Imaging Multimodale e la piattaforma Microendoscopy Spettroscopia Fiber-fascio per non invasiva,

L'obiettivo generale di questa procedura è la caratterizzazione funzionale di tessuti in vivo combinando informazioni strutturali ad alta risoluzione con dati spettrali quantitativi. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, come la quantificazione degli effetti della terapia sulla microstruttura e sulla perfusione dei tessuti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che una singola sonda può essere utilizzata per raccogliere contemporaneamente dati di imaging e di spettroscopia dalla stessa posizione.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro gastrointestinale poiché la sonda è compatibile con le tecniche endoscopiche convenzionali. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché piccole irregolarità nel posizionamento della sonda possono influenzare significativamente l'accuratezza dei dati. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo compreso l'importanza di combinare una tecnica di imaging ad alta risoluzione con un metodo spettroscopico quantitativo.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di preparazione sono difficili da apprendere a causa della complessità sia della costruzione che della calibrazione. Per iniziare ad assemblare la modalità di microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione del microendoscopio multimodale, montare uno specchio dicromatico da 470 nanometri in un cubo per sistema a gabbia da 30 millimetri. Fissare le aste di assemblaggio della gabbia ai lati anteriore, destro e sinistro del cubo.

Collegare un anello di ritenzione senza sollecitazioni a una piastra per cage filettata e avvitare un tubo obiettivo nell'anello di ritenzione. Collegare un'altra piastra per cage al tubo obiettivo, allineandola con la prima piastra per cage. Successivamente, fissare uno specchio in alluminio con rivestimento ottimizzato per UV in un supporto per specchio ad angolo retto.

Collegare quattro aste alla parte anteriore del supporto dello specchio e due aste in diagonale al lato destro del supporto. Inserire l'insieme del tubo della lente nel lato sinistro del cubo per sistema di cage. Collegare il lato destro dell'insieme del supporto dello specchio all'insieme del tubo della lente.

Fare scorrere un supporto di traslazione sull'asse Z sul lato destro dell'assemblaggio. Collegare una lente obiettiva acromatica 10x al supporto di traslazione. Successivamente, fissare una piastra adattatrice per fibra a un supporto per lenti di traslazione sugli assi XY.

Fare scorrere il supporto sull'assemblaggio davanti all'obiettivo. Utilizzando anelli di ritenzione, fissare un filtro di eccitazione e un filtro di emissione appropriati nei tubi delle lenti. Avvitare il tubo della lente del filtro di eccitazione sulla parte anteriore del cubo per cage.

E inserire il tubo della lente del filtro di emissione nella parte anteriore del supporto a specchio ad angolo retto. Utilizzando una resina epossidica, fissare un LED da 455 nanometri alla piastra della gabbia, davanti al filtro di eccitazione. Inserire una piastra della gabbia davanti a ciascun tubo della lente del filtro.

Utilizzando un anello di ritenzione, fissare una lente tubolare acromatica in un altro tubo per lenti in modo che la freccia situata all'esterno della lente sia rivolta verso il lato filettato esternamente del tubo per lenti. Collegare la lente tubolare alla piastra della gabbia di sinistra, quindi posizionare un'altra piastra della gabbia davanti alla lente tubolare. Utilizzando un anello di ritenzione privo di tensioni, collegare una fotocamera monocromatica USB alla piastra della gabbia.

Per iniziare l'assemblaggio della modalità di spettroscopia di riflessione subdiffusa, fissare una piastra filettata per gabbia alla parte anteriore di una sorgente luminosa alogena al tungsteno utilizzando una resina epossidica. Inserire quattro aste per l'assemblaggio della gabbia nella piastra della gabbia e far scorrere un supporto di traslazione sull'asse Z sulle aste. Avvitare una lente obiettiva acromatica 20x sul supporto di traslazione sull'asse Z.

Collegare una piastra adattatrice per fibra a un supporto di traslazione lungo gli assi XY e far scorrere il supporto sull'insieme davanti all'obiettivo. Infine, fissare entrambi gli insiemi su un tavolo ottico in prossimità l'uno dell'altro utilizzando dispositivi di montaggio appropriati. Per iniziare la costruzione del dispositivo di commutazione per la separazione tra sorgente e rivelatore, avvitare una piastra adattatrice per fibra SMA con filettatura esterna su un braccio motore in alluminio.

Collegare un adattatore del braccio del motore sul retro del braccio del motore. Quindi, avvitare un motore passo-passo in un alloggiamento del motore in alluminio. Avvitare l'insieme del braccio del motore sulla barra del motore e serrare la vite di bloccaggio.

Successivamente, avvitare tre piastre adattatrici per fibra a un interruttore ottico, quindi avvitare la piastra frontale sull'interruttore ottico. Far passare la barra del motore passo-passo attraverso il foro centrale dell'interruttore ottico. Posizionare un driver del motore passo-passo lungo la linea centrale di una basetta rossa senza saldature.

Collegare il driver a un'adeguata alimentazione e al motore passo-passo. Fissare l'interruttore ottico al tavolo ottico. Collegare un cavo patch da 550 micrometri 0,22 na al braccio del motore.

Collegare l'altra estremità a uno spettrometro USB. Per collegare la sonda in fibra ottica, fissare il cavo in fibra immagine centrale da 1 millimetro all'assise della modalità di microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione. Collegare il cavo multimodale sinistro da 200 micrometri all'assise della modalità di spettroscopia di riflessione subdiffusa.

Proseguendo da sinistra, collegare i restanti cavi multimodali in ordine agli adattatori sinistro, centrale e destro del dispositivo di commutazione ottica. Per iniziare la calibrazione dell'esperimento, collegare tutti i dispositivi USB al computer. Accendere tutti gli strumenti e assicurarsi che lo scatto della lampada alogena al tungsteno sia aperto.

Quindi, spegnere le luci della stanza e chiudere altre fonti di luce ambientale. Aprire il software di acquisizione dati. Attendere che l'equipaggiamento funzioni per 30 minuti prima di procedere alla calibrazione.

Posizionare uno standard di riflessione diffusa al 20% nella sezione inferiore del dispositivo di calibrazione. Inserire la sonda a fibra ottica nella fessura di sinistra del dispositivo e impostare l'interruttore ottico motorizzato su sinistra per selezionare il valore di 374 micrometri come impostazione DS. Nel software, impostare il tempo di integrazione a 500 millisecondi.

Quindi, fare clic su "acquisisci spettro" per iniziare l'acquisizione di RMAX per questo SDS. Al termine dell'acquisizione di RMAX, salvare lo spettro in una cartella designata. Chiudere lo sportello della lampada alogena al tungsteno e acquisire lo spettro scuro R per questo SDS.

Aprire l'otturatore, spostare la sonda nello slot destro del dispositivo di calibrazione e impostare l'interruttore ottico motorizzato sulla posizione centrale per l'impostazione SDS da 730 micrometri. Acquisire RMAX e RDARK per questo SDS per completare la calibrazione. Innanzitutto, determinare l'area cutanea appropriata per la raccolta dei dati.

Utilizzando un evidenziatore giallo come fonte di piranina, colorare leggermente l'area scelta. Per iniziare la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione, accendere il LED a 455 nanometri e chiudere lo scatto della lampada alogena al tungsteno. Posizionare la sonda a fibra ottica a contatto delicato con la pelle.

Spostare la sonda sul tessuto colorato con Piranina per visualizzare l'architettura della corrente apicale. Nel software, impostare un tempo di esposizione e un guadagno appropriati per evitare la saturazione dell'immagine. Quindi, fare clic su acquisisci immagine per ottenere un'immagine statica.

Mantenere la sonda in posizione per la spettroscopia di riflettanza subdiffusa. Spegnere il LED da 455 nanometri e aprire lo scatto della lampada alogena al tungsteno. Quindi, passare all'impostazione SDS da 374 micrometri a sinistra.

Fare clic su acquisisci spettri per ottenere lo spettro R-tessuto per questo SDS. Quindi, passare alla posizione centrale e acquisire lo spettro R-tessuto del SDS a 730 micrometri. Aprire il software di post-elaborazione e fare clic su esegui.

Quando richiesto, selezionare gli spettri di calibrazione, gli spettri in vivo e l'immagine fluorescente ad alta risoluzione per ottenere l'immagine del tessuto. La modalità di microscopia fluorescente ad alta risoluzione fornisce un'immagine ad alta risoluzione a fuoco del sito del tessuto. La colorazione con piranina mostra i contorni individuali dei cheratinociti.

Il software di post-elaborazione utilizza i dati della spettroscopia di riflettanza subdiffusa per calcolare la concentrazione di emoglobina, la concentrazione di melanina e la saturazione tissutale di ossigeno. Un neo melanocitico benigno è stato confrontato con il tessuto cutaneo normale adiacente mediante questo endoscopio micro-multimodale. Il neo melanocitico ha mostrato una concentrazione di emoglobina leggermente inferiore e una concentrazione di melanina leggermente aumentata rispetto al tessuto normale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lasciare che la lampada alogena al tungsteno si riscaldi per 15 minuti e che lo strumento venga calibrato con uno standard di riflettanza prima della raccolta dei dati. Dopo questa procedura, altre tecniche come la microscopia confocale o la microscopia a multiphoton possono essere utilizzate per esplorare i cambiamenti subcellulari nella struttura proteica o nel metabolismo.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare la relazione tra perfusione tissutale e microstruttura in risposta alla chemioterapia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire e utilizzare un dispositivo ibrido per imaging micro-endoscopico e spettroscopia.