Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di misurare quantitativamente l'organizzazione subnucleare nelle cellule di lievito e come è influenzata da cambiamenti nelle condizioni di crescita o mutazioni. Ciò si ottiene facendo crescere le cellule di lievito in fase logheggiante in condizioni che minimizzino l'autofluorescenza. Successivamente, le cellule vengono poste in una camera di crescita per la visualizzazione al microscopio.

Quindi vengono scattate immagini per misurare la distanza tra le diverse strutture marcate in fluorescenza nella cellula. Si ottengono risultati che mostrano differenze nell'organizzazione non nucleare, che dipende dal cambiamento delle condizioni nutrizionali durante la crescita della coltura del lievito. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo epie sull'interazione tra l'organizzazione subar o la cromatina e la regolazione genica.

Toul pesce e lievito iniziano preparando il terreno minimo di Edimburgo o EMM e EMM con anche cloruro di ammonio per ridurre l'autofluorescenza piuttosto che l'autoclave. Utilizzare un filtro da 0,2 micron per sterilizzare la soluzione di glucosio e aggiungerla al terreno dell'autoclave. Inoculare tre millilitri di EMM in provette da 30 millilitri con cellule di pesce e lievito.

Appena coltivate su una piastra di agar nel terreno ricco, YEA tappano leggermente le provette e incubano le cellule in uno shaker a 225 RPM e 30 gradi Celsius. Mantenere le cellule in fase logaritmica per due giorni contandole con una camera birka ogni mattina e sera e diluendole alla densità appropriata. Il giorno dell'esperimento.

Le celle dovrebbero essere una fase di log precoce per il personale di azoto. Le cellule si riferiscono alla procedura descritta nel protocollo scritto per raccogliere le cellule in un pellet sul fondo di una centrifuga a tubo, 1,5 millilitri di cellule in un tubo orph eend a un massimo di 1,5 RCF facendo prima girare il tubo per due minuti, quindi ruotandolo di 180 gradi per altri due minuti. Rimuovere tutti tranne 10-15 microlitri del surnatante e risospendere le cellule nel terreno rimanente, attraverso un'aliquota di un milligrammo per millilitro di lectina sterilizzata.

Aggiungere cinque microlitri di soluzione di lectina all'angolo del vetro di copertura e aggiungere cinque microlitri di coltura alla goccia di lectina. Per creare una camera di crescita di cellule base di S pom, pipettare cinque microlitri di EMM su un vetrino pulito e capovolgere il vetro di copertura con la coltura a un angolo di 70 gradi sopra il terreno e lasciarlo cadere dall'alto verso il basso sull'EMM per sigillare i bordi con grasso al silicone. Tagliare l'estremità larga di una punta da 200 microlitri e collegare l'estremità stretta a una siringa da due millilitri.

Riempire la siringa con circa un millilitro di grasso siliconico. Applicare una linea sottile di silicone sui bordi del vetro di copertura spingendo delicatamente il pistone della siringa per visualizzare la camera di crescita. Inizia utilizzando l'imaging in campo chiaro per localizzare le cellule e scavare.

Ottieni un'immagine nitida per la microscopia confocale. Utilizziamo un microscopio a scansione laser Zeiss LSM 700 con un obiettivo a olio planocromatico apoch 63 volte e un'impostazione di scansione del piano media di 16 linee. Impostare le unità di area su uno su 1,1 per ottenere una fetta ottica di 0,8 micron.

Scansiona le celle con laser che rilevano Alexa 4 88 e mCherry o GFP. Registra un numero sufficiente di immagini per effettuare misurazioni in 60 celle per ogni drenaggio. Passa a una nuova camera di crescita con cellule fresche.

Dopo 60 minuti di imaging, aprire un'immagine nel programma Zeen Light Edition per misurare la distanza tra i segnali di diversi fluorofori sullo stesso piano focale. Apri lo strumento di misurazione e regola l'intensità della luce e il contrasto per identificare il centro di ciascun segnale fluorescente, ad esempio il corpo del palo del fuso e la membrana nucleare, e misurare la distanza tra di loro. Trasferire i dati in un foglio del blocco note.

Confronta le distanze subcellulari medie o mediane tra diversi ceppi e trattamenti utilizzando software statistici o test come il T-test o il test della somma Man Whitney Rank. In questo ceppo di esempio, PJ 1 18 5 è stato coltivato in EMM e un campione è stato posto in una camera di crescita per l'imaging. Poi un'aliquota di PJ 1 18 5.

La coltura è stata trasferita in EMMN e incubata per 15 minuti prima che un campione venisse inserito in una camera di crescita per l'imaging. Lo strumento di misura è stato utilizzato per misurare la distanza tra il locus e il corpo del polo del fuso, nonché tra il locus e la membrana nucleare. Come mostrato qui, c'era una differenza statisticamente significativa nella distanza del cluster genico che si allontanava dalla membrana nucleare verso il corpo del polo del fuso nelle cellule affamate di azoto rispetto alle cellule cresciute in azoto.

I dati che misuravano la distanza tra la GFP e la SBP avevano una distribuzione normale, e quindi le distanze medie potevano essere confrontate utilizzando un test T. C'era una differenza significativa tra i due valori medi. I dati che misuravano la distanza tra la GFP e la NM non avevano una distribuzione normale, e quindi le distanze mediane sono state confrontate utilizzando un test della somma classificata di Man Whitney.

C'è stata una differenza significativa tra i due valori mediani A seguito di questa procedura. Altri metodi, come la PCR in tempo reale, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande su come il livello di espressione genica sia correlato ai cambiamenti nell'organizzazione subnucleare.