Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Una panoramica completa delle tecniche coinvolte nella generazione di un modello murino di cancro orale e monitoraggio quantitativo di invasione tumorale all'interno della lingua attraverso multi-fotone microscopia di cellule marcate è presentato. Questo sistema può essere utilizzato come piattaforma utile per la valutazione molecolare e di efficacia dei farmaci anti-invasiva composti.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre un modello murino di cancro orale che consenta la visualizzazione e la quantificazione dell'invasione tumorale nella lingua. Ciò si ottiene generando prima cellule di carcinoma squamoso orale per l'imaging di due fotoni mediante infezione lentivirale della vita Act M cherry e selezione clonale stabile. Successivamente, i tumori ortotopici xenotrapianto vengono prodotti in topi nudi mediante iniezione di cellule marcate con ciliegia Life Act M nella lingua di topi anestetizzati.

Quindi le lingue contenenti tumore vengono visualizzate mediante microscopia a due fotoni. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un'invasione tumorale orale locale quantificata all'interno del muscolo della lingua attraverso l'imaging a due fotoni del tessuto della lingua fresco e la successiva ricostruzione tridimensionale assistita dal computer dei tumori primari e dei gruppi cellulari invasi a livello regionale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunoistochimica o l'imaging bioluminescente, è che l'invasione delle cellule tumorali può essere misurata quantitativamente in tre dimensioni.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'intervento terapeutico sul cancro orale perché fornisce un sistema modello per l'analisi delle proteine coinvolte nell'invasione tumorale, nonché per la valutazione di composti preclinici su strategie terapeutiche anti-invasive. In generale, gli individui che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà poiché l'iniezione delle cellule tumorali nella lingua e la preparazione della lingua per due microscopie fotografiche è tecnicamente impegnativa e richiede abilità e pratica. La visualizzazione di questo metodo è fondamentale in quanto l'iniezione del tumore in due fasi di fotoni è difficile da imparare e richiede competenze specialistiche per iniziare la coltura.

Linee cellulari tumorali umane della testa e del collo in terreno completo costituite da DMEM integrato con il 10% di FBS, l'1% di penicillina streptomicina e l'1% di aminoacidi non essenziali. Al fine di trasferire la sequenza di rivestimento della ciliegia LIFE Act M nel sito del vettore lentivirale PLL 7.0, è necessario introdurre tre mutazioni silenti nel sito di riconoscimento SBF one nel mCherry CD NA genitore. La successiva PCR amplifica la sequenza mCherry del Modified Life Act con il fiancheggiamento di ECO R un SBF uno siti e sub clent nel PLL 7.0. Per generare un costrutto di ciliegia PLL 7.0 LIFE Act M a seguito di una coltura del sistema di espressione lentivirale, la linea cellulare di confezionamento 2 9 3 T 17 al 40% di confluenza in terreno completo.

Utilizzando Cal Foss, trasfettare le cellule con i vettori PLL 7.0 LIFE Act M, cherry PS, PACS two e P-V-S-V-G in un rapporto rispettivamente di tre a due a uno. Dopo 24 ore, sostituire il terreno con un terreno fresco e completo, raccogliere e rabboccare il terreno ogni 12 ore per 72 ore e conservare il terreno raccolto a quattro gradi Celsius per produrre linee cellulari della testa e del collo con un'espressione stabile di ciliegia Act M. Far girare il terreno raccolto a 2000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius, aggiungere un millilitro del terreno chiarificato contenente il virus alle cellule OSC 19 o US CCC per 12 ore.

Sciacquare le cellule, quindi aggiungere un ulteriore millilitro di virus per un altro periodo di 12 ore. Coltivare le cellule in terreno contenente 200 milligrammi per millilitro di pura micina per due settimane Per selezionare colonie resistenti, colonie sopravvissute sottoposte a screening visivo per tutta la vita. Agire m espressione della ciliegia mediante microscopia a fluorescenza occhi di tripsina, singole colonie positive utilizzando dischi di clonazione sterili da tre millimetri.

Mantenere le cellule positive in un terreno contenente 200 milligrammi per millilitro di pura micina fino a quando non viene congelato, o utilizzato per l'iniezione ortotopica per generare un tumore ortotopico xenotrapianto di tripsina life Act. M cherry esprime le cellule tumorali quindi centrifugare la coltura e risospendere circa 2,5 volte 10 alle quarte cellule in 50 microlitri di terreno completo. Caricare le cellule tumorali in una siringa da un millilitro attaccata a un ago da mezzo pollice calibro 27.

Prossimo anestetismo, femmina di volpe atimica di otto settimane. Un topo nudo con una combinazione di 80 milligrammi per chilogrammo di ketamina e 10 milligrammi per chilogrammo di xilazina. Una volta che l'animale smette di muoversi, applicare un unguento lubrificante per gli occhi e verificare la reattività premendo un'unghia nel poggiapiedi.

Mantieni i mouse su un termoforo tra 37 e 40 gradi Celsius. Usando una pinza sterile, afferra delicatamente la punta della lingua ed estraila dalla cavità orale. Iniettare lentamente le cellule in un lato di ciascuna lingua per creare una massa bulbosa al centro della lingua.

Iniettare nei topi 2,1 milligrammi per chilogrammo di yohi being e rimetterli nel termoforo per monitorarli durante il recupero dall'anestesia. Metti i topi in gabbie sterili contenenti una dieta a base di pasta transgenica morbida. Pesare i topi ogni due o tre giorni e monitorarli visivamente per l'insorgenza del tumore.

Per preparare le lingue di topo per l'imaging ex vivo, sopprimere i topi che ospitano tumori in diversi punti temporali. Utilizzando l'inalazione di anidride carbonica, estrarre le lingue e sciacquarle con un XPBS. Quindi utilizzando il filo per cucire monofilamento da un negozio di hobby locale e un ago da cucito misura otto.

Attaccare la lingua a un lato di una cassetta di inclusione di tessuto di paraffina convenzionale. Una volta immobilizzata la linguetta, immergere l'intero gruppo cassetta in un XPBS. Elaborare immediatamente le lingue utilizzando la microscopia a due fotoni per visualizzare le lingue utilizzando la microscopia a due fotoni.

Immergere le cassette della lingua in un piatto da 60 millimetri contenente un XPBS. Fissare la parabola in un supporto dal design personalizzato su un braccio a sbalzo retrattile posizionato sotto l'obiettivo del microscopio a due fotoni. Posizionare un obiettivo ad immersione in acqua con apertura numerica 40 x 0,8 direttamente sopra o sopra una lesione tumorale visibile.

Imaging della lingua mediante microscopia a due fotoni con il laser in zaffiro di titanio con un'intensità di 60 milliwatt e una lunghezza d'onda di ingresso di 755 nanometri. Per ottimizzare il segnale M cherry, raccogliere immagini di scansione laser seriali da un micrometro a profondità incrementali di un micrometro su una profondità totale del tessuto compresa tra 15 e 100 micrometri. Con questa configurazione, è possibile analizzare tumori fino a un millimetro di profondità tissutale.

Usa l'immagine di scansione per acquisire le immagini. L'immagine di scansione genera un'uscita a due canali di modelli di scansione raster per controllare gli specchi di scansione metrica galva XY e allo stesso tempo cattura un massimo di quattro canali di segnale in ingresso simultaneamente dai tubi moltiplicatori di foto attraverso una scheda di acquisizione dati. L'immagine di scansione raccoglie le immagini della pila Z controllando l'asse Z dell'obiettivo e raccoglie le immagini time-lapse in modalità singola o ciclica.

Salva le immagini in un unico file TIF con profondità di 16 bit. Utilizzando il software Amira, è possibile eseguire il rendering delle immagini tumorali in un'unica immagine tridimensionale aprendo il file TIF contenente l'insieme delle immagini della pila Zs. Usa la funzione TEX per generare un rendering tridimensionale.

Nell'immagine renderizzata sarà probabilmente presente un'immagine di tumore primario di grandi dimensioni con diversi gruppi invasivi dissociati più piccoli o ig. Per misurare il volume del tumore, definire la soglia dell'area del tumore primario e ogni fetta della pila di immagini correggere ed eliminare la fluorescenza di fondo. Ripetere la procedura di soglia per ogni gruppo invasivo.

Una volta selezionati il tumore primario e tutte le ig, determinare la misurazione del volume e le coordinate OID del tumore X, Y e Z per il tumore primario. Per calcolare le distanze delle igs dal punto centrale del tumore, calcolare l'indice invasivo del tumore o ti utilizzando il ti è uguale a N NT per VT per dt. Dove NT è uguale al numero totale di ig nell'immagine, VT è uguale al volume totale di tutte le ig e DT è uguale alla distanza totale percorsa da tutti i gruppi invasivi dal centro del tumore primario.

È possibile generare rendering tridimensionali con maggiori dettagli topografici importando i file di punta monocromatici originali a 16 bit negli elementi NIS Nikon all'interno del software. Creare un file ND da una pila di immagini. Quindi calibrare manualmente il documento per specificare la dimensione in pixel per rendering di qualità superiore.

Aggiungere altre sezioni nel piano Z. Questa figura mostra un esempio dei dati grezzi acquisiti da un'immagine a due fotoni, da elementi NIS o da uno specchio. Il software può essere utilizzato per ricostruire i dati grezzi dei tumori della lingua, come mostrato in questa figura.

Questo pannello mostra un esempio di rendering tridimensionale utilizzando la funzione TEX nel software Amira. Ecco un esempio di soglia di una singola sezione di due fotoni dalla pila di immagini per identificare i gruppi invasivi dal tumore primario e dal centro tumorale primario o oide. Dopo l'analisi di ogni sezione di soglia, Amira quantifica il volume e la distanza percorsa da ciascun gruppo invasivo dal Centro.

Questi dati possono essere dimostrati graficamente e utilizzati per ottenere il valore numerico per il livello completo di invasione delle cellule tumorali. Attribuibili al sito primario qui mostrato sono immagini rappresentative dei tumori visualizzati dall'etichettatura immunoistochimica patologica convenzionale rispetto a un'immagine tridimensionale di un tumore simile utilizzando il protocollo descritto Una volta padroneggiata dal punto di estrazione della lingua al rendering 3D finale, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore se eseguita correttamente durante il tentativo di questa procedura, fare attenzione a non perforare la lingua con l'ago, perdendo così le cellule tumorali e impedendo l'assunzione del tumore Seguendo questa procedura. È possibile condurre test su composti terapeutici o cellule con livelli di proteine manipolate al fine di determinare la loro efficacia sull'invasione del cancro orale.

In un ambiente in vivo, non dimenticare che lavorare con cellule tumorali umane modificate con lentivirus è pericoloso precauzioni come DPI adeguati e lavorare in una cappa a flusso laminare certificata BSL due dovrebbe essere sempre presa mentre si lavora con topi iniettati.