L'imaging tridimensionale di tessuti tumorali utilizzando lo sbiancamento iterativo estende l'approccio alla multiplexità

Questa ricerca si concentra sull'identificazione di bersagli per farmaci immunomodulatori e tumori gastrointestinali solidi complessi. L'analisi del panorama cellulare del microambiente tumorale è assolutamente cruciale per comprendere la suscettibilità a trattamenti come l'immunoterapia. Il sequenziamento di singole cellule e la citometria a flusso aiutano a caratterizzare il microambiente tumorale, ma mancano di contesto spaziale. Recentemente, sono emerse piattaforme multiplex di imaging e trascrittomica per studiare il microambiente tumorale nel suo contesto in-vivo.

Le tecnologie multiplex disponibili per l'analisi del microambiente tumorale, sia iterative che all-in-one, sono limitate a due dimensioni. Questo protocollo estende la caratterizzazione alla dimensione della profondità, fornendo informazioni oltre le singole FFPE o le sezioni congelate.

[Narratore] Per iniziare, trasferire i fogli di tessuto in una tazza per campioni contenente un terreno di coltura caldo e posizionarli su una piastra riscaldante sul tavolo di preparazione. Montare il tessuto su piattaforme in una piastra di 15 centimetri contenente il terreno di raccolta. Avvolgere con cura il tessuto tumorale con il lato mesoteliale rivolto verso l'alto sopra il lato dell'orifizio piccolo della piattaforma e fissarlo con una sutura di seta 2-0. Posizionare la piattaforma di tessuto preparata completamente immersa in una piastra a 24 pozzetti contenente il terreno di raccolta. Per il fissaggio, aggiungere 10 millilitri di brodo fissativo a una provetta conica da 50 millilitri contenente 30 millilitri di PBS freddo per preparare 40 millilitri di tampone di fissaggio. Utilizzando una pinza, trasferire il tessuto montato sulle piattaforme al tampone di fissaggio. E incubare per 24 ore a 4 gradi Celsius. Decantare il fissativo. Sostituirlo con 40 millilitri di PBS freddo. E incubare per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Per la colorazione, aggiungere 1 millilitro di tampone bloccante in un pozzetto e inserire la piattaforma tissutale. Bloccare per almeno due ore a temperatura ambiente su un bilanciere impostato a una bassa velocità di 30 giri/min. Preparare 0,8 millilitri di soluzione di colorante anticorpale in una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 10.000 g per due minuti a temperatura ambiente. Trasferire 0,75 millilitri di surnatante in un pozzetto pulito di una piastra di incubazione a 9 pozzetti. E inserire una piattaforma lavata. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio. E incubare per almeno due ore a temperatura ambiente su un bilanciere impostato a una bassa velocità di 30 giri/min. Lavare la piattaforma in un tubo conico da 50 millilitri contenente 40 millilitri di PBS per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Aggiungi 0,1 millilitri di PBS al centro del fondo di vetro di un piatto di imaging da 3,5 centimetri e mettilo da parte. Avvitare l'anello di regolazione dell'altezza senza stringere in senso orario nel coperchio esterno. E montare la piattaforma nel supporto interno in plastica, assicurando l'allineamento della scanalatura della tacca. Fissare la piattaforma con il cursore. Posizionare l'adattatore di imaging assemblato sul piatto inferiore in vetro e abbassare con cautela l'anello di regolazione dell'altezza fino a quando il tessuto non tocca il tampone. Una volta raggiunta la distanza ottimale dal vetro, aggiungere 0,2 millilitri di PBS sul tessuto con il lato inferiore rivolto verso l'alto per prevenire la disidratazione dei tessuti durante l'imaging. Avviare il software di acquisizione delle immagini. Selezionare l'obiettivo appropriato, ad esempio 20X o 40X, e aggiungere il mezzo di immersione corrispondente. Scegli i parametri di acquisizione dell'immagine, come una velocità di scansione di 600 hertz, una risoluzione XY di 1024 x 1024 pixel, medie a tre righe e una scansione bidirezionale. Selezionare le linee laser appropriate o regolare il laser a luce bianca in modo che corrisponda agli spettri di eccitazione ed emissione dei fluorofori utilizzati per la colorazione. Posizionare la piastra di imaging assemblata nel portacampioni sul tavolino del microscopio. Centrare il campione utilizzando il controllo XY, avvicinare l'obiettivo al vetro di copertura e avviare l'acquisizione dell'immagine. Dopo ogni ciclo di imaging, eseguire una fase di sbiancamento. Preparare 5 millilitri di soluzione di boroidruro di litio da 1,5 milligrammi per millilitro in acqua distillata e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Trasferire 1 millilitro della soluzione di boroidruro di litio in un pozzetto pulito della piastra di incubazione a 9 pozzetti e inserire la piattaforma lavata per 60 minuti a temperatura ambiente. Lavare brevemente la pedana in 20 millilitri di PBS all'interno di un tubo conico. Verificare la presenza del segnale fluorescente rimanente utilizzando l'impostazione laser più alta per la compensazione Z. Qui viene mostrato un campione peritoneale portatore di tumore colorato con il primo ciclo di sbiancamento iterativo che estende la multiplexity, o IBEX 1, per la visualizzazione. Le lesioni tumorali sono state identificate come strutture simili a rosetta che erano doppiamente positive per CD44 e podoplanina con arrangiamenti nucleari caratteristici del mesotelioma papillare. Qui sono mostrate immagini di immunofluorescenza ad alta risoluzione di regioni selezionate dal campione peritoneale portatore di tumore. Queste immagini rivelano le regioni tumorali e le interfacce della struttura linfoide terziaria tumorale, evidenziando un'infiltrazione costante delle cellule immunitarie con un'alta densità di cellule CD45-positive. Questa figura presenta la colorazione iterativa in immunofluorescenza tra i cicli IBEX da uno a sei, illustrando la distribuzione spaziale dei marcatori immunitari e strutturali all'interno della lesione tumorale e dell'interfaccia della struttura linfoide terziaria tumorale. Qui sono presentate le proiezioni massime delle diverse sezioni ottiche. Questo imaging 3D ha confermato che le lesioni tumorali e le strutture linfoidi terziarie risiedono a diverse profondità Z, dimostrando i limiti dell'imaging 2D nel catturare l'architettura tissutale complessa.