni centrali, scorrevoli e microwell. Le immagini time-lapse di due tipi di coltura cellulare scattate a 2.000 rotazioni al minuto per le prime 24 ore di coltura all'interno dei singoli chip CMS, come dimostrato, mostrano la formazione riuscita di sferoidi.

L'imaging dei microlidi dopo tre giorni di coltura mostra che gli sferoidi dimostrano un'eccellente uniformità e sfericità. Possono anche essere generati sferoidi cocolturati con strutture conentriche, janus e sandwich. Inoltre, le colture cellulari esposte all'alta gravità per sette giorni, seguite dalla colorazione viva / morta, dimostrano che la maggior parte delle cellule sopravvive alla coltura a lungo termine all'interno dei chip.

Gli strati superiore e inferiore del chip di coltura CMS devono essere accuratamente allineati quando sono legati, altrimenti il numero di celle in ogni microwell potrebbe non essere uguale. Questo studio può abbassare la barriera all'ingresso per la ricerca sugli sferoidi della cocoltura e può essere ampiamente utilizzato negli studi di cocultura, ad esempio, per lo screening di nuovi farmaci di interesse.