Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila

Al fine di eseguire le ricostruzioni degli organi in via di sviluppo all'interno della Drosophila melanogaster, abbiamo bisogno di determinare il modello in avanti che meglio descrive la propagazione della luce all'interno della pupa stessa. La procedura inizia con la selezione di una pre pupa bianca e l'incollaggio all'estremità di un tubo capillare in modo tale che l'asse anteriore posteriore del poppa sia orientato parallelamente al tubo. Un piccolo tubo capillare viene riempito con del colorante fluorescente e inserito nel corpo pupillare.

Dopo un'attenta regolazione dell'asse, la pupa viene ruotata di 360 gradi. Le immagini vengono acquisite da diverse angolazioni. I dati di trans illuminazione fluorescente acquisiti vengono utilizzati per determinare il modello diretto che verrà utilizzato per l'imaging dello sviluppo degli organi.

Ciao, mi chiamo Claudia e sono al Center for Assistance Biology del Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Sono Ula Petou del Paramount Lab della Harvard Medical School e Daniel Rozanski dell'Institute for Biological and Medical Imaging dell'Università Tecnica di Monaco e dell'Heliman Center di Monaco. Oggi vi mostreremo una procedura per la ricostruzione tridimensionale di tutto il corpo in Oph Melano Casta.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per la visualizzazione in vivo degli organi in via di sviluppo durante lo stato pupillare. Quindi iniziamo Prima di iniziare. Si prega di notare che non c'è un video di accompagnamento che dovrebbe essere visto prima di questo, in cui alcuni aspetti tecnici della tomografia a proiezione ottica sono spiegati in modo più dettagliato di quanto non lo siano qui.

Inoltre, l'altro video spiega l'imaging di tessuti o organi preparati di animali più grandi. Per tutti gli esperimenti trattati in questo video, verranno utilizzati i transgeni della drosophila forgiata. Sono EL A gal four espresso nelle ghiandole salivari, apteris gal four, che è espresso nei tessuti precursori larvali dell'ala adulta e del torace, il transgene che produce la proteina fluorescente.

In risposta alle quattro galle chiamate U-A-S-G-F-P e 1118 bianche, i maschi di controllo non fluorescenti portatori dei transgeni UAS vengono incrociati con femmine vergini portatrici dei quattro transgeni GAL per ottenere il tessuto. L'espressione specifica degli incroci GFP viene impostata da 8 a 10 femmine e maschi vergini su terreni di coltura standard con una spolverata di lievito di birra. Sulla superficie, le fiale sono alloggiate a 25 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata con un ciclo di buio e luce di 12 ore.

Due giorni dopo l'inizio della croce, i genitori vengono trasferiti in una fiala nuova e cinque o sei giorni dopo, PUI inizierà a popolare la fiala bianca PrepU. Sono stato selezionato per l'espressione GFP in un cannocchiale da dissezione fluorescente. La selezione del pre pui bianco garantisce una corretta messa in scena degli animali poiché rimangono bianchi per circa un'ora.

Dopo la pupillazione, diventano pigmentati o brunastro. I pui che esprimono GFP vengono raccolti delicatamente dalle fiale utilizzando un pennello bagnato e posti in una goccia d'acqua o PBS in una capsula di Petri, l'acquisto deve essere pulito dai materiali autofluorescenti. Usando il pennello, ora dovrebbero essere pronti per l'imaging tomografico.

Se il PrepU Ho bisogno di continuare l'invecchiamento per arrivare alla corretta fase di sviluppo, possono essere lasciati in una capsula di Petri con un tovagliolo di carta bagnato o in una fiala di cibo pulito. Ciò garantirà un'umidità sufficiente e uno sviluppo adeguato per l'imaging. Il PrepU deve essere fatto aderire all'interno di un tubo capillare di vetro di 800 micron di diametro.

Dipingi l'estremità posteriore della pupilla con la super colla, orienta la superficie incollata della pre pupa nel tubo in modo tale che l'accesso posteriore anteriore della mosca sia parallelo al tubo. La parte anteriore dell'animale sporgerà dal tubo capillare. Il tubo capillare è ora fissato al tavolino di rotazione del microscopio.

In posizione verticale, regolare l'asse di rotazione del tavolino di rotazione in modo che l'asse di rotazione del tubo sia parallelo alle colonne di pixel del CCD di imaging. Con la posizione della mosca modificata, procedere con l'imaging. In questo esempio, gli animali con ghiandole salivari fluorescenti devono essere sottoposti a imaging per oph che esprimono GFP nelle loro ghiandole salivari può essere generato da un incrocio tra gli stock EAG four e U-A-S-G-F-P.

Iniziamo con una pre pupa montata, illuminiamo la pre pupa con un fascio di eccitazione e raccogliamo il segnale fluorescente GFP. Nella transilluminazione, ruotare la PrepU di 360 gradi lungo il suo asse verticale e acquisire le immagini di transilluminazione. Ogni immagine corrisponde a 10 gradi di rotazione.

Il tempo totale di acquisizione dipende dalla quantità di fluorescenza e dall'intensità del fascio di eccitazione. I tempi tipici sono dell'ordine di un minuto. In questo esempio, verrà ripresa una pupa DSO che esprime GFP nei dischi immaginali delle ali.

Questa pupa può essere raccolta da una fiala di un incrocio tra Aus GAL four e U-A-S-G-F-P. La pre pupa viene montata come descritto in precedenza. Tuttavia, poiché il tempo di imaging per questo esperimento è di circa otto ore, è fondamentale che l'ambiente rimanga umido e a temperatura ambiente Per evitare la disidratazione e la morte dell'animale, viene posizionato un otturatore sopra il raggio di eccitazione per impedire l'estinzione dei quattro fiori nel tessuto di interesse, nonché per garantire che l'animale non venga bruciato dal raggio laser come prima, illuminare con il fascio di eccitazione e raccogliere il segnale fluorescente GFP mediante trans illuminazione.

La pre pupa è completamente ruotata lungo il suo asse verticale. Durante la raccolta dei dati, la rotazione dura solo un minuto e viene ripetuta a intervalli di tempo diversi. Per creare una serie di immagini in time lapse delle ali durante lo sviluppo, i dati possono essere acquisiti per almeno sei ore ad una velocità di 100 immagini all'ora.

È fondamentale che l'esposizione totale alla luce sia controllata con questo otturatore per evitare danni o sbiancamento delle foto. Questo filmato mostra le immagini acquisite tra la fase PrepU e l'avversione della testa della pupilla. Quando si ricostruisce l'immagine tridimensionale, c'è una forte dispersione in avanti che deve essere presa in considerazione, che non può essere approssimata dalla diffusione.

Quindi, per fare la ricostruzione è necessario determinare un modello di diffusione diretta della propagazione della luce. Per semplicità, trascuriamo l'assorbimento. La quantità di scattering viene testata sperimentalmente. Per fare ciò, un oggetto estraneo con fluorescenza standardizzata viene inserito nella pre pupa bianca non fluorescente 1118, che viene quindi scansionata per generare i dati del modello diretto che iniziano riempiendo un tubo capillare di silice da 100 micron con colorante fluorescente PS 5.5.

Utilizzando l'azione capillare, spingere il tubo capillare nella pupa con un angolo di 45 gradi rispetto all'asse anteriore, montare il PrepU in un tubo capillare e posizionarlo in modo appropriato sul tavolino rotante come descritto in precedenza. Ora illumina la pre pupa con un raggio laser di eccitazione con una lente a bassa apertura numerica e raccogli immagini fluorescenti di trans illuminazione della pre pupa. Come descritto in precedenza, il software MATLAB viene utilizzato per inserire i dati nel modello teorico esplicito in avanti. Per facilitare il processo di ricostruzione, viene selezionata l'approssimazione e dell'equazione di trasporto, che descrive il regime di scattering in avanti e si adatta anche ai dati sperimentali.

Dopo aver determinato il corretto modello in avanti, possiamo ricostruire le ghiandole salivari e ottenere le ricostruzioni tomografiche in time lapse. Se si prevede di utilizzare una tomografia dello spazio libero, è possibile impostare anche algoritmi di configurazione per la corrispondenza dell'indice. In primo luogo, mostriamo una ricostruzione 3D delle ghiandole salivari all'inizio dello sviluppo.

Per confronto, la colorazione istologica delle ghiandole salivari mostra che le ricostruzioni si correlano bene con l'istologia. Questo filmato in time lapse dello sviluppo dei dischi immaginali alari è stato acquisito da un singolo esemplare vivo. Per confronto, la colorazione istologica del disco alare negli stessi punti temporali mostra che le ricostruzioni si correlano bene con l'istologia.

Vi abbiamo appena mostrato come costruire un sistema per l'imaging di strutture tridimensionali all'interno di oph in vivo e nel tempo. Questo permette di seguirci, la morfogenesi in Drosophila, e di seguire lo sviluppo delle ali per sei ore consecutive. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale scegliere il modello in avanti corretto per la propagazione della luce all'interno della drosofila.

Questo metodo può essere utilizzato in combinazione con tecniche istologiche per far luce sullo sviluppo degli organi durante le fasi della pupilla oph e può essere modificato per lo studio di diversi organismi di dimensioni simili. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.