Tecniche di patch-clamp per l'analisi di singole vescicole endolisosomiali

I compartimenti endolisosomiali sono gli organelli più piccoli delle cellule. Le tecniche elettrofisiologiche tradizionali non sono in grado di misurare direttamente le variazioni di tensione e corrente. La tecnica del patch-clamp dell'endolisosoma consente registrazioni dirette, permettendoci di studiare precedentemente nei canali ionici.

La principale sfida sperimentale è che non tutti i composti ingrandiscono efficacemente i lisosomi. L'identificazione delle cellule adatte è difficile e, anche con i lisosomi ideali, il successo della registrazione dei canali ionici non è garantito. Abbiamo sviluppato la tecnica del patch clamp endolisosomiale per consentire registrazioni elettrofisiologiche dirette dalle membrane endolisosomiali.

Questa scoperta ci ha permesso di caratterizzare i canali ionici, come i TRPML e i TPC, rivelando il loro ruolo nella difesa dei patogeni, nella degenerazione neuronale e nei disturbi metabolici. Il nostro metodo consente la registrazione diretta dei canali ionici lisosomiali, superando i limiti delle dimensioni del patch-clamp a cellula intera e migliorando la selezione delle vescicole, integrando tecniche basate sulla fluorescenza. Per iniziare, installare il tubo capillare nella polare.

Premere il pulsante verde sulla tastiera. Allentare la manopola di serraggio e rimuovere le pipette estratte dalla polare. Quindi, posizionare le pipette con cerotto estratto nel supporto Microforge.

Ispezionare i puntali delle pipette utilizzando una lente dell'obiettivo 35x, combinata con un oculare 15x per un ingrandimento totale di 525x. Utilizzare il micromanipolatore per avvicinare le pipette patch al filamento. Impostare la manopola della temperatura su 80.

Una volta acceso il riscaldatore, tenere premuto l'interruttore a pedale per uno o due secondi per applicare un breve impulso di calore. Dopo la lucidatura, posizionare le pipette lucidate in una scatola sigillata per evitare la contaminazione da polvere. Aggiungere un millilitro di soluzione per il bagno alla camera.

Rimuovere un vetrino di copertura con celle HEK 293 trattate dalla piastra a 24 pozzetti. Trasferire il vetrino coprioggetto nella camera del microscopio. Utilizzare un ago di riempimento in plastica fatto in casa per riempire la pipetta di isolamento con la soluzione per pipette.

Installare la pipetta riempita all'estremità anteriore della configurazione del patch-clamp. Al microscopio con obiettivo 40x e oculare 10x, avvicinare la pipetta di isolamento a endosomi o lisosomi sufficientemente ingranditi. Abbassare la pipetta di isolamento utilizzando il micromanipolatore fino a toccare il bordo della membrana plasmatica.

Spostare rapidamente la pipetta per strappare un piccolo pezzo della membrana. Utilizzando la stessa pipetta, premere la cellula dal lato opposto per spremere gli endosomi/lisosomi a circa due micrometri dalla cellula. Riempire una pipetta patch appena lucidata con la soluzione appropriata.

Installare la pipetta all'estremità anteriore dell'amplificatore. Applicare una pressione positiva da 20 a 50 millibar alla pipetta e mantenerla bloccando la valvola. Quindi, spostare la punta della pipetta nella soluzione del bagno e posizionarla al centro del campo visivo.

Applicare impulsi di corrente ripetuti per determinare la resistenza della pipetta, la resistenza della tenuta e la resistenza in serie. Monitorare le dimensioni del puntale della pipetta, la formazione della tenuta e l'instaurazione dell'intera configurazione endolisosomiale. Spostare rapidamente la pipetta vicino alla parte superiore della vescicola target.

Osservare la vescicola che si muove o rotola a causa del flusso di fluido dalla pipetta. Regolare la tensione di offset della pipetta a zero millivolt. Rilasciare immediatamente la pressione positiva per attirare la vescicola verso la pipetta, formando un gigaseal entro un secondo.

Per la registrazione dell'intera vescicola, utilizzare un breve impulso ad alta tensione da due a cinque millisecondi per interrompere la membrana nel punto di contatto tra la pipetta e l'organello. Impostare la tensione da 500 a 1000 millivolt. Per registrare la corrente, condurre esperimenti di morsetto di tensione endolisosomiale utilizzando un'ampia gamma di tensioni di ingresso per valutare le proprietà della membrana.

Durante la formazione dei gigasauri, la risposta di corrente è diminuita rapidamente, indicando il successo dell'instaurazione della modalità di adesione al lisosoma. Applicazione ripetuta di correnti registrate con tensione di ingresso continua attraverso la membrana endolisosomiale, che mostrano correnti basali, attivate da agonisti e di dispersione.