Sequenziamento degli ampliconi con le tecnologie di sequenziamento a lettura lunga
29 agosto 2025
Questo protocollo è stato ottimizzato per il sequenziamento profondo mirato di 18 regioni di resistenza ai farmaci in Mycobacterium tuberculosis utilizzando una piattaforma di sequenziamento a lettura lunga, seguita dall'analisi con una pipeline bioinformatica specifica per la tubercolosi progettata per dati a lettura lunga.
Indago se il sequenziamento portatile a lettura lunga possa fornire risultati di suscettibilità alla TB resistenti ai farmaci in contesti con risorse limitate con un'accuratezza paragonabile al metodo gold standard, promuovendo diagnostiche della tubercolosi accessibili e di alta qualità. Utilizzare sequenziamento mirato di nuova generazione come strumento diagnostico per la tubercolosi resistente ai farmaci, offrendo un profilo di resistenza completo direttamente da campioni clinici senza competenze in bioinformatica. Il nostro protocollo che utilizza sequenziamento a lettura lunga ha il potenziale di fornire tempi di risposta più rapidi, flussi di lavoro più semplici rispetto al rilevamento della resistenza in tempo reale, facilitando diagnostiche complete della TB e migliorando il tracciamento degli epidemii in ambienti con risorse limitate e infrastrutture minime.
Per cominciare, calcola 100 nanogrammi di ogni campione di amplicon in base alla concentrazione e trasferisci il volume richiesto in un tubo PCR pulito. Per determinare la massa totale degli ampliconi nel campione, si utilizza la formula fornita. Regolare il volume totale di ogni campione a 12,5 microlitri usando acqua priva di nucleasi.
Mescola delicatamente i campioni pipettandoli su e giù 10 volte e fatti girare brevemente in una microcentrifuga. Successivamente, aggiungere 1,75 microlitri di buffer di riparazione finale e reazione di adenilazione a ciascun campione, seguiti da 0,75 microlitri di miscela enzimatica per riparazione finale e adenilazione. Dopo aver miscelato e girato i campioni, posizionare i tubi in un termociclatore a 25 gradi Celsius per 30 minuti, seguiti da 65 gradi Celsius per 30 minuti.
Per la legazione nativa con codici a barre, aggiungi i componenti mostrati sullo schermo in nuovi tubi PCR. Mescola delicatamente le reazioni pipettando e centrifuga brevemente usando una microcentrifuga. Poi, aggiungi un microlitro di EDTA a ogni provetta.
Poi, mescola bene e gira brevemente come mostrato prima. Tira i campioni con codice a barre in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Vortice le perline di pulizia del DNA per risospenderle completamente e aggiungere un volume pari a 0,7 volte il volume del campione aggregato.
Mescola la soluzione per campioni di sfera e incubala su un HulaMixer a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, per preparare due millilitri di etanolo all'80%, mescolare 1.600 microlitri di etanolo puro con 400 microlitri di acqua priva di nucleasi. Posiziona il tubo su un rack magnetico per cinque minuti finché l'eluato non appare chiaro e incolore.
Poi, rimuovi e scarta il soprandanante senza disturbare il pellet. Lava le perline con 700 microlitri di etanolo all'80% appena preparato e centrifuga brevemente il tubo. Dopo aver posizionato il tubo sul rack magnetico, rimuovere l'etanolo residuo.
Ora, togli il tubo dal rack magnetico. Risospendere le sfere in 35 microlitri di acqua priva di nucleasi con un leggero colpo e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Riportare il tubo nel rack magnetico finché l'eluato non diventa chiaro e incolore.
Successivamente, trasferire 35 microlitri dell'eluato in un tubo pulito da 1,5 millilitri per microcentrifuga per un ulteriore utilizzo. Per la ligatura degli adattatori, miscela i componenti in un tubo microcentrifuga a basso legame da 1,5 millilitri. Centrifuga brevemente il tubo e incuba a temperatura ambiente per 20 minuti.
Vortice le perline di pulizia del DNA per risospenderle completamente. Aggiungi 20 microlitri di perline al tubo e mescola delicatamente. Incubare su un HulaMixer per 10 minuti a temperatura ambiente.
Poi, posiziona il tubo su una griglia magnetica per far sparire le palline e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungi 125 microlitri di tampone a frammenti brevi e muovi delicatamente il tubo per sospendere le sfere. Centrifuga brevemente e riporta il tubo al rack magnetico.
Aspira nuovamente il sovrantantante dopo che le perline si sono riformate in pellet. Ora, rimuovi il tubo dal rack magnetico e risostieni le sfere in 15 microlitri di tampone di eluzione con una pipetta o un flick delicato. Centrifuga brevemente il tubo per raccogliere il contenuto, poi incubarlo a 37 gradi Celsius per 10 minuti per eluire il DNA.
Posiziona il tubo su un rack magnetico finché l'eluato non è chiaro e incolore. Poi, aspira 15 microlitri di eluato e trasferiscili in un tubo pulito per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per preparare la soluzione di priming per celle di flusso, si mescola accuratamente i componenti forniti.
Apri la porta di innesco della cella di flusso, aspira circa 20 microlitri di tampone per rimuovere le bolle d'aria e carica 800 microlitri della miscela di innesco nella porta senza introdurre bolle d'aria. Per preparare la libreria di DNA, miscela accuratamente i componenti mostrati sullo schermo. Solleva delicatamente il tappo della porta campione della cella di flusso, carica 200 microlitri di miscela per la prima senza introdurre bolle d'aria.
Dopo aver miscelato la libreria di DNA preparata, carica 75 microlitri della libreria goccia a goccia nella porta del campione della cella di flusso di sequenziamento. Chiudi il tappo della porta campione della cella di flusso, assicurandoti che il tappo entri saldamente nella porta del campione, e poi chiudi saldamente la porta di innesco. L'elettroforesi su gel ha confermato l'integrità dell'amplicon in quasi tutti i campioni, ma le corsie corrispondenti ai campioni 89 e 136 mostravano bande deboli o assenti.
I campioni 89 e 136 avevano concentrazioni di amplicon insufficienti, portando alla loro esclusione dalla sequenza a lettura lunga. In tutti i geni target, le piattaforme a lettura lunga e breve hanno raggiunto profondità di copertura elevate, con il gene EIS che ha mostrato i valori medi più alti e il gene RRS le profondità di copertura più basse. Nonostante la gamma di profondità di copertura, entrambe le piattaforme hanno mantenuto un'ampia copertura del 99,9% su tutti i geni associati alla resistenza.
Varianti di resistenza ai farmaci per etambutolo, fluorochinoloni, kanamicina, amikacina e capreomicina sono state rilevate con concordanza del 100% tra piattaforme di sequenziamento a lettura corta e lunga. Non sono state trovate mutazioni associate alla resistenza per linezolide, bedaquilina e clofazimina utilizzando entrambi gli approcci di sequenziamento. La rilevazione della resistenza alla streptomicina ha mostrato una concordanza inferiore tra le piattaforme, con solo il 71,43% di accordo.
La sensibilità di rilevamento per geni chiave rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA e pncA variava dall'89,47% al 96,77% tra le piattaforme.
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Panoramica
Questo studio analizza l'uso del sequenziamento portatile a lettura lunga per determinare la suscettibilità della tubercolosi (TB) resistente ai farmaci in contesti con risorse limitate. Il protocollo mira a fornire risultati accurati paragonabili ai metodi standard aurei, migliorando la disponibilità diagnostica per la TB.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Genomica
- Malattie infettive
Sfondo
- La tubercolosi resistente ai farmaci rappresenta una sfida sanitaria globale significativa.
- I metodi diagnostici tradizionali possono presentare limitazioni in contesti con risorse limitate.
- Il sequenziamento a lettura lunga offre potenziali vantaggi in termini di accuratezza e tempi di analisi.
- Le competenze in bioinformatica costituiscono spesso un ostacolo per una diagnostica efficace.
Scopo dello studio
- Valutare l'efficacia del sequenziamento con letture lunghe per la diagnostica della tubercolosi.
- Fornire un profilo completo della resistenza a partire da campioni clinici.
- Semplificare il flusso di lavoro per il rilevamento della resistenza ai farmaci.
Metodi Utilizzati
- Sequenziamento mirato di nuova generazione di 18 regioni di resistenza ai farmaci.
- Utilizzo di una pipeline bioinformatica specifica per la tubercolosi.
- Preparazione del campione che prevede la misurazione precisa degli ampliconi.
- Regolazione dei volumi del campione per ottenere risultati ottimali di sequenziamento.
Risultati principali
- Il sequenziamento con letture lunghe ha dimostrato un'accuratezza paragonabile agli standard aurei.
- Sono stati ottenuti tempi di completamento più rapidi rispetto ai metodi tradizionali.
- Il protocollo ha facilitato una diagnostica completa della tubercolosi.
- Un monitoraggio migliorato delle epidemie è stato possibile in ambienti con risorse limitate.
Conclusioni
- Il sequenziamento portatile con letture lunghe può migliorare la diagnosi della tubercolosi in contesti a risorse limitate.
- Il metodo riduce la necessità di competenze bioinformatiche avanzate.
- Questo approccio ha il potenziale di trasformare le strategie di gestione e controllo della tubercolosi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il sequenziamento portatile di ampliconi con letture lunghe consente un rilevamento rapido e completo delle mutazioni di resistenza ai farmaci nella tubercolosi direttamente dai campioni clinici, colmando importanti lacune diagnostiche in contesti con risorse limitate. Questo approccio supporta una previsione affidabile del profilo di resistenza e accelera l'ottenimento di informazioni utili per la gestione del portafoglio terapeutico nelle malattie infettive. La sua implementazione può ridurre i rischi nelle decisioni diagnostiche precoci ed estendere l'accesso a test molecolari di alta qualità in diverse aree geografiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi diretta di varianti genetiche associate alla resistenza in isolati clinici.
- Consente la validazione funzionale dei meccanismi di resistenza per la definizione delle priorità dei bersagli.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico confermando le associazioni tra varianti e farmaci.
- Migliora l'affidabilità predittiva nella selezione di marcatori di resistenza per lo sviluppo diagnostico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara pannelli di amplificoni validati per flussi di lavoro di screening della resistenza ad alto rendimento.
- Fornisce dati quantitativi sulla frequenza delle varianti per definire le soglie di sensibilità del saggio.
- Permette il rilevamento riproducibile di mutazioni di resistenza ad alta frequenza su diverse piattaforme.
- Consente un'implementazione scalabile del sequenziamento portatile per test decentralizzati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il rilevamento delle varianti di resistenza alle strategie di biomarcatori traslazionali nei programmi per le malattie infettive.
- Garantisce continuità dalla scoperta dei marcatori di resistenza alla validazione preclinica dei saggi diagnostici.
- Fornisce dati aggiustati per il rischio per lo sviluppo di candidati diagnostici mirati alla tubercolosi resistente ai farmaci.
- Supporta il tracciamento delle epidemie e la sorveglianza in contesti di ricerca traslazionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di sequenziamento collega la fase iniziale della scoperta, lo sviluppo del saggio e la ricerca traslazionale, consentendo un profilo rapido e utilizzabile sul campo della resistenza e sostenendo l'avanzamento basato sui dati degli strumenti diagnostici.
- Biologia della scoperta: Conferma i meccanismi di resistenza e le relazioni tra varianti e farmaci in campioni clinici.
- Screening: Fornisce un rilevamento quantitativo e riproducibile delle varianti per l'ottimizzazione dei saggi.
- Analisi: Genera dati con elevata copertura e concordanza intersperimentale per i geni associati alla resistenza.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei biomarcatori e il monitoraggio delle epidemie nei percorsi preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità di sequenziamento portatile e scalabile, adattabile a diversi bersagli di malattie infettive.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nel profilo di resistenza e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Riduce i requisiti infrastrutturali e consente test rapidi e decentralizzati.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avvio o interruzione dello sviluppo e del lancio diagnostico.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio delle risorse diagnostiche per patogeni resistenti ai farmaci.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione degli ampliconi e nell'esecuzione del flusso di lavoro di sequenziamento.
- Necessita dell'accesso a strumentazione portatile per il sequenziamento a lettura lunga e a pipeline di bioinformatica.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i team per la gestione dei campioni e l'analisi dei dati.
- Deve adattare i protocolli alla variabilità della qualità dei campioni e al rendimento degli ampliconi.
- Il rilevamento di varianti a bassa frequenza può essere limitato rispetto alle piattaforme ad alta accuratezza con lettura corta.
