Imaging Multimodale e la piattaforma Microendoscopy Spettroscopia Fiber-fascio per non invasiva, In Vivo Analisi dei tessuti

L'obiettivo generale di questa procedura è la caratterizzazione funzionale di tessuti in vivo combinando informazioni strutturali ad alta risoluzione con dati spettrali quantitativi. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo della biologia del cancro, come la quantificazione degli effetti della terapia sulla microstruttura e sulla perfusione dei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che una singola sonda può essere utilizzata per raccogliere sia i dati di immagine che quelli di spettroscopia dalla stessa posizione.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro gastrointestinale perché la sonda è compatibile con le tecniche endoscopiche convenzionali. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché piccole irregolarità nel posizionamento della sonda possono influire in modo significativo sull'accuratezza dei dati. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto dell'importanza di combinare una tecnica di imaging ad alta risoluzione con un metodo di spettroscopia quantitativa.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione sono difficili da apprendere a causa della complessità sia della costruzione che della calibrazione. Per iniziare ad assemblare la modalità di microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione del microendoscopio multimodale, montare uno specchio dicroico da 470 nanometri in un cubo a gabbia da 30 millimetri. Fissare le aste di montaggio della gabbia ai lati anteriore, destro e sinistro del cubo della gabbia.

Fissare un anello di ritegno senza sollecitazioni a una piastra a gabbia filettata e avvitare un tubo dell'obiettivo nell'anello di ritegno. Fissare un'altra piastra a gabbia al tubo dell'obiettivo allineato con la prima piastra a gabbia. Quindi, fissa uno specchio in alluminio potenziato dai raggi UV in un supporto per specchio ad angolo retto.

Fissare quattro aste alla parte anteriore del supporto dello specchio e due aste in diagonale al lato destro del supporto. Far scorrere il gruppo del tubo dell'obiettivo sul lato sinistro del cubo della gabbia. Collegare il lato destro del gruppo di montaggio dello specchio al gruppo del tubo dell'obiettivo.

Far scorrere un supporto di traslazione dell'asse Z sul lato destro dell'assieme. Collegare un obiettivo acromatico 10x alla montatura di traslazione. Quindi, fissare una piastra adattatore in fibra a un attacco dell'obiettivo di traslazione dell'asse XY.

Far scorrere la montatura sul gruppo davanti alla lente dell'obiettivo. Utilizzando gli anelli di sicurezza, fissare un filtro di eccitazione e un filtro di emissione appropriati nei tubi dell'obiettivo. Avvitare il tubo della lente del filtro di eccitazione nella parte anteriore del cubo a gabbia.

E il tubo dell'obiettivo del filtro di emissione nella parte anteriore dell'attacco dello specchio ad angolo retto. Utilizzando la resina epossidica, collegare un LED a 455 nanometri alla piastra della gabbia davanti al filtro di eccitazione. Far scorrere una piastra a gabbia davanti a ciascun tubo della lente del filtro.

Utilizzando un anello di sicurezza, fissare una lente del tubo doppietto acromatico in un altro tubo dell'obiettivo in modo che la freccia all'esterno dell'obiettivo sia rivolta verso il lato filettato esternamente del tubo dell'obiettivo. Fissare la lente del tubo alla piastra della gabbia sinistra, posizionare un'altra piastra della gabbia davanti alla lente del tubo. Utilizzando un anello di sicurezza senza tensioni, collegare una fotocamera monocromatica USB alla piastra della gabbia.

Per iniziare ad assemblare la modalità di spettroscopia di riflessione sub-diffusa, collegare una piastra a gabbia filettata alla parte anteriore di una sorgente luminosa alogena al tungsteno con resina epossidica. Inserire quattro aste di montaggio della gabbia nella piastra della gabbia e far scorrere un supporto di traslazione dell'asse Z sulle aste. Avvitare una lente dell'obiettivo acromatica 20x nella montatura di traslazione dell'asse Z.

Collegare una piastra adattatore in fibra a una montatura di traslazione dell'asse XY e far scorrere la montatura sul gruppo davanti alla lente dell'obiettivo. Infine, fissare entrambi i gruppi a un tavolo ottico vicino tra loro utilizzando dispositivi di montaggio appropriati. Per iniziare a costruire il dispositivo di commutazione di separazione del rivelatore di sorgente, avvitare una piastra adattatore in fibra SMA filettata esternamente in un braccio motore in alluminio.

Collegare un adattatore per il braccio del motore alla parte posteriore del braccio del motore. Quindi, avvitare un motore passo-passo in un alloggiamento del motore in alluminio. Avvitare il gruppo del braccio del motore sull'asta del motore e serrare la vite di bloccaggio.

Quindi, avvitare tre piastre di adattamento in fibra in un interruttore ottico, quindi avvitare la piastra frontale sull'interruttore ottico. Infilare l'asta del motore passo-passo attraverso il foro centrale dell'interruttore ottico. Posiziona un driver per motori passo-passo sulla linea centrale di un tabellone rosso senza sodder.

Collegare il driver a un'alimentazione appropriata e al motore passo-passo. Fissare l'interruttore ottico al tavolo ottico. Collegare un cavo patch da 550 micrometri 0,22 na al braccio del motore.

Collegare l'altra estremità a uno spettrometro USB. Per collegare la sonda in fibra ottica, collegare il cavo centrale in fibra ottica da 1 millimetro al gruppo di microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione. Collegare il cavo multimodale sinistro da 200 micrometri al gruppo della modalità di spettroscopia di riflessione sub-diffusa.

Continuando da sinistra, collegare i cavi multimodali rimanenti agli adattatori sinistro, centrale e destro del dispositivo di commutazione ottica. Per iniziare la calibrazione per l'esperimento, collegare tutte le periferiche USB al computer. Accendere tutta la strumentazione e assicurarsi che l'otturatore della lampada alogena al tungsteno sia aperto.

Quindi, spegni le luci della stanza e chiudi le altre fonti di luce ambientale. Aprire il software di acquisizione dati. Lasciare in funzione l'apparecchiatura per 30 minuti prima di procedere alla calibrazione.

Posizionare uno standard a riflessione diffusa al 20% nella sezione inferiore del dispositivo di calibrazione. Inserire la sonda in fibra ottica nello slot sinistro del dispositivo e posizionare l'interruttore ottico motorizzato su sinistra per selezionare il 374 micrometro come impostazione DS. Nel software, impostare il tempo di integrazione su 500 millisecondi.

Quindi, fare clic su acquisisci spettro per iniziare l'acquisizione di RMAX per questa SDS. Al termine dell'acquisizione di RMAX, salvare lo spettro in una cartella designata. Chiudere l'otturatore della lampada alogena al tungsteno e acquisire lo spettro scuro R per questa SDS.

Aprire l'otturatore, spostare la sonda nella fessura destra del dispositivo di calibrazione e impostare l'interruttore ottico motorizzato in posizione centrale per l'impostazione SDS a 730 micrometri. Acquisisci RMAX e RDARK per questa SDS per completare la calibrazione. Innanzitutto, determinare l'area cutanea appropriata per la raccolta dei dati.

Usando un illuminante giallo come fonte di piranina, colora leggermente l'area scelta. Per iniziare la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione, accendere il LED a 455 nanometri e chiudere l'otturatore della lampada alogena al tungsteno. Posizionare la sonda a fibre ottiche a contatto delicato con la pelle.

Spostare la sonda attraverso il tessuto colorato con piranina per visualizzare l'architettura apicale dell'intuizione della corrente. Nel software impostare un tempo di esposizione e un guadagno appropriati per evitare la saturazione dell'immagine. Quindi, fare clic su acquisisci immagine per ottenere un'immagine statica.

Mantenere la sonda in posizione per la spettroscopia di riflettanza sub-diffusa. Spegnere il LED a 455 nanometri e aprire l'otturatore della lampada alogena al tungsteno. Quindi, passa all'impostazione SDS a 374 micrometri a sinistra.

Fare clic su acquisisci spettri per acquisire lo spettro del tessuto R per questa SDS. Quindi, passare alla posizione centrale e acquisire lo spettro del tessuto R SDS da 730 micrometri. Apri il software di post-elaborazione e fai clic su Esegui.

Quando richiesto, selezionare gli spettri di calibrazione, gli spettri in vivo e l'immagine a fluorescenza ad alta risoluzione per ottenere l'immagine del tessuto. La modalità di microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione fornisce un'immagine a fuoco ad alta risoluzione del sito tissutale. La colorazione con piranina mostra i contorni individuali dei cheratinociti.

Il software di post-elaborazione utilizza i dati della spettroscopia di riflettanza sub-diffusa per calcolare la concentrazione di emoglobina, la concentrazione di melanina e la saturazione di ossigeno nei tessuti. Un nevo melanocitico benigno è stato confrontato con il tessuto cutaneo normale adiacente utilizzando questo microendoscopio multimodale. Il nevo melanocitico mostrava una concentrazione di emoglobina leggermente inferiore e una concentrazione di melanina leggermente elevata rispetto al tessuto normale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lasciare che la lampada alogena al tungsteno si riscaldi per 15 minuti e calibrare la strumentazione con uno standard di riflettanza prima della raccolta dei dati. Seguendo questa procedura, altre tecniche come la microscopia confocale o la microscopia multifotone possono essere utilizzate per esplorare i cambiamenti subcellulari nella struttura o nel metabolismo delle proteine.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare la relazione tra perfusione tissutale e microstruttura in risposta alla chemioterapia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire e utilizzare un dispositivo ibrido di imaging micro endoscopico e spettroscopia.