Name: 3 fine sequenziamento preparazione libreria con A-seq2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Impara il protocollo A-seq2 per mappare i siti di elaborazione 3' degli mRNA, evitando sequenze poli(A) lunghe e dimeri adattatore. Questo metodo consente di studiare l'elaborazione dell'mRNA e quantificare l'espressione genica.

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Gli autori ringraziano la signora Béatrice Dimitriades per aiuto con la coltura delle cellule. Questo lavoro è stato supportato dalla Swiss National Science Foundation sovvenzioni n. 31003A_170216 e 51NF40_141735 (PRN RNA &#38; malattia).

<ol><li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li>
<li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li>
<li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3%27+region+extraction+and+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li>
<li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3%E2%80%99+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3%27+UTR+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li>
<li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+3%27+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465(2014).</li>
<li>Kivioja, T., Vähärautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li>
<li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+3%27+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li>
<li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly%28A%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li>
<li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
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<li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
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<li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li>
<li>Shepard, P. J., Choi, E. -A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3%27+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La moltitudine di core e fattori ausiliari che sono coinvolti nel processamento dell'estremità 3' del pre-mRNA si riflette in un paesaggio di poliadenilazione corrispondentemente complesse. Inoltre, è sensible a reagire ai cambiamenti in altri processi come la trascrizione e splicing poliadenilazione. 3' siti di fine taglio in pre-mRNA vengono in genere identificati in base le code di poli (a) caratteristica che vengono aggiunti ai prodotti di clivaggio 5'. Maggior parte dei metodi utilizzare primer oligo (distacco) di lunghezza variabile che consentono la conversione specifica di poli (A)-contenente mRNA da cDNA in una reazione di trascrizione inversa. Un problema comune di questo approccio è innesco interno alle sequenze A ricchi conseguente siti di fenditura artifactual. Sono stati proposti due metodi che mirano ad eludere questo artefatto nella fase di preparazione del campione. Nel metodo 3P-seq 1, adattatori sono specificamente legati alle estremità delle code di poli (a) con l'aiuto di una stecca oligo seguita da digestione parziale di RNAsi T1 e trascrizione d'inversione con TTP nella reazione come l'unico deossinucleotidi. Il risultante eteroduplici poly(A)-poly(dT) quindi sono digeriti con RNAsi H e i rimanenti frammenti di RNA sono isolati, legati agli adattatori e sequenziati. Un metodo più semplice ed elegante, 2P-seq, che utilizza un primer di sequenziamento personalizzato saltando il rimanente tratto di oligo (distacco) nella reazione di sequenziamento è stato segnalato dalla stessa autori 2. In un metodo correlato, 3' legge 3, un primer insolitamente lungo di 5 noi e 45 Ts, contenente anche una biotina è temprato a RNA frammentato, seguito da lavaggi stringenti per selezionare per molecole di RNA con code di poli (a) di oltre 50 nucleotidi. Anche se 3' letture drasticamente riduce la frequenza di innesco interno, questa non elimina completamente e 3. Protocolli per l'ordinamento diretto del RNA sono stati proposti, ma le letture risultante sono brevi e hanno un alto tasso di errore e questo approccio non è stato ulteriormente sviluppato 18,19,20. PolyA-Seq e i protocolli di Quant Seq commercializzati combinano oligo (distacco) basata di adescamento con un passo di adescamento casuale per il cDNA secondo strand sintesi 20. L'uso della reazione di trascrizione inversa della interruttore modello con della trascrittasi inversa del Virus di leucemia murina Moloney (MMLV) conduce alla generazione dei cDNAs con linker in un unico passaggio e quindi nessun dimeri adattatore possono apparire nel PAS-Seq e metodi S.A.P.A.S. 21 , 22.
Il metodo A-seq2 presentato qui spicca nel suo utilizzo di un nucleotide spaccabili (dU) all'interno di un primer oligo biotinilati. Questa modifica unisce l'utilità di arricchire oligo ibridato, poliadenilazione obiettivi con la rimozione della maggior parte della sequenza di25 oligo (dT) tra i frammenti isolati prima di librerie sono preparate e la conservazione delle tre "t", che indicare la presenza precedente della coda di poli (a). Al contrario, i metodi che utilizzano la RNasi H per rimuovere poli (a) dalle molecole di RNA in modo casuale lasciano diversi come. Poiché in A-seq2, sequenziamento è fatto dall'estremità 3' dei filamenti anti-senso, siti di taglio sono preveduti per essere collocato dopo il motivo NNNNTTT all'inizio della sequenza crudo letture. I tetrameri randomizzati servono non solo per consentire base chiamata ma anche l'eliminazione degli artefatti di amplificazione di PCR. UNMIS più lunghi possono essere sistemati. La possibilità di innesco interno rimane in A-seq2 e si rivolge informaticamente, prima scartando 3' termina con una sequenza a valle genomicamente codificati, A ricchi e quindi scartando 3' fine di cluster che potrebbe essere spiegato da innesco interno presso la A-ricco di poli (a) segnale stesso. Una recente analisi dei siti di poli (a) dedotto in modo univoco da un gran numero di protocolli indica che i siti che sono unici per A-seq2 hanno la distribuzione prevista del nucleotide e la posizione all'interno dei geni, simile a altri 3' fine protocolli di sequenziamento.
Un passaggio fondamentale nella A-seq2 è la selezione di poliadenilazione RNA e la rimozione di RNA ribosomiale (rRNA) e vari piccoli RNA. Ciò avviene più facilmente da un kit di isolamento di mRNA con oligo (dT)25 biglie magnetiche. In linea di principio, RNA totale isolato con fenolo contenenti soluzioni anche dà alta qualità RNA che può essere ulteriormente sottoposto a selezione dal kit di mRNA-isolamento o dell'agarosi oligo (dT). Un passaggio che può essere variato in A-seq2 è il trattamento con idrolisi alcalina che possono essere ridotto o esteso per ottenere frammenti di RNA di diverse dimensioni. Fondamentale è anche che l'aggiunta di dATP 3' a 3' estremità dei frammenti di RNA da parte della polimerasi di poli (a) è efficiente. Nel protocollo descritto qui, questo trattamento viene applicato a tutti i frammenti di RNA, per evitare concatemerization durante la reazione di legatura. Si segnala infine che, sebbene ligasi RNA 1 è usata normalmente come una ligasi di RNA, lega anche in modo efficiente singolo DNA incagliato, come abbiamo fatto qui per legare un adattatore all'estremità 5' delle molecole di cDNA.
Così, A-seq2 è un efficiente e facile da implementare il protocollo per l'identificazione di siti di elaborazione estremità 3' del pre-mRNA. Gli sviluppi futuri potrebbero includere riducendo ulteriormente la complessità del protocollo e la quantità di materiale necessario. Set di strumenti di analisi computazionale dati ulteriormente associato abilitare l'elaborazione omogenea dell'estremità 3' letture ottenute con una vasta gamma di protocolli di sequenziamento.

La cattura e la sequenza di mRNA 3' estremità permette lo studio dell'elaborazione di mRNA e la quantificazione dell'espressione genica. A causa di loro code di poli (a), mRNA eucariotico può essere efficacemente purificato da lisati cellulari totali con perlina-immobilizzata oligo-deossitimidina (molecole di oligo(dT)), che può anche innescare la sintesi di cDNA. Tuttavia, questo approccio presenta due svantaggi. In primo luogo, tratti della A interne a trascrizioni possono anche innescare la sintesi di cDNA, conseguente spurie poli (a) siti. Poli (a) in secondo luogo, omogeneo tratti pongono sfide specifiche per il sequenziamento, oltre a non essere ben informato per l'identificazione di trascrizione. Vari approcci sono stati proposti per aggirare queste limitazioni, come trascrizione d'inversione attraverso poli (a) Code seguite da digestione RNasi H (3P-seq 1), utilizzo di un primer di sequenziamento personalizzato che termina in 20 Ts (2P-seq 2), preselezione di Frammenti di RNA con code di poli (a) di oltre 50 nucleotidi con un primer di45 CU5T seguita da digestione RNasi H (3' letture 3) e l'utilizzo di un primer oligo-dT contenente l'adattatore 3' in un tornante (A-seq 4).
L'A-seq2 metodo sviluppato di recente 5 mira a bypassare il sequenziamento attraverso poli (a) e allo stesso tempo per ridurre al minimo la percentuale di dimeri generati da auto-legatura degli adattatori, particolare che si verificano quando la concentrazione molare di adattatori supera la concentrazione di inserto. Questo problema può essere eliminato quando entrambe le schede sono legate allo stesso tipo di polinucleotide estremità come in A-seq2, dove le schede 3' sono legate all'estremità 5' di frammenti di RNA e le schede di 5' a 5' estremità dei cDNA dopo trascrizione inversa. Il metodo è più conveniente della nostra precedentemente proposta A-seq - in cui sequenziamento è stato in 5'-a-3' direzione quindi che richiedono precisamente controllata RNA frammentazione-, pur mantenendo un'elevata precisione di identificazione del sito di poli (a). Circa l'80% delle letture sequenziate in campioni tipici associati in modo univoco al genoma e condurre all'identificazione di oltre 20.000 cluster di sito di poli (a), più del 70% delle quali sovrapposte con annotata 3' UTR.
In breve, il protocollo A-seq2 inizia con frammentazione di mRNA e la legatura del inverso-complemento 3' adattatori alle estremità 5' dei frammenti di RNA. Poli (A)-contenente RNA è quindi inverso trascritto con un primer oligo lungo 25 nucleotidi (nt) che contiene un nucleotide di ancoraggio all'estremità 3', un dU in posizione 4 e una biotina all'estremità 5', consentendo l'associazione del cDNA di branelli magnetici streptavidina. La maggior parte del primer, tra cui la biotina, viene rimosso da cDNA tramite fenditura al dU tramite il mix di enzima di utente, contenente Uracil DNA glicosilasi (UDG) e il DNA glicosilasi-liasi endonucleasi VIII. Questa reazione lascia intatti finisce per la legatura di un adattatore per 5' e tre Ts sinistra dopo fenditura rimangono per contrassegnare la posizione della coda di poli (a). Perché schede di 5' e 3' sono collegate tramite la legatura al destinatario 5' estremità, non vengono generati dimeri di adattatore. Quattro nucleotidi casuale-mers introdotto all'inizio di letture permette la risoluzione di cluster su strumenti di sequenziamento di state-of-the-art e può anche servire come identificatore univoco molecolare (UMI) per il rilevamento e la rimozione di artefatti di amplificazione di PCR. La dimensione della Umi può essere ulteriormente aumentata come fatto in altri studi 6. Il protocollo genera letture che sono invertire complementare al mRNA 3' estremità, tutti che iniziano con un tetramero randomizzato seguito da 3 Ts. elaborazione di letture che hanno le 3 Ts diagnostica a loro 5' fine inizia con la correzione di artefatti di amplificazione di PCR di sfruttando l'UNMIS, rimozione delle sequenze 3' adattatore e invertire la complementazione. Si legge che potrebbero trarre origine da oligo adescamento a siti A ricchi interni sono anche identificati informaticamente e scartati. I siti spuri generalmente privi di uno dei 18 ben caratterizzati e segnali di poli (a) conservati che dovrebbero essere situato ~ 21 nucleotidi a Monte del clivaggio apparente sito 7.
Il protocollo richiede circa 8 h tempo di hands-on, senza contare la coltura delle cellule e le legature durante la notte. L'associato leggere analisi software consente un'identificazione del sito di poli (a) altamente accurate. Dal sito di poli (a) i cluster creato in basati a 4 campioni ulteriormente evidenziati in questa sovrapposizione di 84% manoscritto (due replicati biologici di controllo siRNA e cellule si-HNRNPC-trattate) con un gene con annotazioni e di questi, sovrapposizione di 75% con una 3' UTR e l'86% sia con un 3' UTR o un esone terminale. Il coefficiente di correlazione di Pearson di espressione di 3' estremità nei campioni replicati è 0.92, e valori di superiore allo 0,9 sono in genere ottenuti con il metodo. Così, A-seq2 è un metodo conveniente che dà risultati molto riproducibili.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, ultra puro</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Cordycepina trifosfato (3' dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA fiale a basso legame, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo; s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>colorante GR-Green</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>utilizzare 1:10.000 dilluizione</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 o NextSeq 500 sequenziatori di nuova generazione</td><td>Illumina</td><td>informarsi con il fornitore</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA polimerasi mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poli(A) polimerasi, lievito</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poli(A) polimerasi, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleotide chinasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Kit di estrazione su gel</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA ligasi 1, alta concentrazione</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>include PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit di pulizia dell'RNA</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, inibitore della ribonucleasi</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa Superscript IV</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER miscela enzimatica</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 rack magnetico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Miscelatore riscaldato con coperchio riscaldato</td></tr><tr><td>Colonne MicroSpin</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline tampone per idrolisi, 1,5 x</td><td></td><td></td><td>Miscela 1 parte 0,1 M Na2CO3 e 9 parti 0,1 M NaHCO3. Aggiungere EDTA a 1 mM. Regolare il pH a 9,2. Conservare le aliquote a -20 °C.</td></tr><tr><td>5x tampone poli(A) polimerasi</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7,0, 3 mM MnCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA acetilato, 50% glicerolo</td></tr><tr>Tampone <td></td><td></td><td>legante la biotina</td><td>20 mM Tris&shy; Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,1% NP&shy; 40</td></tr><tr><td>tampone</td><td></td><td></td> TEN <td>10 mM Tris&shy; Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02% NP&shy; 40</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Sequence</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi secondo i kit di preparazione dei campioni di piccoli RNA Illumina TruSeq, per sequenziatori GA-IIx e Hiseq2000/2500</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&shy; CCUUGGCACCCGAAUUCCA&shy; 3'</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' ammino&shy; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' (V = G, A o C)</td></tr><tr><td>PCR primer forward, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG TCCGA 3'PCR</td></tr> <tr><td>primer reverse, RPI1, codice a barre in grassetto</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT 
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi secondo i kit di preparazione dei campioni di Illumina TruSeq HT-Small RNA, per sequenziatori HiSeq2000/2500 e NextSeq500</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5'-ammino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG 
CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A</td></tr> <tr><td></td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' ammino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
CTTCCGATCTNNNN</td></tr> <tr><td>3'Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3'PCR</td></tr> <tr><td>primers forward (D501-506)</td><td>Microsynth o Illumina</td><td></td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA CGACGCTCTTCCGATCT -3'PCR</td></tr> <tr><td>primer reverse (D701-D712)</td><td>Microsynth o Illumina</td><td></td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'Documentazione</td></tr> <tr><td>per il multiplexing Illumina:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' fine sequenziamento preparazione libreria con a-seq2

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Gli studi nell'ultimo decennio hanno rivelato una varietà complessa e dinamica di pre-mRNA clivaggio e poliadenilazione reazioni. mRNA con lungo regioni 3' non tradotta (UTR) vengono generati in cellule differenziate, mentre le cellule proliferanti esprimono preferenzialmente trascrizioni con breve 3' UTR. Descriviamo il protocollo A-seq, ora alla sua seconda versione, che è stato sviluppato per mappare siti di poliadenilazione genoma e studiare la regolazione del pre-mRNA processamento dell'estremità 3'. Anche questo protocollo attuale sfrutta la polyadenylate nel (poly(A)) code che vengono aggiunti durante la biogenesi dei mRNAs più mammiferi per arricchire per mRNA completamente elaborato. Un adattatore di DNA con deoxyuracil alla sua quarta posizione permette la lavorazione precisa di mRNA 3' fine frammenti per la sequenza. Non compresa la coltura delle cellule e le legature durante la notte, il protocollo richiede circa 8 h tempo di hands-on. Insieme ad essa, viene fornito un pacchetto facile da usare software per l'analisi dei dati di sequenziamento derivata. A-seq2 e il software di analisi associati forniscono una soluzione efficiente e affidabile per il mapping del pre-mRNA 3' finisce in una vasta gamma di condizioni, da 106 o meno cellule.

Poli (A)-contenente RNA è stato isolato dalle cellule coltivate, frammentate di idrolisi alcalina e cDNA sono state fatte di retrotrascrizione con primer oligo (distacco). Il cDNA risultante è stato immobilizzato su perle di streptavidina, dU è stato fenduto nella reazione di asportazione specifico di uracile, adattatori erano legati al 5' e 3' estremità del frammento spaccato e gli inserti sono state sequenziate. Figura 1 raffigura un contorno grafico dell'esperimento.
Per cellule HEK293 e HeLa, 106 celle erano sufficienti per identificare i siti di poli (a) per la stragrande maggioranza dei geni di proteina-codificazione alla fine della procedura. Tuttavia, per altri tipi di cellule o tessuti che può essere necessario testare la saturazione del numero di poli (a) identificati siti come il numero di celle utilizzato nell'esperimento aumenta. Risultati rappresentativi della PCR pilota passo e del frammento del DNA analisi del campione prima di sequenziamento sono mostrati nella Figura 2.
La figura 3 Mostra i passaggi di pre-elaborazione di analisi computazionale, a partire dal file fastq ottenuti dal sequencer e terminando con le letture di qualità controllata, bordato di adattatore che sono pronte ad essere mappato il genoma. La figura 4 Mostra la procedura di analisi che iniziano con la mappatura delle letture al genoma corrispondente e fine con catalogo di siti che sono identificati in un campione particolare di elaborazione estremità 3' mRNA. Quando si analizzano campioni multipli, vengono eseguite ulteriori operazioni per abbinare all'estremità 3' elaborazione di siti che sono stati trovati nei campioni individuali e segnalare loro abbondanza attraverso campioni. Questi passaggi sono illustrati nella Figura 5.
Così, una volta che i campioni sono stati sequenziati, l'analisi della sequenziazione risultante leggere i file (in formato fastq) attraverso la pipeline di elaborazione disponibili è semplice. Dopo aver aggiunto le informazioni sugli esempi nel file di configurazione, l'esecuzione della pipeline si tradurrà in due tipi principali di file di output: 1) letto-file con tutte le 3' finiscono elaborazione siti individuati nei singoli campioni (ad es. " Sample1.3pSites.noIP.Bed.gz") e 2) un letto-file con tutti i poli (a)-cluster sito (clusters.merged.bed) attraverso tutti i campioni dello studio. La produzione comprende anche le coordinate del genoma per tutte le letture da ogni singolo campione (ad esempio "sample1. STAR_out/aligned.sortedByCoord.out.Bam") che più tardi possono essere visualizzati in un browser del genoma come IGV16. Ispezione visiva dei profili letti fornisce generalmente un primo assaggio della distribuzione dei siti di poli (a) nel genoma e i cambiamenti che si verificano al momento delle perturbazioni specifiche che sono state effettuate nello studio. Ad esempio, nella Figura 6 è illustrata la risposta di un gene specifico per il knock-down della proteina HNRNPC.
Sintesi di queste distribuzioni di genoma sono inoltre forniti (tabella 1). In particolare, i file di output nella directory "conteggi/annotation_overlap" contengono frazioni di siti che si sovrappongono con specifiche caratteristiche con annotazioni (dal gtf file fornito come input; annotati sono: 3' UTR, essone terminale, esone, introne, intergenica). Infine, per ogni campione, risultati delle fasi di lavorazione individuali vengono salvati (ad esempio "sample1.summary.tsv"). Questo include i numeri di: crude letture in ogni campione, si legge che hanno la struttura prevista dell'estremità 5', si legge che rimangono dopo essere collassato completo duplicati PCR, alta qualità legge secondo i criteri definiti al punto 9.2, legge che la mappa in modo univoco al genoma (dopo essere collassato a quelli derivanti da errori di sequenziamento, vedi punto 9.5), multi-mappatura legge (dopo essere collassato a quelli derivanti da errori di sequenziamento, vedi punto 9.5), raw (non cluster) 3' fine elaborazione siti in ogni campione, crudo 3' fine elaborazione siti senza candidati potenziali di innesco interno, unico 3' fine elaborazione siti da tutti i campioni senza innesco interno candidati e set finale di poli (a) sito cluster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Figura 1: fasi principali del protocollo A-seq2. Singoli passi sono indicati sul lato sinistro della figura. Inserisci frammenti di RNA sono rappresentati come linee verdi che diventano rossi per cDNA dopo trascrizione inversa; gli adattatori sono colorati in azzurro o in arancione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Figura 2: pilota PCR e prodotto finale profilo. (un) aliquote dalla reazione di PCR sono stati raccolte a cicli diversi e separati su gel di agarosio 2%. I numeri a sinistra indicano dimensione in nucleotidi delle rispettive bande nella scala del DNA. In questo esperimento 12 cicli (*) sono stati scelti per la reazione di PCR su larga scala. (b) esempio di un campione dopo il formato selezione correre su un analizzatore di dimensione del frammento rivelando una dimensione media di circa 280 nucleotidi. I numeri a sinistra [FU] indicano l'intensità relativa del segnale. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Figura 3: struttura del pre-trattamento di sequenziamento letture. Per identificare le letture di alta qualità che verranno mappate al genoma corrispondente vengono elaborati i file fastq con letture che vengono generati dal software strumento-collegata di sequenziamento. La figura mostra la specifica di ingresso/uscita delle singole fasi della pipeline, con collegamenti per i singoli passaggi del protocollo descritto nella sezione "Elaborazione dei dati". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Figura 4: schema di sequenza leggere elaborazione, del passaggio di mapping per il genoma per la generazione di singoli 3' fine elaborazione siti. Nella figura viene illustrata la specifica di ingresso/uscita delle singole fasi della pipeline, con collegamenti per la individual passaggi del protocollo descritto nella sezione "Elaborazione dei dati". Il file di output principale che viene consegnato all'utente è segnato in neretto. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Figura 5: struttura dei passaggi che sono presi per generare cluster di co-regolati da 3' estremità sequenziamento siti. La figura mostra la specifica di ingresso/uscita delle singole fasi della pipeline, con collegamenti per i singoli passaggi del protocollo descritto nella sezione "Elaborazione dei dati". Il file di output principale è segnato in neretto. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Figura 6: risultati di esempio del profilo del 3' finiscono elaborazione letture lungo il terminale esone del gene NUP214, mostrato nel browser del genoma IGV 16 . A-seq2 letture sono state preparate da due campioni di cellule HEK 293, trattate con un controllo-siRNA o con un HNRNPC siRNA. Le letture che documentato siti di poli (a) che sono stati annotati dalla pipeline di analisi erano salvate nel formato BAM che è stato utilizzato come input per il browser del genoma IGV. Le estremità 3' dei picchi letti mappa mRNA 3' estremità che vengono annotate nello Ensembl. I profili indicano un uso aumentato dell'isoforma lunga 3' UTR su HNRNPC knock-down. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>si-controllo replicare 1</td>
			<td>si-controllo replicare 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ID: 29765</td>
			<td>ID: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di letture crude</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di letture valide dopo la rifilatura e filtraggio</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di mapping in modo univoco letture</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di letture mapping ai luoghi multipli</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>numero di singoli 3' fine elaborazione siti</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: esempio di output della pipeline analisi. Sintesi della legge che sono stati ottenuti alle singole fasi.

Questo protocollo descrive un metodo per la mappatura pre-mRNA 3' fine elaborazione siti.

3' fine sequenziamento preparazione libreria con A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

L'obiettivo generale di questo metodo è catturare e sequenziare le estremità 3' dell'mRNA, consentendo così studi sul processamento dell'mRNA, in particolare sulla scissione dell'estremità 3' e sulla poliadenilazione, nonché sulla quantificazione dell'espressione genica. Il protocollo A-seq2 e il pacchetto per l'analisi dei dati qui presentati possono contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla generazione e sulla funzione degli isoformi trascrizionali in diversi tipi cellulari e tessuti. I principali vantaggi del metodo A-seq2 sono l'evitare il sequenziamento attraverso lunghe sequenze poli(A) e il non generare dimeri di adattatori.Si utilizzano cellule cresciute fino a una confluenza dell'80%. Rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule una volta con PBS. Lisi direttamente le cellule nella piastra aggiungendo un millilitro di buffer di lisi per pozzetto ed utilizzando una spatola di gomma per staccare completamente il materiale cellulare dalla superficie della piastra.Utilizzare una punta da pipetta da un millilitro per trasferire il lisato viscoso da ogni pozzetto in un tubo di plastica da 15 millilitri. Frammentare il DNA utilizzando una siringa da un millilitro collegata a un ago ipodermico da 23 gauge. Eseguire diversi movimenti vigorosi su e giù dello stantuffo fino a quando il lisato non risulti più viscoso.Trasferire il lisato in una provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare a 20.000 ×g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti, per rimuovere i detriti. Raccogliere il sopranatante limpido dal lisato.Aggiungere ai microsferette magnetiche oligo d(T)25 e risospendere il miscuglio. Posizionare i tubi su una ruota rotante per 10 minuti. Successivamente, posizionare i tubi su un supporto magnetico per due minuti.Rimuovere il liquido limpido. Aggiungere 0,8 millilitri di tampone A in ogni provetta e capovolgere la provetta di 180 gradi da due a tre volte. Rimuovere il tampone A dal secondo lavaggio.Aggiungere 0,8 millilitri di tampone B in ogni provetta e lasciare in posa sul rack per due minuti. Per eluire l'mRNA legato alle perle, rimuovere il tampone B, aggiungere 33 microlitri di acqua in ogni provetta e risospendere le perle. Riscaldare a 75 gradi Celsius per cinque minuti su un blocco riscaldato.Immediatamente, centrifugare i tubi per un secondo e posizionarli sul portatubi magnetico. Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Aggiungere 66 microlitri di tampone di idrolisi alcalina a ciascun tubo, mescolare e riscaldare a 95 gradi Celsius per esattamente cinque minuti su un blocco termoregolato.Immediatamente, raffreddare i tubi sul ghiaccio. Successivamente, eseguire l'isolamento dell'RNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA, come descritto nel protocollo testuale. Per iniziare questa procedura, aggiungere a ciascun campione di RNA 14 microlitri di una miscela master di polinucleotide chinasi.Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, caricare le reazioni della chinasi su colonne spin preparate. Centrifugare le colonne a 735 ×g per due minuti.Scartare le colonne e posizionare le provette con le reazioni raccolte sul ghiaccio. Per bloccare le estremità tre prime dei frammenti di RNA ed evitare la loro concatemerizzazione nelle successive reazioni di ligazione, aggiungere a ciascun campione 17,5 microlitri di una miscela Master di poli(A)polimerasi. Mescolare e centrifugare per un secondo.Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, aggiungere 32,5 microlitri di acqua a ogni reazione e purificare l'RNA, come descritto nel protocollo testuale. Iniziare questa procedura posizionando le reazioni in un concentratore sotto vuoto per 10 minuti, riducendo il volume a sei microlitri.Quindi aggiungere a ciascuna reazione 24 microlitri di una miscela Master di RNA ligasi. Incubare le reazioni in un agitatore riscaldato a 24 gradi Celsius per 16 ore, con mescolamento intermittente a mille giri al minuto. Il giorno seguente, aggiungere 17 microlitri di acqua a ciascuna reazione e mescolare.Purificare l'RNA, come descritto nel protocollo testuale. Collocare gli eluiti in un concentratore sotto vuoto per tre minuti, al fine di ridurre il volume a 11 microlitri. Trasferire le reazioni in provette PCR da 200 microlitri per la reazione di trascrizione inversa.Aggiungere un microlitro di primer. Riscaldare a 70 gradi Celsius in un termociclatore PCR per cinque minuti, quindi lasciare a temperatura ambiente per cinque minuti. Aggiungere otto microlitri di una miscela maestra di trascrizione inversa in ogni provetta e mescolare.Posizionare le provette in un termociclatore PCR. Riscaldare a 55 gradi Celsius per 10 minuti e a 80 gradi Celsius per altri 10 minuti. Mantenere sul ghiaccio.Preparare le perle di streptavidina, come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere la reazione di trascrizione inversa alla soluzione di perle e incubare a quattro gradi Celsius su una ruota rotante per 20 minuti. Utilizzando un supporto magnetico, lavare le perle due volte con tampone di legame per la biotina e due volte con tampone TEN.Risospendere le perle in 50 microlitri di tampone TEN. Aggiungere due microlitri di mix enzimatico di uracile DNA glicosilasi e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora in un agitatore, con mescolamento intermittente. Aggiungere 50 microlitri di acqua, 11 microlitri di tampone RNase H e un microlitro di RNase H a ciascuna reazione.Incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Posizionare i tubi sul portaprovette magnetico e trasferire il liquido contenente il cDNA scisso in un nuovo tubo. Purificare il cDNA scisso utilizzando un kit di purificazione PCR, come descritto nel protocollo del testo.Collocare il cDNA purificato in un concentratore a vuoto per otto minuti, fino a raggiungere un volume di sette microlitri. Per legare gli adattatori della estremità 5' alle estremità 5' del cDNA isolato, aggiungere a ogni campione 23 microlitri di una miscela Master di RNA ligasi e incubare a 24 gradi Celsius per 20 ore. Infine, aggiungere 70 microlitri di acqua a ogni reazione.Viene eseguita una PCR pilota per determinare il numero ottimale di cicli di PCR necessari per raggiungere l'amplificazione della libreria all'interno della fase esponenziale. Pipettare quanto segue in una provetta PCR da 200 microlitri: 25 microlitri di mix di DNA polimerasi, 20 microlitri di reazione di ligazione, due microlitri di acqua, 1,5 microlitro di primer PCR forward e 1,5 microlitro di primer PCR reverse con indice. Eseguire il termociclatore con il seguente programma: tre minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 20 cicli di 20 secondi a 98 gradi Celsius, 20 secondi a 67 gradi Celsius e 30 secondi a 72 gradi Celsius.Prelevare aliquote di sette microlitri direttamente dal termociclatore, dopo i cicli indicati. Separare i prodotti su un gel di agarosio al 2% e visualizzare la migrazione dei prodotti della PCR. Determinare il numero di cicli all'inizio dell'amplificazione esponenziale, 12 cicli in questo esempio, e utilizzare questo numero di cicli per una reazione PCR su larga scala.Separare i prodotti della reazione PCR su larga scala su un gel di agarosio al 2% e ritagliare le fette di gel contenenti prodotti di DNA di 200-350 nucleotidi. Successivamente, estrarre il DNA dalle fette di gel utilizzando il kit di estrazione da gel, come descritto nel protocollo testuale. In questo video verranno mostrati soltanto i passaggi computazionali più importanti.Ulteriori dettagli sono disponibili nel protocollo testuale. Iniziare clonando il repository Git e passando alla directory appena creata. Creare un ambiente che contenga il software e attivare questo ambiente.Scaricare la sequenza del genoma dell'organismo da cui sono stati ottenuti i dati A-seq2. Aprire il file di configurazione e impostare i parametri di ingresso, come indicato nel protocollo testuale. Avviare l'analisi.La risposta di un gene specifico, NUP214, al silenziamento della proteina HNRNPC, è stata esaminata analizzando le letture a-seq2 provenienti da due campioni di cellule HEK-293, trattate o con un RNA interferente di controllo o con un RNA interferente specifico per HNRNPC. Le letture che documentavano i siti poli(A) annotati dalla pipeline di analisi sono state salvate in formato BAM, utilizzato come input per il browser genomica IGD. Le estremità tre prime dei picchi di lettura, mappate sulle estremità tre prime dell'mRNA annotate in ensemble.I profili indicano un aumento nell'uso dell'isoforma con lunga UTR 3' a seguito dell'abbattimento di HNRNCR. Una volta appreso, il protocollo A-seq richiede otto ore di lavoro manuale o circa due o tre giorni, escluso il tempo necessario per la coltura cellulare e le ligazioni notturne. Quando si esegue il protocollo, è importante progettare innanzitutto un set di primer conforme alla piattaforma di sequenziamento utilizzata presso la propria sede.Una volta ottenuti i frammenti mMRA delle estremità 3', altri metodi, come il cross-linking e l'immunoprecipitazione, possono essere eseguiti per identificare i regolatori dell'elaborazione delle estremità 3' dell'RNA pre-messaggero. A-seq2 ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'elaborazione dell'RNA, permettendo di esplorare la regolazione e le conseguenze dell'alternative polyadenilazione in singoli tipi cellulari. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione su come generare librerie di estremità 3' dell'mRNA, analizzare i dati di sequenziamento, identificare nuovi siti poliadenilici e quantificarne l'utilizzo.Speriamo che A-seq2 semplifichi il vostro lavoro nell'analisi della regolazione dell'elaborazione dell'mRNA e porti a numerose nuove scoperte.

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