3' fine sequenziamento preparazione libreria con A-seq2

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di catturare e sequenziare l'mRNA a tre estremità prime, consentendo così studi sull'elaborazione dell'mRNA, in particolare la scissione e la poliadenilazione delle tre estremità prime, nonché la quantificazione dell'espressione genica. Il protocollo A-seq2 e il pacchetto di analisi dei dati qui presentato possono aiutare a rispondere a domande chiave sulla generazione e la funzione delle isoforme di trascritto in diversi tipi di cellule e tessuti. I principali vantaggi del metodo A-seq2 sono che evita il sequenziamento attraverso lunghi poli(A)tratti e non genera dimeri adattatori.

Per questa procedura vengono utilizzate cellule che vengono cresciute fino all'80% di confluenza. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule una volta con PBS. Lisare direttamente le cellule sulla piastra aggiungendo un millilitro di tampone di lisi per pozzetto e utilizzando una spatola di gomma per staccare completamente il materiale cellulare dalla superficie della piastra.

Utilizzare un puntale per pipetta da un millilitro per trasferire il lisato viscoso da ciascun pozzetto in una provetta di plastica da 15 millilitri. Condividi il DNA con una siringa da un millilitro attaccata a un ago ipodermico calibro 23. Eseguire diversi movimenti vigorosi su e giù dello stantuffo, fino a quando il lisato non è più viscoso.

Trasferire il lisato in una provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare a 20.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti, per rimuovere i detriti. Raccogli il surnatante chiaro dal lisato.

Aggiungere all'oligo d(T)25 le perle magnetiche e risospendere il composto. Posizionare i tubi su una ruota rotante per 10 minuti. Quindi, posizionare le provette su una griglia magnetica per due minuti.

Rimuovere il liquido trasparente. Aggiungere 0,8 millilitri di tampone A a ciascun tubo e ruotare il tubo di 180 gradi due o tre volte. Rimuovere il tampone A dal secondo lavaggio.

Aggiungere 0,8 millilitri di tampone B a ciascuna provetta e lasciare sul rack per due minuti. Per eluire l'mRNA legato dalle perle, rimuovere il tampone B, aggiungere 33 microlitri di acqua a ciascun tubo e risospendere le perle. Scaldare a 75 gradi Celsius per cinque minuti su un blocco a cuore.

Immediatamente, far girare le provette per un secondo e posizionarle sulla rastrelliera magnetica. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 66 microlitri di tampone di idrolisi alcalina a ciascun tubo, mescolare e riscaldare a 95 gradi Celsius per esattamente cinque minuti su un blocco riscaldante.

Raffreddare immediatamente i tubi con ghiaccio. Successivamente, eseguire l'isolamento dell'RNA utilizzando un kit di pulizia dell'RNA, come descritto nel protocollo di testo. Per iniziare questa procedura, aggiungere a ciascun campione di RNA 14 microlitri di un Master Mix di polinucleotide chinasi.

Incubare a 37 gradi Celsius, per 30 minuti. Dopo 30 minuti, caricare le reazioni chinasici su colonne di spin preparate. Centrifugare le colonne a 735 volte g per due minuti.

Scartare le colonne e posizionare le provette con le reazioni raccolte sul ghiaccio. Per bloccare le tre estremità primarie dei frammenti di RNA ed evitare la loro concatemerizzazione nelle successive reazioni di legatura, aggiungere a ciascun campione 17,5 microlitri di un Master Mix di poli(A)polimerasi. Mescolare e centrifugare per un secondo.

Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, aggiungere 32,5 microlitri di acqua ad ogni reazione e purificare l'RNA, come descritto nel protocollo di testo. Iniziare questa procedura ponendo le reazioni in un concentratore sottovuoto per 10 minuti, per ridurre il volume a sei microlitri.

Quindi aggiungere ad ogni reazione 24 microlitri di un Master Mix di RNA ligasi. Incubare le reazioni su un miscelatore riscaldato a 24 gradi Celsius per 16 ore, con miscelazione intermittente a mille giri/min. Il giorno seguente, aggiungere 17 microlitri di acqua ad ogni reazione e mescolare.

Purificare l'RNA, come descritto nel protocollo di testo. Porre le eluites in un concentratore sottovuoto per tre minuti, per ridurre il volume a 11 microlitri. Trasferire le reazioni in provette PCR da 200 microlitri per la reazione di trascrizione inversa.

Aggiungere un microlitro di primer. Riscaldare a 70 gradi Celsius in un ciclatore PCR per cinque minuti e poi lasciare a temperatura ambiente per cinque minuti. Aggiungere otto microlitri di un Master Mix a trascrizione inversa a ciascuna provetta e mescolare.

Metti le provette in un ciclatore PCR. Riscaldare a 55 gradi Celsius per 10 minuti e a 80 gradi Celsius per altri 10 minuti. Mantenere il ghiaccio.

Preparare le perle di streptavidina, come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere la reazione di trascrizione inversa alla soluzione di microsfere e incubare a quattro gradi Celsius su una ruota rotante per 20 minuti. Utilizzando una griglia magnetica, lavare le perle due volte con il tampone legante alla biotina e due volte con il tampone TEN.

Risospendere le perle in 50 microlitri di tampone TEN. Aggiungere due microlitri di miscela di enzimi uracile DNA glicosilasi e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora in un mixer, con miscelazione intermittente. Aggiungere 50 microlitri di acqua, 11 microlitri di tampone RNasi H e un microlitro di RNasi H, ad ogni reazione.

Incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Posizionare le provette sul rack magnetico e trasferire il liquido contenente il cDNA sciacquato in una nuova provetta. Purificare il cDNA scisso utilizzando un kit di purificazione PCR, come descritto nel protocollo di testo.

Mettere il cDNA purificato in un concentratore sottovuoto per otto minuti per concentrarsi fino a un volume di sette microlitri. Per legare cinque adattatori primi alle cinque estremità prime del cDNA isolato, aggiungere a ciascun campione 23 microlitri di un Master Mix di RNA ligasi e incubare a 24 gradi Celsius per 20 ore. Infine, aggiungere 70 microlitri di acqua ad ogni reazione.

Viene eseguita una PCR pilota per determinare il numero ottimale di cicli di PCR per raggiungere l'amplificazione della libreria, all'interno della fase esponenziale. Pipettare quanto segue in una provetta PCR da 200 microlitri: 25 microlitri di miscela di DNA polimerasi, 20 microlitri di reazione di legatura, due microlitri di acqua, 1,5 microlitri di primer PCR diretto e 1,5 microlitri di primer indice PCR inverso. Eseguire il cycler con il seguente programma: tre minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 20 cicli di 20 secondi a 98 gradi Celsius, 20 secondi a 67 gradi Celsius e 30 secondi a 72 gradi Celsius.

Raccogliere sette aliquote da microlitro direttamente dal ciclatore, dopo i cicli indicati. Separare i prodotti su un gel di agarosio al 2% e visualizzare la migrazione dei prodotti PCR. Determinare il numero di cicli all'inizio dell'amplificazione esponenziale, 12 cicli in questo esempio, e utilizzare questo numero di cicli per una reazione PCR su larga scala.

Separare i prodotti dalla reazione PCR su larga scala su un gel di agarosio al 2% e ritagliare le fette di gel contenenti da 200 a 350 nucleotidi di DNA. Successivamente, estrarre il DNA dalle fette di gel con il kit di estrazione del gel, come descritto nel protocollo di testo. In questo video verranno mostrati solo i passaggi computazionali più importanti.

Maggiori dettagli sono disponibili nel protocollo di testo. Inizia clonando il repository Git e passando alla directory appena creata. Creare un ambiente che contenga il software e attivare questo ambiente.

Scarica la sequenza del genoma dell'organismo, da cui sono stati ottenuti i dati A-seq2. Aprire il file di configurazione e impostare i parametri di input, come indicato nel protocollo di testo. Avviare l'analisi.

La risposta di un gene specifico, NUP214 al knockdown della proteina HNRNPC, è stata esaminata analizzando le reads a-seq2 di due campioni di cellule HEK-293, trattate con un piccolo RNA interferente di controllo o con un piccolo RNA interferente HNRNPC. Le letture che documentavano i poli(A)siti annotati dalla pipeline di analisi venivano salvate in formato BAM, che veniva utilizzato come input per il browser del genoma IGD. Le tre estremità prime dei picchi di lettura, mappate su mMRNA tre estremità prime che sono annotate in ensemble.

I profili indicano un aumento dell'uso della lunga isoforma UTR a tre primi dopo il knockdown di HNRNCR. Una volta padroneggiato, il protocollo A-seq richiede otto ore di pratica o circa due o tre giorni, senza contare il tempo per la coltura cellulare e le legature notturne. Quando si tenta il protocollo, è importante progettare prima un set primordiale conforme alla piattaforma di sequenziamento utilizzata nella propria posizione.

Una volta ottenuti i tre primi dell'mMRA, è possibile preformare altri metodi, come la reticolazione e l'immunoprecipitazione, per identificare i regolatori del processamento dei primi tre primi del pre-mRNA. A-seq2 ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'elaborazione dell'RNA, per esplorare la regolazione e le conseguenze della poliadenlilazione alternativa nei singoli tipi di cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare librerie di mRNA a tre estremità prime, analizzare i dati di sequenziamento, identificare nuovi poli(A)siti e quantificare il tuo utilizzo.

Ci auguriamo che A-seq2 faciliti il tuo lavoro nell'avviare la regolazione dell'elaborazione dell'mRNA e porti a molte nuove intuizioni.