Name: Limaging tridimensionale di tessuti tumorali utilizzando lo sbiancamento iterativo estende lapproccio alla multiplexità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Scopri l'imaging tridimensionale di tessuti tumorali con sbiancamento iterativo per caratterizzare le metastasi peritoneali. Questo protocollo di immunofluorescenza multiplex rivela l'architettura spaziale del microambiente tumorale.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 750 Falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A30105</td><td>Colorante F-actina</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-umano CD206 (MMR) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>321114</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-umano CD31 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>303110</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-umano CD4 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>300519</td><td>Alexa</td></tr><tr><td>Fluor 488 anticorpo HLA-DR umano</td><td>Anticorpo BioLegend</td><td>307656</td><td>Alexa</td></tr><tr><td>Fluor 488 anti-topo/umano CD44 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>103016</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-umano CD45 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>304060</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anticorpo anti-Calretinina [EP1798]</td><td>Abcam</td><td>ab214244</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticorpo CD3 umano</td><td>BioLegend</td><td>300416</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-umano CD8 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>344726</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-podoplanina umana Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>337007</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-vimentina Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>677807</td><td>Alexa</td></tr><tr><td>Fluor 647 CD68 Anticorpo (KP1)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20060AF647</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 750 citocheratina, pan Anticorpo (AE-1/AE-3)</td><td>Novus</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 750 Umano alfa-muscolo liscio actina</td><td>anticorpo R& </td><td>Anticorpo</td>D <td>IC1420S</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 CD20 Anticorpo monoclonale (L26) eBioscience</td><td>Thermo Fisher</td><td>53-0202-82</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td>integratore Terreno di raccolta</td></tr><tr><td>BioMed Clear Resin (Form 3)</td><td>Resina FormLabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>utilizzata per piattaforma + piastra di incubazione</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-500g</td><td>Componente della soluzione di blocco</td></tr><tr><td>Materiale acrilico colato di spessore</td><td></td><td></td> 1/32" <td>utilizzato per il taglio del cursore</td></tr><tr><td>CleanStation DT3&nbsp;</td><td>Post-elaborazione Stratasys</td><td>DT3</td><td>per regolatore di altezza e coperchio esterno</td></tr><tr><td>Contenitore, Campione&nbsp;</td><td>McKesson</td><td>870203</td><td>trasferimento di tessuto dal tavolo di perazione al tavolo di preparazione</td></tr><tr><td>CorelDraw&nbsp;</td><td>CorelDRAW</td><td></td><td>Software per preparare il file di progettazione vettoriale per il taglio laser</td></tr><tr><td>Cytofix</td><td>BD Bioscience</td><td>554655</td><td>fissativo</td></tr><tr><td>Piatto 15 cm</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>piatto utilizzato durante il montaggio</td></tr><tr><td>Piatto 35 mm N. 1.5 Vetrino coprioggetti 14 mm Diametro vetro Non rivestito</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>piatto di imaging</td></tr><tr><td>DMEM (senza glucosio)</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td>terreno di raccolta</td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>BD Bioscience</td><td>564220</td><td>componente della soluzione bloccante</td></tr><tr><td>Form 3B+</td><td>Formlabs</td><td>Form 3B+</td><td>stampante utilizzata per piattaforma + piastra di incubazione</td></tr><tr><td>Form Cure</td><td>Formlabs</td><td>FH-CU-01</td><td>post-elaborazione per piattaforma + piastra di incubazione</td></tr><tr><td>Form Wash</td><td>Formlabs</td><td>FH-WA-01</td><td>post-elaborazione per piattaforma + piastra</td></tr> <tr>di incubazione<td>GrabCAD Print</td><td></td><td>GrabCAD Software di stampa</td><td>GrabCAD per preparare modelli per stampanti Stratasys</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>colorante nucleare</td></tr><tr><td>J826 Prime Stampante 3D</td><td>Stratasys</td><td>J826</td><td>utilizzata per il regolatore di altezza e il coperchio esterno</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>LAS X</td><td>Software confocale</td></tr><tr><td>Sistema di taglio laser&nbsp;</td><td>Universal Laser Systems</td><td>ULS PLS6.150D</td><td>CO2 Taglio laser utilizzato per slider</td></tr><tr><td>Boroidruro</td><td>di litio STREM Sostanze chimiche</td><td>93-0397</td><td>prodotto chimico sbiancante</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Base 10010023 Gibco</td><td></td><td>Buffer per lavaggio, blocco, colorazione</td></tr><tr><td>PreForm</td><td>FormLabs</td><td>PreForm</td><td>Software per preparare modelli per stampanti Formlab</td></tr><tr><td>Suture di seta&nbsp; 2-0&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>A305. O35</td><td>affissione tessuto alla piattaforma</td></tr><tr><td>Microscopio confocale Stellaris 8 WLL</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 8</td><td>Imaging confocale&nbsp;</td></tr><tr>Filtro <td></td><td></td><td>per siringa</td><td>filtro ab soluzione</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>American Bio</td><td>AB02025-00100</td><td>reagente permeabelizzante, componente della soluzione bloccante</td></tr><tr><td>Vero ContactClear</td><td>Stratasys</td><td>CTT610, resina da 4 KG</td><td>utilizzata per il regolatore di altezza e il coperchio esterno</td></tr><tr><td>Vassoio riscaldante</td><td>Spring USA</td><td>ST-1220</td><td>mantiene caldi i terreni e i tessuti</td></tr><tr><td>Acqua, distillata</td><td>Gibco</td><td>15230-170</td><td>diluente per LiBH4</td></tr></tbody></table>

l'imaging tridimensionale di tessuti tumorali utilizzando lo sbiancamento iterativo estende l'approccio alla multiplexità

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

Il peritoneo è una struttura membranosa di spessore inferiore a 1 mm che riveste la superficie della parete addominale ed è contigua alle superfici degli organi addominali. È composto da mesotelio superficiale e tessuto connettivo sottostante intervallato da cellule adipose, linfociti, macrofagi e fibroblasti, nonché da vasi sanguigni e linfatici. Le neoplasie peritoneali derivano più spesso da metastasi tumorali addominali (ad esempio, carcinoma ovarico o carcinoma gastrico)18 o, meno frequentemente, possono essere tumori primari del peritoneo (ad esempio, mesotelioma)19. Queste lesioni tumorali, spesso piccole (&lt;1 cm), sono molto complesse ma sono suscettibili di caratterizzazione 3D utilizzando la tecnica descritta. Una proiezione massima di cinque sezioni confocali viene utilizzata per visualizzare l'intero campione montato su una piattaforma (Figura 4, riquadro nell'angolo in alto a sinistra). Per il primo ciclo di IBEX sono stati utilizzati tre anticorpi coniugati primari (AF488-CD44, AF594-CD45 e AF647-Podoplanina) insieme al colorante nucleare Hoechst (IBEX1, Figura 4). Le lesioni tumorali diventano evidenti dalle strutture a rosetta che sono doppiamente positive per CD44 e Podoplanina e mostrano una disposizione dei nuclei caratteristica del mesotelioma papillare.
Le cellule tumorali sono state identificate utilizzando la morfologia cellulare e due anticorpi poiché sia l'anti-Podoplanina che l'anti-CD44 riconoscono le cellule non tumorali, come evidenziato dal rilevamento di vasi linfatici tramite anti-Podoplanina e dal legame dell'anticorpo CD44 a sottogruppi di cellule immunitarie. Le regioni di interesse (ROI) più piccole vengono quindi acquisite utilizzando un formato di scansione delle tessere a risoluzione più elevata con dimensioni ottimizzate del passo Z per il rendering di proiezioni 3D (Figura 5A). Le piattaforme sono state sottoposte alle procedure di colorazione iterativa e le stesse ROI sono state visualizzate nei cicli IBEX 1-6. Le immagini rappresentative per le interfacce del tumore (riquadro giallo) e della struttura linfoide tumorale-terziaria (TLS) (riquadro blu) sono assemblate nella Figura 5B-M. 
La presenza di TLS e la densità delle cellule CD3-positive indicano una significativa infiltrazione di cellule immunitarie20 e possibilmente risposta ai farmaci immunomodulatori21. Da notare che la TLS e la maggior parte delle lesioni tumorali sono presenti in diverse profondità Z del tessuto, come dimostrato confrontando le proiezioni stack di diverse sezioni ottiche nella Figura 6, evidenziando i vantaggi dell'imaging 3D e la potenziale biologia mancata quando l'imaging 2D viene applicato a strutture 3D. Il carattere 3D di queste lesioni diventa più evidente nei file dei filmati (Filmati 1-12), che raffigurano le rappresentazioni volumetriche delle singole lesioni nella Figura 5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig01.jpg"> 
Figura 1: Flusso di lavoro dalla stampa 3D all'imaging 3D dei tumori peritoneali. Il protocollo consiste in una sequenza di cinque passaggi per preparare immagini multiplex 3D dal tessuto peritoneale portatore di tumore. (1) Stampa di piattaforme riceventi di tessuti, parti di adattatori di imaging e piastre di incubazione. (2) Procedure di approvvigionamento e montaggio dei tessuti. (3) Fissazione con paraformaldeide. (4) Cicli di colorazione e imaging IBEX. (5) Ricostruzione 3D utilizzando software di imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig02.jpg"> 
Figura 2: Componenti hardware con interfaccia tissutale per l'imaging 3D. (A) Diagramma schematico dell'assemblaggio della piattaforma all'interno dell'adattatore di imaging. (B) Una piastra di incubazione a 9 pozzetti. (C) Fotografie dei componenti dell'adattatore di immagine con assemblaggio. (D) Peritoneo portatore di mesotelioma come osservato durante la laparoscopia diagnostica. (E) Montaggio del tessuto sulla piattaforma. (F,G) Peritoneo tumorale montato su piattaforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig03.jpg"> 
Figura 3: Schema cronologico dei cicli IBEX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig04.jpg"> 
Figura 4: Panoramica della piattaforma dopo l'incubazione con il pannello IBEX1. Proiezione massima dell'intera piattaforma dopo l'incubazione con il pannello IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 e AF647-Podoplanin). Il cerchio tratteggiato evidenzia il tumore. Riquadro: Fotografia del peritoneo tumorale montato sulla piattaforma di imaging. Barra della scala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig05.jpg"> 
Figura 5: Immagini in immunofluorescenza ad alta risoluzione di regioni selezionate della piattaforma. (A) Proiezione massima di un'immagine Z-stack a 56 tile acquisita dopo l'incubazione con il pannello IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 e AF647-Podoplanin). Rettangolo giallo: lesione tumorale mostrata nei pannelli (B-G). Rettangolo blu: interfaccia della struttura linfoide tumorale-terziaria mostrata in (H-M). (B-G) Una singola lesione tumorale con pannello IBEX 1-6 in rendering di volume. (B) IBEX1, verde: CD44, rosso: CD45, ciano: Podoplanina. (C) IBEX2, verde: CD20, rosso: F-actina, ciano: CD3. (D) IBEX3, verde: CD8, rosso: CD4, ciano: panCK. (E) IBEX4, verde: CD31, ciano: CD68. (F) IBEX5, verde: CD206, ciano: calretitina. (G) IBEX6, verde: Vimentina, rosso: HLADR. (H-M) Una singola struttura linfoide tumorale-terziaria si interfaccia con il pannello IBEX 1-6 nel rendering del volume. (H) IBEX1, verde: CD44, rosso: CD45, ciano: Podoplanina. (I) IBEX2, verde: CD20, rosso: F-actina, ciano: CD3. (J) IBEX3, verde: CD4, rosso: panCK, ciano: CD8. (K) IBEX4, verde: CD31, rosso: SMA, ciano: CD68. (L) IBEX5, verde: CD206, ciano: calretitina. (M) IBEX6, verde: HLADR, ciano: Vimentina. Tutti i pannelli, blu: Hoechst. Barre della scala: (A, 1 mm); (B-M, 250 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig06.jpg"> 
Figura 6: Imaging 2D simulato. Il confronto tra proiezioni limitate (10 sezioni ottiche) e full stack (102 sezioni ottiche) conferma la perdita di contesto tissutale nella simulazione 2D. (A) Proiezione massima delle sezioni 30-40 (10 μm). (B) Proiezione massima delle sezioni 85-95 (10 μm). (C) Proiezione massima delle sezioni 1-102 (~100 μm). Tutti i pannelli, IBEX2 (Hoechst, AF488-CD20, AF647-CD3, AF790-falloidina). Barra della scala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Anticorpi utilizzati per i singoli pannelli IBEX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Table%201_IBEX%20panels.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Filmato 1: Rendering animato a volume della singola lesione con pannello IBEX 1 (blu: Hoechst, verde: CD44, rosso: CD45, ciano: Podoplanina). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie1_IBEX1.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 2: Rendering animato del volume della singola lesione con pannello IBEX 2 (blu: Hoechst, verde: CD20, rosso: F-actina, ciano: CD3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie2_IBEX2.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 3: Rendering animato a volume della singola lesione con pannello IBEX 3 (blu: Hoechst, verde: CD8, rosso: CD4, ciano: panCK). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie3_IBEX3.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 4: Rendering animato a volume della singola lesione con pannello IBEX 4 (blu: Hoechst, verde: CD31, ciano: CD68). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie4_IBEX4.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 5: Rendering animato del volume della singola lesione con pannello IBEX 5 (blu: Hoechst, verde: CD206, ciano: Calretinina). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie5_IBEX5.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 6: Rendering animato in volume della singola lesione con pannello IBEX 6 (blu: Hoechst, verde: Vimentina, rosso: HLADR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie6_IBEX6.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 7: Rendering animato del volume dell'interfaccia struttura-lesione linfoide terziaria con pannello IBEX 1 (blu: Hoechst, verde: CD44, rosso: CD45, ciano: Podoplanina). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie7_TLS_IBEX1.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 8: Rendering animato del volume dell'interfaccia struttura-lesione linfoide terziaria con pannello IBEX 2 (blu: Hoechst, verde: CD20, rosso: F-actina, ciano: CD3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie8_TLS_IBEX2.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 9: Rendering animato del volume dell'interfaccia struttura-lesione linfoide terziaria con pannello IBEX 3 (blu: Hoechst, verde: CD8, rosso: CD4, ciano: panCK). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie9_TLS_IBEX3.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 10: Rendering animato del volume dell'interfaccia struttura-lesione linfoide terziaria con il pannello IBEX 4 (blu: Hoechst, verde: CD31, rosso: SMA, ciano: CD68). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie10_TLS_IBEX4.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 11: Rendering animato del volume dell'interfaccia struttura-lesione linfoide terziaria con il pannello IBEX 5 (blu: Hoechst, verde: CD206, ciano: Calretinina). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie11_TLS_IBEX5.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
Filmato 12: Rendering animato del volume dell'interfaccia struttura-lesione linfoide terziaria con pannello IBEX 6 (blu: Hoechst, verde: Vimentina, rosso: HLADR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie12_TLS_IBEX6.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo filmato.</a>
File supplementare 1: File di stampa per la piastra di incubazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/incubation_plate.form" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: file di stampa per le 36 singole piattaforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/platform_x36.form" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: File di stampa per l'anello di regolazione dell'altezza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/SMART_imaging_heightAdjuster.STL" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 4: File di stampa per il coperchio esterno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/SMART_imaging_petriDishLid_35mm.STL" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 5: File tagliato al laser per il cursore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/imaging_platform_slider.DWG" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

L'imaging tridimensionale di tessuti tumorali utilizzando lo sbiancamento iterativo estende l'approccio alla multiplexità

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

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Qui descriviamo un metodo per l'imaging multi-fotofilano ad alta risoluzione delle cellule tumorali cerebrali prima e dopo l'intervento chirurgico invasivo (ad esempio, biopsia) all'interno dello stesso animale vivente. Questo metodo consente di studiare l'impatto di queste procedure chirurgiche invasive sul comportamento migratorio, invasivo e proliferativo delle cellule tumorali a livello di singola cellula.

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Scopri l'imaging tridimensionale di tessuti tumorali con sbiancamento iterativo per caratterizzare le metastasi peritoneali. Questo protocollo di immunofluorescenza multiplex rivela l'architettura spaziale del microambiente tumorale.

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