Un metodo QuEChERS-HPLC modificato per la rilevazione di idrocarburi policiclici aromatici in embrioni di zebrafish esposti a particolato fine

Questa ricerca mira a sviluppare un metodo QuEChERS-HPLC modificato per quantificare gli IPA negli embrioni di zebrafish esposti a EOM, affrontando l'attuale divario causato dalle sfide tecniche nella misurazione dei livelli interni di IPA a causa delle dimensioni della massa degli embrioni e della complessità della loro matrice biologica. Per ottenere risultati affidabili sono necessari 200 embrioni per gruppo, il che rappresenta una sfida pratica. La combinazione dell'HPLC con il rivelatore a fluorescenza potrebbe migliorare ulteriormente la sensibilità del metodo. Rispetto ad altre tecniche, questo metodo QuEChERS-HPLC modificato riduce significativamente il tempo di sospensione del campione e fornisce un approccio rapido ed efficiente per l'analisi dei livelli di 16 IPA negli embrioni di zebrafish esposti a EOM.

[Narratore] Per iniziare, preparare il campione QuEChERS estraendo le piastre contenenti gli embrioni dall'incubatrice a 72 ore dalla fecondazione. Lavare gli embrioni tre volte con acqua pura. Trasferisci gli embrioni in provette da 1,5 millilitri e rimuovi l'acqua in eccesso. Metti le provette in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti per liofilizzare gli embrioni. Dopo la liofilizzazione, macinare gli embrioni con una bacchetta di vetro. Aggiungere 25 microlitri di 16 idrocarburi policiclici aromatici, o IPA, miscela di soluzione standard al gruppo di controllo DMSO per testare il recupero dei picchi. Quindi, aggiungere un millilitro di n-esano e agitare per 30 secondi. Ultrasuoni la miscela a 35 gradi Celsius per 30 minuti. A questo punto, centrifugare il campione a 7.000 g per cinque minuti. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Far evaporare i surnatanti raccolti fino a renderli asciutti sotto il flusso di azoto in un bagno d'acqua a 35 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di acetonitrile e agitare per 30 secondi. Aggiungere al campione 10 milligrammi di ammina secondaria primaria, 45 milligrammi di solfato di magnesio e 15 milligrammi di impacchettamento C18, quindi agitare per 30 secondi. Centrifugare a 7.000 g per cinque minuti e trasferire il surnatante in una provetta nuova. Far evaporare il surnatante a 0,5 millilitri sotto azoto e filtrare il campione attraverso una membrana microporosa da 0,22 micrometri. Preparare una serie di soluzioni di lavoro che vanno da uno a 500 nanogrammi per millilitro per lo standard di miscela 16 IPA utilizzando acetonitrile. Iniettare 20 microlitri delle soluzioni campione in un cromatografo liquido utilizzando una fase di acetonitrile o una fase mobile ad acqua e seguire la procedura di eluizione mostrata sullo schermo. Tracciare una curva standard con le concentrazioni di massa delle soluzioni di lavoro standard sull'asse x e le corrispondenti aree di picco sull'asse y, coprendo un intervallo da cinque nanogrammi per millilitro a 500 nanogrammi per millilitro. Iniettare il campione purificato nel cromatografo liquido dotato di un rivelatore a fluorescenza, o FLD, e di un rivelatore a matrice di diodi, o DAD. Identificare la presenza di IPA confrontando i tempi di ritenzione. Misurare le aree di picco per determinare la concentrazione. Infine, calcolare le concentrazioni interne dei 16 IPA in base alle concentrazioni di massa misurate. In questa tabella sono riportate le concentrazioni di idrocarburi policiclici aromatici, o IPA, negli embrioni di zebrafish a 72 ore dalla fecondazione. Sei IPA sono stati rilevati con successo in embrioni di zebrafish esposti alla materia organica estraibile, o EOM. Al contrario, solo due IPA sono stati identificati nei campioni di controllo DSMO, a livelli significativamente inferiori a quelli dei campioni EOM.