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Sequenziamento degli ampliconi con le tecnologie di sequenziamento a lettura lunga
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JoVE Journal Biochemistry
Amplicon Sequencing using the Long-Read Sequencing Technologies

Sequenziamento degli ampliconi con le tecnologie di sequenziamento a lettura lunga

Full Text
605 Views
08:57 min
August 29, 2025

DOI: 10.3791/68370-v

Morwasehla Modjadji1, Brendon Coenrad Mann1, Johannes Loubser1, Jennifer Williams1, Janré Steyn1, Elizabeth Maria Streicher1, Melanie Grobbelaar1, Robin Mark Warren1

1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences,Stellenbosch University

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Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study investigates the use of portable long-read sequencing for determining drug-resistant tuberculosis (TB) susceptibility in resource-limited settings. The protocol aims to provide accurate results comparable to gold standard methods, enhancing accessible TB diagnostics.

Key Study Components

Area of Science

  • Microbiology
  • Genomics
  • Infectious Diseases

Background

  • Drug-resistant tuberculosis is a significant global health challenge.
  • Traditional diagnostic methods may be limited in resource-poor settings.
  • Long-read sequencing offers potential advantages in accuracy and turnaround time.
  • Bioinformatics expertise is often a barrier to effective diagnostics.

Purpose of Study

  • To evaluate the effectiveness of long-read sequencing for TB diagnostics.
  • To provide a comprehensive resistance profile from clinical samples.
  • To simplify the workflow for drug-resistance detection.

Methods Used

  • Targeted next-generation sequencing of 18 drug-resistance regions.
  • Utilization of a tuberculosis-specific bioinformatics pipeline.
  • Sample preparation involving precise measurement of amplicons.
  • Adjustment of sample volumes for optimal sequencing results.

Main Results

  • Long-read sequencing demonstrated accuracy comparable to gold standards.
  • Quicker turnaround times were achieved compared to traditional methods.
  • The protocol facilitated comprehensive TB diagnostics.
  • Enhanced outbreak tracking was possible in resource-limited environments.

Conclusions

  • Portable long-read sequencing can improve TB diagnostics in low-resource settings.
  • The method reduces the need for extensive bioinformatics expertise.
  • This approach has the potential to transform TB management and control strategies.

Frequently Asked Questions

What is the significance of drug-resistant tuberculosis?
Drug-resistant tuberculosis poses a major public health threat, complicating treatment and control efforts.
How does long-read sequencing compare to traditional methods?
Long-read sequencing offers higher accuracy and faster results, making it suitable for resource-limited settings.
What are the challenges in TB diagnostics?
Challenges include limited access to advanced technologies and the need for specialized bioinformatics skills.
Can this method be used in clinical settings?
Yes, the protocol is designed to be implemented directly from clinical samples.
What are the implications for public health?
Improved diagnostics can lead to better management of TB outbreaks and more effective treatment strategies.

Questo protocollo è stato ottimizzato per il sequenziamento profondo mirato di 18 regioni di resistenza ai farmaci in Mycobacterium tuberculosis utilizzando una piattaforma di sequenziamento a lettura lunga, seguita dall'analisi con una pipeline bioinformatica specifica per la tubercolosi progettata per dati a lettura lunga.

Indago se il sequenziamento portatile a lettura lunga possa fornire risultati di suscettibilità alla TB resistenti ai farmaci in contesti con risorse limitate con un'accuratezza paragonabile al metodo gold standard, promuovendo diagnostiche della tubercolosi accessibili e di alta qualità. Utilizzare sequenziamento mirato di nuova generazione come strumento diagnostico per la tubercolosi resistente ai farmaci, offrendo un profilo di resistenza completo direttamente da campioni clinici senza competenze in bioinformatica. Il nostro protocollo che utilizza sequenziamento a lettura lunga ha il potenziale di fornire tempi di risposta più rapidi, flussi di lavoro più semplici rispetto al rilevamento della resistenza in tempo reale, facilitando diagnostiche complete della TB e migliorando il tracciamento degli epidemii in ambienti con risorse limitate e infrastrutture minime.

Per cominciare, calcola 100 nanogrammi di ogni campione di amplicon in base alla concentrazione e trasferisci il volume richiesto in un tubo PCR pulito. Per determinare la massa totale degli ampliconi nel campione, si utilizza la formula fornita. Regolare il volume totale di ogni campione a 12,5 microlitri usando acqua priva di nucleasi.

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