Isolamento e captazione delle cellule dendritiche di piccole vescicole extracellulari da Echinococcus granulosus

La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione delle vescicole extracellulari di Echinococcus granulosus e sul loro ruolo nelle interazioni parassita-ospite. Studiamo l'assorbimento della composizione da parte delle cellule dendritiche dell'ospite e la potenziale influenza sull'immunomodulazione. Abbiamo dimostrato che le EV di E. granulosus vengono assorbite dalle cellule dendritiche, influenzando la maturazione e la presentazione dell'antigene. Identifichiamo anche proteine immunomodulatorie e antigeniche chiave nel carico EV, che possono influenzare le interazioni parassita-ospite e le risposte immunitarie.

Il nostro protocollo ottimizza la coltura di parassiti in vitro per una maggiore produzione di piccole vescicole extracellulari e garantisce un isolamento di alta qualità e integra saggi su cellule dendritiche per studiare l'immunomodulazione. Può essere applicato nel suo insieme o in parti. La nostra ricerca futura esplorerà gli effetti in vivo delle vescicole extracellulari di E. granulosus sulle risposte immunitarie, il loro potenziale come componenti del vaccino e il loro impatto sulle cellule dendritiche, sui microfagi e sui modelli immunitari di queste cellule.

[Narratore] Per iniziare, pulire la superficie ventrale del topo soppresso con malattia idatidea usando alcol al 70%. Aprire chirurgicamente la cavità peritoneale per rimuovere i metacestodi sviluppati utilizzando forbici e pinze. Quindi, trasferire le masse di metacestodi in una capsula di Petri sterile usando una pinza. Rimuovere il tessuto connettivo utilizzando una pinza, se necessario, per rilasciare le cisti dalle masse metacestodiche. Lavare i metacestodi ottenuti con PBS integrato a quattro gradi Celsius. Ora, preparare il terreno di coltura utilizzando tutti i componenti necessari e mescolare delicatamente la soluzione per inversione. Trasferire cinque millilitri del terreno di coltura preparato in ciascuna provetta di Leighton. Aggiungere i parassiti al terreno di coltura e incubare le provette a 37 gradi Celsius per cinque giorni senza cambiare il terreno. Raccogliere il terreno di coltura dei parassiti da ciascuna provetta di Leighton e trasferirlo in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare il terreno raccolto a 300 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Ora, centrifugare il surnatante a 2.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante risultante in una nuova provetta da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta. Centrifugare la provetta a 10.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari più piccoli. Utilizzando una pipetta, trasferire il surnatante in una provetta adatta al rotore dell'ultracentrifuga. Segna un lato del tubo con un pennarello. E posizionare il tubo nel rotore con il lato contrassegnato rivolto verso l'alto. Centrifugare le provette a 100.000 g per un'ora a quattro gradi Celsius. Versare rapidamente il surnatante e lasciare riposare il tubo capovolto per un minuto. Lavare il pellet con almeno tre millilitri di PBS per rimuovere le proteine contaminanti. Risospendere il pellet più volte utilizzando una pipetta lungo tutte le facce del tubo, concentrandosi sul lato contrassegnato in cui si prevede che si trovi il pellet. Dopo aver ripetuto l'ultracentrifugazione, risospendere il pellet in 30 microlitri di PBS. Trasferire il campione risospeso in una provetta da 1,5 millilitri e congelare le vescicole extracellulari a meno 80 gradi Celsius per la conservazione. Spruzzare etanolo la femmina di topo CF-1 di cinque-otto settimane soppressa prima di metterla in una cappa di coltura tissutale. Posizionare il mouse su una tavola da dissezione in posizione supina. Usando una pinza e le forbici da dissezione, praticare un'incisione a T verticale sopra l'uretra ed estenderla orizzontalmente fino alla sommità degli arti inferiori. Usando una pinza, separa la pelle lungo entrambi gli arti posteriori per esporre le ossa e i tessuti delle gambe. Con le mani, rimuovere la pelle di ciascuna gamba dopo aver spinto dalla caviglia verso l'addome, tirando la pelle dal lato opposto, lasciando entrambe le gambe libere dalla pelle. Ora, rimuovi con cura il femore e la tibia usando forbici e pinze, assicurandoti che non si rompano. Fissare la punta di ogni osso con una pinza. E taglia i tendini per rimuovere le fasce muscolari attorno alle ossa. Completare la pulizia del tessuto muscolare con tovaglioli di carta. Posizionare ogni osso rimosso in una provetta sterile da 50 millilitri contenente due millilitri di terreno RPMI completo integrato per rimuovere i detriti. Dopo aver scartato il terreno, lavare le ossa due volte con etanolo al 70% per cinque minuti ogni volta. Trasferisci le ossa lavate in una capsula di Petri sterile e taglia le due epifisi ossee usando forbici da dissezione affilate per accedere alle cellule del midollo osseo. Utilizzando un ago calibro 25 collegato a una siringa da 20 millilitri contenente terreno completo, sciacquare accuratamente le cellule del midollo osseo da ciascuna delle quattro ossa in una capsula di Petri sterile. Quindi, omogeneizzare delicatamente il terreno contenente il midollo eluso mediante pipettaggio per rimuovere il tessuto connettivo osseo e i grumi di cellule. Trasferire il campione in una provetta conica sterile da 50 millilitri, facendo passare le cellule attraverso un colino sterile in polipropilene da 70 micrometri per rimuovere il tessuto connettivo e i detriti ossei. Centrifugare le celle a 450 g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere ed eliminare con cura il surnatante, assicurandosi che il pellet rimanga aderente alla parete del tubo. Dopo aver incubato le cellule per un minuto a temperatura ambiente, risospenderle in 500 microlitri di tampone di lisi dei globuli rossi e neutralizzare il tampone di lisi con tre millilitri di terreno completo. Centrifugare le celle a 450 g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno completo. Dopo aver filtrato il campione come dimostrato, contare le cellule utilizzando un emocitometro. Aggiungere 300 nanogrammi per millilitro di ligando ricombinante della tirosin-chinasi 3 murina correlata alla FMS, o FLT3L, al terreno di coltura. Placcare le celle in una piastra a più pozzetti a una concentrazione di uno per 10 alla potenza di sei celle per millilitro. Incubare le cellule per sette giorni a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica. Il terzo giorno, rimuovere un millilitro di terreno da ciascun pozzetto senza disturbare le cellule e sostituirlo con un millilitro di terreno completo fresco preriscaldato, integrato con 150 nanogrammi per millilitro di FLT3L murino ricombinante. Le vescicole extracellulari, o EV, purificate dallo stadio larvale di Echinococcus granulosus erano principalmente piccole vescicole extracellulari con dimensioni comprese tra 50 e 200 nanometri, confermate dalla diffusione dinamica della luce e dalla microscopia elettronica a trasmissione. Le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo hanno dimostrato una differenziazione morfologica nell'arco di sette giorni, progredendo da piccole cellule ematopoietiche rotonde a cellule a forma di stella con estensioni citoplasmatiche. Dopo un'ora di incubazione, le cellule dendritiche hanno catturato piccole EV marcate in fluorescenza, che si sono co-localizzate con molecole MHCIII nei compartimenti endosomiali-lisosomiali, come confermato dalla microscopia confocale.