Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre un modello murino di cancro orale che permetta la visualizzazione e la quantificazione dell'invasione tumorale nella lingua. Questo risultato si ottiene innanzitutto generando cellule di carcinoma squamoso orale adatte all'immagine a due fotoni, mediante infezione lentivirale con life Act M cherry e selezione stabile di cloni. Successivamente, vengono prodotti tumori xeno-graft ortotopici in topi nudi attraverso l'iniezione di cellule marcate con life Act M cherry nelle lingue di topi anestetizzati.

Successivamente, le lingue contenenti tumori vengono analizzate mediante microscopia a due fotoni. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un'invasione tumorale orale locale quantificata all'interno del muscolo linguale, grazie all'imaging a due fotoni di tessuto linguale fresco e alla successiva ricostruzione tridimensionale assistita da computer di tumori primari e di gruppi cellulari invasi a livello regionale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunohistochimica o l'imaging bioluminescente, consiste nella possibilità di misurare quantitativamente l'invasione delle cellule tumorali in tre dimensioni.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'intervento terapeutico sul cancro orale poiché fornisce un sistema modello per l'analisi delle proteine coinvolte nell'invasione tumorale, nonché per la valutazione di composti preclinici su strategie terapeutiche anti-invasive. Generalmente, le persone nuove a questa tecnica incontreranno difficoltà, poiché l'iniezione delle cellule tumorali nella lingua e la preparazione della lingua per la microscopia a due fotoni richiedono competenze tecniche elevate e una certa pratica. La visualizzazione di questo metodo è fondamentale, poiché l'iniezione tumorale nei passaggi a due fotoni è difficile da apprendere e richiede abilità specializzate per iniziare la coltura.

Linee cellulari tumorali umane di testa e collo in mezzo completo costituito da DMEM integrato con 10% di FBS, 1% di penicillina-streptomicina e 1% di aminoacidi non essenziali. Per trasferire la sequenza di rivestimento LIFE Act M cherry nel vettore lentivirale PLL 7.0, è prima necessaria una mutagenesi mirata al sito per introdurre tre mutazioni silenti nel sito di riconoscimento SBF uno presente nell'originale mCherry CD NA. Successivamente, amplificare mediante PCR la sequenza modificata di Life Act mCherry con siti ECO R uno e SBF uno alle estremità e clonarla nel vettore PLL 7.0. Per generare un costrutto PLL 7.0 LIFE Act M cherry seguendo un sistema di espressione lentivirale, coltivare la linea cellulare da imballaggio 2 9 3 T fino a una confluenza del 17-40% in mezzo completo.

Utilizzando Cal Foss, trasfettare le cellule con i vettori PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS due e P-V-S-V-G in un rapporto rispettivo di tre a due a uno. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con mezzo completo fresco, raccogliere e rinnovare il mezzo ogni 12 ore per 72 ore, e conservare il mezzo raccolto a quattro gradi Celsius per generare linee cellulari di testa e collo con espressione stabile di LIFE Act M cherry. Centrifugare il mezzo raccolto a 2000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi Celsius, aggiungere un millilitro del mezzo chiarificato contenente il virus alle cellule OSC 19 o US CCC una per 12 ore.

Lavare le cellule, quindi aggiungere un ulteriore millilitro di virus per un altro periodo di 12 ore. Coltivare le cellule in mezzo contenente 200 milligrammi per millilitro di puromicina per due settimane per selezionare le colonie resistenti, selezionando visivamente le colonie sopravvissute in vita. Rilevare l'espressione di Act m cherry mediante microscopia a fluorescenza, tripsinizzare singole colonie positive utilizzando dischetti di clonaggio sterili da tre millimetri.

Mantenere le cellule positive in un mezzo contenente 200 milligrammi per millilitro di puromicina fino al congelamento o all'uso per iniezione ortotopica per generare un xenotrapianto tumorale ortotopico trypsin life Act. M cherry; quindi centrifugare la coltura e risospendere circa 2,5 × 10⁴ cellule in 50 microlitri di mezzo completo. Caricare le cellule tumorali in una siringa da 1 millilitro collegata a un ago da 27 gauge, lungo mezzo pollice.

Successivamente anestetizzare un topo athymico femmina di otto settimane, nudo, con una combinazione di 80 milligrammi per chilogrammo di chetamina e 10 milligrammi per chilogrammo di xilazina. Una volta che l'animale smette di muoversi, applicare un unguento lubrificante sugli occhi e verificare la risposta premendo un'unghia sul cuscinetto plantare.

Mantenere i topi su un pad riscaldante tra 37 e 40 gradi Celsius. Utilizzando pinzette sterili, afferrare delicatamente la punta della lingua ed estrarla dalla cavità orale. Iniettare lentamente le cellule in un lato di ciascuna lingua per creare una massa bulbosa al centro della lingua.

Iniettare nei topi 2,1 milligrammi per chilogrammo di yohimbina e riposizionarli sul tappetino riscaldante per monitorarli durante il recupero dall'anestesia. Posizionare i topi in gabbie sterili contenenti una dieta morbida a base di pasta transgenica. Pesare i topi ogni due o tre giorni e monitorarli visivamente per la comparsa di tumori.

Per preparare le lingue di topo per l'immagine ex vivo, eutanasia i topi che ospitano tumori in diversi punti temporali. Utilizzando l'inalazione di anidride carbonica, estrarre le lingue e risciacquarle con un XPBS. Quindi, utilizzando un filo chirurgico monofilamento proveniente da un negozio locale di hobbistica e un ago da cucito numero otto.

Attaccare la lingua a un lato di una comune cassetta per inclusione di tessuti in paraffina. Una volta immobilizzata la lingua, immergere l'intero assieme della cassetta in un XPBS. Procedere immediatamente con l'elaborazione delle lingue mediante microscopia a due fotoni per acquisire immagini delle lingue utilizzando la microscopia a due fotoni.

Immergere le cassetto per la lingua in una piastra da 60 millimetri contenente un XPBS. Fissare la piastra in un supporto su misura montato su un braccio a mensola retrattile posizionato sotto l'obiettivo del microscopio a due fotoni. Posizionare un obiettivo ad immersione in acqua da 40 x 0,8 di apertura numerica direttamente su o sopra una lesione tumorale visibile.

Immagina la lingua mediante microscopia a due fotoni con il laser a titanio sapphire con un'intensità di 60 milliwatt e una lunghezza d'onda in ingresso di 755 nanometri. Per ottimizzare il segnale M cherry, acquisisci immagini seriali di scansione laser da un micrometro a profondità incrementali di un micrometro su una profondità totale del tessuto compresa tra 15 e 100 micrometri. Con questa configurazione, è possibile analizzare tumori fino a un millimetro di profondità del tessuto.

Utilizzare Scan Image per acquisire immagini. Scan Image genera un'uscita a due canali di schemi di scansione raster per controllare gli specchi galvanometrici di scansione XY e, allo stesso tempo, acquisisce simultaneamente un segnale in ingresso da un massimo di quattro canali proveniente da tubi fotomoltiplicatori attraverso una scheda di acquisizione dati. Scan Image acquisisce immagini a stack Z controllando l'asse Z dell'obiettivo e raccoglie immagini in lapse temporale in modalità singola o ciclica.

Salvare le immagini in un singolo file TIF con una profondità di 16 bit. Utilizzando il software Amira, rendere gli stack di immagini del tumore in un'unica immagine tridimensionale aprendo il file TIF contenente l'insieme delle immagini dello stack Z. Utilizzare la funzione TEX per generare una rappresentazione tridimensionale.

Un'immagine di un tumore primario di grandi dimensioni con diversi gruppi invasivi più piccoli e dissociati, o GIs, sarà probabilmente presente nell'immagine renderizzata. Per misurare il volume del tumore, definire la soglia dell'area del tumore primario e correggere ogni sezione della pila di immagini per eliminare la fluorescenza di fondo. Ripetere la procedura di impostazione della soglia per ciascun gruppo invasivo.

Dopo aver selezionato il tumore primario e tutti i GIS, determinare la misura del volume nonché le coordinate OID X, Y e Z del tumore primario. Per calcolare le distanze dei GIS dal punto centrale del tumore, calcolare l'indice invasivo del tumore o TI utilizzando la formula TI = N NT × VT × dt, dove NT corrisponde al numero totale di GIS nell'immagine, VT corrisponde al volume totale di tutti i GIS e DT corrisponde alla distanza totale percorsa da tutti i gruppi invasivi dal centro del tumore primario.

È possibile generare rappresentazioni tridimensionali con un maggiore dettaglio topografico importando i file originali in bianco e nero a 16 bit delle punte nel software Nikon NIS Elements. Creare un file ND da un insieme di immagini. Successivamente, calibrare manualmente il documento per specificare la dimensione del pixel al fine di ottenere rappresentazioni di qualità superiore.

Aggiungere ulteriori sezioni nel piano Z. Questa figura mostra un esempio dei dati grezzi acquisiti da un'immagine a due fotoni con NIS elements o uno specchio. Un software può essere utilizzato per ricostruire i dati grezzi dei tumori della lingua, come mostrato in questa figura.

Questo pannello mostra un esempio di rendering tridimensionale utilizzando la funzione TEX nel software Amira. Qui è riportato un esempio di sogliatura di una singola sezione a due fotoni proveniente dallo stack di immagini, per identificare i gruppi invasivi derivanti dal tumore primario, nonché il centro o l'oido del tumore primario. Dopo che ogni sezione sogliata viene analizzata, Amira quantifica il volume e la distanza percorsa da ciascun gruppo invasivo rispetto al Centro.

Questi dati possono essere rappresentati graficamente e utilizzati per ottenere il valore numerico del livello completo di invasione delle cellule tumorali. A attribuibili al sito primario mostrate qui sono immagini rappresentative di tumori visualizzati mediante etichettatura immunohistochimica patologica convenzionale, confrontate con un'immagine tridimensionale di un tumore simile ottenuta utilizzando il protocollo descritto. Una volta acquisita padronanza, dal punto dell'estrazione della lingua fino alla renderizzazione finale in 3D, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore se correttamente effettuata. Durante l'esecuzione di questa procedura, prestare attenzione a non perforare la lingua con l'ago, perdendo così le cellule tumorali e ostacolando l'attecchimento del tumore. Successivamente a questa procedura, possono essere effettuati test su composti terapeutici o su cellule con livelli proteici modificati al fine di determinarne l'efficacia sull'invasione del cancro orale.

In un contesto in vivo, non dimenticare che lavorare con cellule tumorali umane modificate con lentivirus è pericoloso; precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale adeguati e il lavoro all'interno di una cappa a flusso laminare certificata BSL 2 devono essere sempre adottate quando si lavora con topi iniettati.