Visualizzazione bidimensionale a super-risoluzione della microvascolarizzazione del cervello di ratto mediante microscopia di localizzazione ecografica

L'ambito della nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di un protocollo per la microscopia di localizzazione ecografica per ottenere immagini a super risoluzione della microvascolarizzazione cerebrale di ratto. Il nostro obiettivo è quello di affrontare le sfide del bilanciamento della risoluzione speciale e delle profondità di penetrazione nell'imaging di piccoli vasi, fornendo informazioni dettagliate sulla struttura vascolare e sulla dinamica del flusso sanguigno negli stati sani e patologici.

Il nostro protocollo offre il vantaggio di raggiungere un'elevata risoluzione spaziale di 12,5 micrometri, pur mantenendo una profondità di penetrazione fino a 12 millimetri, superando i metodi convenzionali, come la risonanza magnetica, la TC e la doppia ecografia. A differenza delle tecniche ottiche, consente l'imaging delle regioni cerebrali profonde, la ricostruzione delle strutture microvascolari e la visualizzazione simultanea delle dinamiche del flusso sanguigno.

I nostri risultati aprono la strada allo studio dei cambiamenti microvascolari nei disturbi neurologici, come il tumore dei glioblasti e il morbo di Alzheimer. La capacità di visualizzare la dinamica del flusso sanguigno e l'architettura microvascolare ad alta risoluzione apre nuove opportunità per studiare la progressione della malattia, l'efficacia del trattamento e la relazione tra alterazioni muscolari e funzione cerebrale.

[Narratore] Per iniziare, posizionare il ratto anestetizzato sul tavolo operatorio. Fissare gli incisivi superiori del ratto nella tacca della barra incisiva, posizionando la mascella inferiore sotto la barra. Posizionare le barre auricolari nella rientranza ossea, leggermente anteriormente e superiormente al condotto uditivo, assicurandosi che la superficie cranica rimanga orizzontale. Applicare una piccola quantità di pressione su diverse parti della testa per valutare la stabilità. Regola con precisione l'altezza della piattaforma di imaging e regola l'angolazione della testa del ratto utilizzando la tacca della barra incisiva per garantire una respirazione senza ostacoli. Applicare unguento all'eritromicina o una soluzione di glicerina al 30% sugli occhi del ratto per proteggerli dalle luci chirurgiche e mantenere l'umidità. Con un tagliacapelli elettrico portatile, radere la testa del ratto contro la direzione di crescita dei peli, coprendo l'area tra le orecchie e dagli occhi al collo. Ora, fai un'incisione lungo la sutura sagittale del cranio del ratto, iniziando solo dall'osso occipitale ed estendendoti di circa quattro centimetri anteriormente. Usa gli emostatici per ritrarre la pelle su entrambi i lati. Facoltativamente, asportare la pelle sopra il cranio per un maggiore accesso. Usa piccole forbici per rimuovere il periostio dal cranio, esponendo completamente lo strato di osso duro. Eseguire la craniotomia con un mini trapano cranico portatile, dotato di una punta sferica da 2,5 millimetri. Picchiettare delicatamente per abraidare l'osso, perforando per due o tre secondi alla volta, iniziando centralmente e progredendo verso l'esterno. Iniettare circa un millilitro di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% ogni due minuti nell'area di perforazione per raffreddare e sciacquare via i detriti. Passa a una punta da trapano più fine da un millimetro quando il tessuto osseo bianco non appare più collegato in modo coerente. La perforazione continua fino a quando i vasi sanguigni principali centrali sono chiaramente visibili come marrone scuro con il tessuto circostante che appare rosa e i micro vasi leggermente rossastri. Per preparare il mezzo di contrasto, sciogliere il gas SF6 e la polvere di mezzo di contrasto liofilizzato in cinque millilitri di cloruro di sodio allo 0,9%. Agitare energicamente la miscela per formare una microbolla, o sospensione MB, con una concentrazione finale di SF6 di otto microlitri per millilitro. Aspirare 0,8 millilitri della sospensione MB in una siringa da un millilitro collegata a una pompa di microiniezione. Inserire un ago a permanenza in calibro 26 con un catetere nella vena caudale del ratto e iniettare. Prima dell'imaging, montare una sonda con una frequenza centrale di 15,625 megahertz sul braccio manipolatore dello strumento stereotassico cerebrale dotato di un morsetto. Posizionare la sonda ecografica direttamente sopra il cervello di ratto esposto e applicare il gel di accoppiamento sulla superficie cerebrale esposta per garantire una trasmissione ottimale del segnale. Apri l'interfaccia principale del software, che integra un atlante cerebrale avvolgente con programmi di controllo del movimento del motore. Imposta il punto BGMA come origine e utilizza la visualizzazione in tempo reale del software per monitorare la traiettoria della sonda e la corrispondente posizione della fetta di cervello di ratto. Selezionare il piano di imaging di destinazione, ad esempio BGMA meno un millimetro. Avvia il software MATLAB 2021a e inserisci lo script di acquisizione dati in MATLAB 2021a. Nella directory principale, digitare "activate" nella finestra della riga di comando per attivare l'ambiente di runtime. Quindi impostare le profondità di inizio e fine della raccolta dei dati rispettivamente a cinque e 120 lunghezze d'onda, per catturare efficacemente la regione di interesse. Imposta gli angoli di sterzata della trasmissione dell'onda piana da meno cinque gradi a cinque gradi con incrementi di 2,5 gradi per migliorare la risoluzione e il contrasto dell'immagine. La microscopia di localizzazione ecografica ha rivelato una chiara visualizzazione dei microvasi a profondità fino a 12 millimetri. L'analisi dell'intera larghezza a metà del massimo ha indicato il diametro del vaso più piccolo rilevabile di 13 micrometri. La correlazione dell'anello di Fourier ha confermato la risoluzione spaziale dell'imaging microvascolare a 12,5 micrometri. Le direzioni del flusso sanguigno in una sezione trasversale del cervello di ratto hanno dimostrato il flusso verso il basso nelle piccole arterie corticali e il flusso verso l'alto nelle piccole vene, rappresentate rispettivamente dai colori blu e rosso. Una mappa della velocità ha mostrato portate più elevate in recipienti più grandi, con la maggior parte delle velocità concentrate nell'intervallo da 10 a 25 millimetri al secondo. L'imaging del modello di ratto con glioblastoma ha mostrato una dilatazione vascolare anormale, irregolarità strutturali vicino al tumore, modelli di flusso sanguigno alterati nella regione tumorale e un flusso vascolare eterogeneo all'interno e intorno al tumore.