Name: Tecniche di patch-clamp per lanalisi di singole vescicole endolisosomiali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Impara la tecnica di patch-clamp endolisosomiale per registrare direttamente l'attività dei canali ionici su vescicole intracellulari. Questo metodo supera i limiti dell'elettrofisiologia tradizionale e permette di studiare i canali ionici precedentemente inaccessibili.

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<ol><li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+degrade+or+not+to+degrade%3A+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Kumar, P., Kumar, D., Jha, S. K., Jha, N. K., Ambasta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Ion channels in neurological disorders.</a> Adv Protein Chem Struct Biol. 103, 97-136 (2016).</li>
<li>Brailoiu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancestral+deuterostome+family+of+two-pore+channels+mediates+nicotinic+acid+adenine+dinucleotide+phosphate-dependent+calcium+release+from+acidic+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An ancestral deuterostome family of two-pore channels mediates nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate-dependent calcium release from acidic organelles.</a> J Biol Chem. 285 (5), 2897-2901 (2010).</li>
<li>Pitt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPC2+is+a+novel+NAADP-sensitive+Ca2%2B+release+channel%2C+operating+as+a+dual+sensor+of+luminal+pH+and+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TPC2 is a novel NAADP-sensitive Ca2+ release channel, operating as a dual sensor of luminal pH and Ca2+.</a> J Biol Chem. 285 (45), 35039-35046 (2010).</li>
<li>Gerndt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-mediated+switching+of+ion+selectivity+in+TPC2+differentially+promotes+lysosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Agonist-mediated switching of ion selectivity in TPC2 differentially promotes lysosomal function.</a> Elife. 9, e54712(2020).</li>
<li>She, J., Guo, J., Jiang, Y. Structure and function of plant and mammalian TPC channels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShe%2C+J+%22Endolysosomal+voltage-dependent+cation+channels%22">Endolysosomal voltage-dependent cation channels</a>. Wahl-Schott, C., Biel, M. , Springer. Cham. 155-180 (2023).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-risk+protein+TMEM175+is+a+proton-activated+proton+channel+in+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-risk protein TMEM175 is a proton-activated proton channel in lysosomes.</a> Cell. 185 (13), 2292-2308.e20 (2022).</li>
<li>Grimm, C., Bartel, K., Vollmar, A. M., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolysosomal+cation+channels+and+cancer%3A+A+link+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Endolysosomal cation channels and cancer: A link with great potential.</a> Pharmaceuticals (Basel). 11 (1), 4(2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ion+and+molecule+transport+in+lysosomes%22">Ion and molecule transport in lysosomes</a>. Gasnier, B., Zhu, M. X. , 1st ed, CRC Press. (2020).</li>
<li>Hernández-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+clamp+methods+for+the+study+of+membrane+currents+and+SR+Ca2%2B+release+in+adult+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca2+ release in adult skeletal muscle fibres.</a> Prog Biophys Mol Biol. 108 (3), 98-118 (2012).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+technique+to+characterize+ion+channels+in+enlarged+individual+endolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp technique to characterize ion channels in enlarged individual endolysosomes.</a> Nat Protoc. 12 (8), 1639-1658 (2017).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+for+early+endosome-specific+patch+clamping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecules for early endosome-specific patch clamping.</a> Cell Chem Biol. 24 (7), 907-916.e4 (2017).</li>
<li>Cang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulates+lysosomal+ATP-sensitive+two-pore+Na%2B+channels+to+adapt+to+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR regulates lysosomal ATP-sensitive two-pore Na+ channels to adapt to metabolic state.</a> Cell. 152 (4), 778-790 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>SUTTER INSTRUMENT IN VETRO BOROSILICATO</td><td></td><td>BF150-75-10</td><td>O.D.: 1,5 mm, D.I. 0,75 mm 10 cm di lunghezza, con filamento</td></tr><tr><td>Digidata 1140A</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito IX73</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MODEL P-97 estrattore per micropipette</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPC-200</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POLISHER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Warner Instruments</td><td>641943</td><td>QR-40LP, per vetrini coprioggetti da 25 mm</td></tr></tbody></table>

tecniche di patch-clamp per l'analisi di singole vescicole endolisosomiali

Patch-Clamp Techniques for Single Endolysosomal Vesicle Analysis

Di seguito vengono descritte le forme attuali osservate durante gli esperimenti di patch-clamp endolisosomiale. Se la forma attuale non è quella prevista, potrebbe essere dovuto a uno scarso contatto o a una perdita. Se l'elettrodo di riferimento non è completamente a contatto con la soluzione del bagno o se l'elettrodo della pipetta sta per rompersi, può verificarsi uno scarso contatto. Le perdite possono verificarsi se c'è uno spazio tra la camera e il vetrino coprioggetti che consente al fluido di fluire sulla lente d...

Tecniche di patch-clamp per l'analisi di singole vescicole endolisosomiali

Endolysosomal ion channels are critical for endolysosomal ion and pH homeostasis, membrane potential regulation, and vesicle trafficking. However, ...

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Biologia

Un metodo per isolare vescicole submitocondriali arricchiti in F1FO ATP sintasi complessi da cervello di ratto è descritto. Queste vescicole permettono lo studio dell'attività del complesso F1FO ATPasi e la sua modulazione utilizzando la tecnica di patch clamp di.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPasi Vesicle Preparazione e tecnica per permettere Bloccare Registrazioni patch di membrane delle vescicole submitocondriali

Ricostituzione di proteine ​​di membrana funzionale in liposomi giganti di composizione definita è un approccio efficace quando combinato con elettrofisiologia patch-clamp. Tuttavia, la produzione convenzionale di liposomi gigante può essere incompatibile con la stabilità della proteina. Descriviamo i protocolli per la produzione di liposomi giganti di lipidi puri o piccoli liposomi contenenti canali ionici.

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

La ricostituzione della proteina transmembrana, KvAP, in giganti vescicole unilamellari (GUVs) è dimostrato per due metodi di disidratazione, reidratazione - electroformation, e gonfiore gel assistita. In entrambi i metodi, piccole vescicole unilamellari contenenti la proteina sono fusi insieme per formare GUVs che possono poi essere studiate mediante microscopia a fluorescenza e patch-clamp elettrofisiologia.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

I proteoliposomi vengono utilizzati per studiare canali purificati e trasportatori ricostituiti in un ambiente biochimico ben definito. Viene illustrata una procedura sperimentale per misurare l'efflusso mediato da queste proteine. Vengono descritti i passaggi per preparare i proteoliposomi, eseguire le registrazioni e analizzare i dati per determinare quantitativamente le proprietà funzionali della proteina ricostituita.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canali e trasportatori

La quantificazione accurata degli eventi di traffico vescicolare spesso fornisce informazioni chiave sui ruoli di specifiche proteine e sugli effetti delle mutazioni. Questo articolo presenta metodi per l'utilizzo della pHluorina supereclittica, una variante della GFP sensibile al pH, come strumento per la quantificazione degli eventi endocitici nelle cellule viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e la citometria a flusso.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

Liposomi contenenti anfifili catena singola, particolarmente gli acidi grassi, presentano proprietà distinti rispetto a quelli contenenti diacylphospholipids a causa delle proprietà chimiche uniche di singola catena anfifili. Qui descriviamo le tecniche per la preparazione, la purificazione e uso dei liposomi composto in parte o la totalità di questi anfifili.

Preparazione, purificazione e l'uso dei liposomi contenenti acidi grassi

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione di lipidici utilizzando un metodo di doppio strato di contatto bolla. Una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico, per cui un monostrato è formato all'interfaccia acqua-olio. Due pipette sono manipolati per ancorare le bolle per formare un doppio strato.

Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate

Qui, presentiamo un protocollo per etichettare le vescicole extracellulari derivate dal lisato piastrinico per monitorare la loro migrazione e assorbimento negli espianti di cartilagine utilizzati come modello per l'osteoartrite.

Etichettatura delle vescicole extracellulari per il monitoraggio della migrazione e dell'assorbimento negli espianti di cartilagine

Impara la tecnica di patch-clamp endolisosomiale per registrare direttamente l'attività dei canali ionici su vescicole intracellulari. Questo metodo supera i limiti dell'elettrofisiologia tradizionale e permette di studiare i canali ionici precedentemente inaccessibili.

Tecniche di patch-clamp per l'analisi di singole vescicole endolisosomiali

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