Microdissezione multilivello e profilazione funzionale-strutturale di rami arteriosi renali umani

La nostra ricerca mira a stabilire metodi standardizzati per isolare e valutare funzionalmente i rami arteriosi renali umani, scoprendo i meccanismi di disfunzione vascolare e guidando terapie mirate. La ricerca precedente si basava su modelli animali o sull'imaging indiretto, in cui la nostra miografia a filo rispecchia direttamente la funzione dell'arteria renale umana in vitro. Il nostro metodo consente un'analisi vascolare precisa e specifica per l'uomo, superando i limiti delle specie e migliorando lo sviluppo di farmaci traslazionali.

Per iniziare, assicurarsi che il tessuto renale rimanga completamente immerso nel liquido durante il trasporto per mantenere la vitalità dei tessuti e l'integrità strutturale. Identificare visivamente il piano coronale individuando l'ilo renale e allineando il taglio in modo che passi attraverso sia la pelvi renale che il bordo convesso laterale. Usando un bisturi sterile, taglia in due il rene lungo questo piano coronale per creare due metà simmetriche ed esporre le strutture interne, come le piramidi e le colonne renali.

Sotto uno stereomicroscopio, usa forbici e pinze per microdissezione per separare meticolosamente le arterie interlobare, arcuata e interlobulare in un piatto di coltura a fondo nero di 10 centimetri. Quindi, rimuovere delicatamente il tessuto circostante e il grasso dalle arterie sezionate nella stessa piastra di coltura a fondo nero da 10 centimetri per pulirle accuratamente. Utilizzando le forbici per microdissezione, sezionare le arterie pulite in anelli di circa due millimetri di lunghezza per gli studi sulla funzione vascolare.

Inserire con cautela il primo filo guida in un anello arterioso del piatto. Piegare un lato del filo guida con un angolo di 90 gradi e trasferire l'anello arterioso con il filo nella camera. Prima di fissare l'anello arterioso sul portacampioni, registrare la lunghezza del vaso.

Posizionare l'anello tra i due supporti e leggere la scala micrometrica, dove una divisione della scala equivale a 10 micrometri. Sottrarre il valore iniziale della scala misurato quando i supporti si toccano appena per calcolare la lunghezza e la larghezza dell'anello arterioso. Quindi, fissare l'anello arterioso sul portacampione a vongola utilizzando le viti in dotazione allo strumento, serrandole in senso orario.

Quindi, infilare un secondo filo guida attraverso l'anello arterioso. Avvolgere il filo in senso orario attorno alle viti di fissaggio su entrambe le estremità, fissandolo saldamente alla superficie del supporto del campione. Selezionare Impostazioni di normalizzazione dal menu DMT e impostare la calibrazione dell'oculare su un millimetro per divisione, la pressione target su 13,3 kilopascal, IC1/IC100 su 0,9, il tempo medio online su tre secondi e il tempo di ritardo su 60 secondi.

Selezionare il canale corrispondente all'arteria target e aprire la schermata Normalizzazione dal menu DMT. Nei campi appropriati, inserire i punti finali del tessuto poiché a1 è uguale a zero e a2 è uguale alla lunghezza del vaso misurata in millimetri. Immettere il diametro del filo come 40 micrometri e inserire la lettura del micrometro dalla scala.

Fare clic su Aggiungi punto per salvare i dati. Ora applica l'allungamento passivo e attendi tre minuti. Immettere la nuova lettura del micrometro come punto successivo e fare clic su Aggiungi punto.

Aggiungere cinque millilitri di soluzione di ioni potassio 60 nella camera per indurre una contrazione mediata dal potassio del recipiente. Per lavare via la soluzione di ioni potassio 60, aggiungere cinque millilitri di soluzione di Krebs tre volte. Per valutare la contrazione concentrazione-dipendente indotta dalla fenilefrina, applicare la fenilefrina cumulativa con incrementi di mezzo log da 10 alla potenza del nove negativo a 10 alla potenza del quattro molare negativo.

Per ulteriori test antidroga, lavare la camera con cinque millilitri caldi di soluzione di Krebs almeno cinque volte fino a quando la tensione non torna alla linea di base e rimane stabile per almeno 10 minuti. L'arteria interlobare è stata sezionata con successo dal midollo renale, mostrando una spessa parete vascolare e tessuto adiposo circostante che richiedeva un'attenta rimozione per preservare l'integrità strutturale. L'arteria arcuata è stata isolata alla giunzione corticomidollare, mostrando una parete vascolare più sottile e una traiettoria arcuata.

È stata identificata l'arteria interlobulare che attraversa linearmente la corteccia renale con una parete molto sottile e strettamente integrata con il tessuto corticale. L'analisi istologica ha rivelato che l'arteria interlobare aveva la parete vascolare più spessa con un'avventizia distinta, mentre le arterie arcuate e interlobulari mostravano pareti progressivamente più sottili e meno strati muscolari lisci. La normalizzazione arteriosa ha comportato ripetuti allungamenti meccanici e stimolazione indotta dal potassio, stabilendo condizioni di tensione basale stabili tra i campioni.

L'aggiunta cumulativa di fenilefrina da 10 alla potenza di nove negativi a 10 alla potenza di concentrazioni negative di quattro molari ha indotto contrazioni progressivamente più forti negli anelli arteriosi in modo dose-dipendente. Nelle arterie precontratte con fenilefrina, l'aumento delle concentrazioni di acetilcolina da 10 alla potenza di otto o tre volte 10 alla potenza di cinque molari negativi ha prodotto una vasodilatazione concentrazione-dipendente.