Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission
23 gennaio 2012
Il lievito di fissione, Schizosaccharomyces pombe, È un sistema ottimo modello per studiare i processi cellulari di base. Qui si descrive un metodo per eseguire l'analisi quantitativa di cellule vive di lievito di fissione. In questo esperimento particolare ci concentriamo sulla organizzazione del genoma all'interno del nucleo cellulare, ma il metodo può essere utilizzato anche per studiare i fattori citosolici.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare quantitativamente l'organizzazione subnucleare nelle cellule di lievito e come questa viene influenzata da cambiamenti nelle condizioni di crescita o da mutazioni. Questo viene ottenuto coltivando le cellule di lievito in fase logaritmica in condizioni che minimizzano la fluorescenza intrinseca. Successivamente, le cellule vengono posizionate in una camera di crescita per essere osservate al microscopio.
Successivamente vengono acquisite immagini per misurare la distanza tra diverse strutture marcate con fluorescenza nella cellula. Si ottengono risultati che mostrano differenze nell'organizzazione non nucleare, dipendenti dalle variazioni delle condizioni nutrizionali durante la crescita della coltura di lievito. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epie riguardo l'interazione tra l'organizzazione subnucleare o della cromatina e la regolazione genica.
Per iniziare, preparare il mezzo minimo di Edimburgo, o EMM, e EMM con cloruro di ammonio per ridurre l'autofluorescenza anziché sottoporre a sterilizzazione in autoclave. Sterilizzare la soluzione di glucosio mediante un filtro da 0,2 micron e aggiungerla ai mezzi sterilizzati in autoclave. Inoculare tre millilitri di EMM in provette da 30 millilitri con cellule di fish e lievito.
Frescamente coltivati su una piastra in agar in mezzo ricco, YEA chiudere leggermente i tubi e incubare le cellule in agitazione a 225 RPM e 30 gradi Celsius. Mantenere le cellule in fase logaritmica per due giorni, contandole ogni mattina e sera con una camera di Birkhauser e diluendole alla densità appropriata. Il giorno dell'esperimento.
Le cellule devono essere in fase logaritmica iniziale rispetto alla carenza di azoto. Le cellule vanno trattate secondo la procedura descritta nel protocollo scritto per raccogliere le cellule in un unico pellet sul fondo di una provetta da centrifuga: 1,5 millilitri di cellule in una provetta eppendorf devono essere centrifugati a un massimo di 1,5 RCF, prima ruotando la provetta per due minuti, quindi ruotandola di 180 gradi e centrifugando per altri due minuti. Rimuovere tutto il soprannatante tranne 10-15 microlitri e risospendere le cellule nel mezzo residuo, aggiungendo un'aliquote di lectina filtrata e sterilizzata a una concentrazione di un milligrammo per millilitro.
Aggiungere cinque microlitri di soluzione di lectina all'angolo del vetrino coprioggetto e aggiungere cinque microlitri di coltura alla goccia di lectina. Per creare una camera di crescita di cellule S pom base, pipettare cinque microlitri di EMM su un vetrino pulito e capovolgere il vetrino coprioggetto con la coltura a un angolo di 70 gradi sopra il mezzo, quindi lasciarlo cadere con la parte superiore verso il basso sull'EMM per sigillare i bordi con grasso al silicone. Tagliare l'estremità larga di una punta da 200 microlitri e collegare l'estremità stretta a una siringa da due millilitri.
Riempire la siringa con circa un millilitro di grasso siliconico. Applicare una sottile linea di silicone ai bordi del vetrino coprioggetto spingendo delicatamente il pistone della siringa per immaginare la camera di crescita. Iniziare utilizzando l'immagine in campo chiaro per localizzare le cellule e scavare.
Ottenere un'immagine nitida per la microscopia confocale. Utilizziamo un microscopio a scansione laser Zeiss LSM 700 con un obiettivo a immersione in olio plan-apocromatico 63x e un'impostazione di scansione media su 16 linee. Impostare le unità di area da 1 a 1,1 per ottenere una sezione ottica di 0,8 micron.
Scansiona le cellule con laser che rilevano Alexa 488 e mCherry o GFP. Registra un numero sufficiente di immagini per effettuare misurazioni su 60 cellule per ogni condizione. Passa a una nuova camera di crescita con cellule fresche.
Dopo 60 minuti di acquisizione delle immagini, aprire un'immagine nel programma Zeen Light Edition per misurare la distanza tra i segnali di diversi fluorocromi nello stesso piano focale. Aprire lo strumento di misurazione e regolare l'intensità della luce e il contrasto per identificare il centro di ciascun segnale fluorescente, ad esempio il corpo del polo mitotico e la membrana nucleare, e misurare la distanza tra di essi. Trasferire i dati in un foglio di blocco note.
Confrontare le distanze subcellulari medie o mediane tra diversi ceppi e trattamenti utilizzando software statistici o test come il test T o il test di somma dei ranghi di Mann-Whitney. In questo esempio, il ceppo PJ 1 18 5 è stato coltivato in EMM e un campione è stato collocato in una camera di crescita per l'acquisizione di immagini. Successivamente, un'aliquote di PJ 1 18 5.
La coltura è stata trasferita in EMMN e incubata per 15 minuti prima di posizionare un campione nella camera di crescita per l'acquisizione delle immagini. È stato utilizzato uno strumento di misura per determinare la distanza tra il locus e il corpo del polo mitotico, nonché tra il locus e la membrana nucleare. Come mostrato qui, esiste una differenza statisticamente significativa nella distanza con cui l'aggregato genico si sposta dalla membrana nucleare verso il corpo del polo mitotico nelle cellule sottoposte a carenza di azoto rispetto alle cellule cresciute in presenza di azoto.
I dati che misuravano la distanza tra GFP e SBP presentavano una distribuzione normale, pertanto le distanze medie sono state confrontate utilizzando un test T. È stata osservata una differenza significativa tra i due valori medi. I dati che misuravano la distanza tra GFP e NM non presentavano una distribuzione normale, pertanto le distanze mediane sono state confrontate utilizzando un test di somma dei ranghi di Mann-Whitney.
È stata osservata una differenza significativa tra i due valori mediani seguendo questa procedura. Altri metodi, come la PCR in tempo reale, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande su come il livello di espressione genica si correla ai cambiamenti nell'organizzazione subnucleare.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo per l'analisi quantitativa di cellule vive del lievito da fissione, Schizosaccharomyces pombe, concentrandosi sull'organizzazione del genoma all'interno del nucleo cellulare. Il metodo consente ai ricercatori di indagare come l'organizzazione subnucleare sia influenzata dalle condizioni di crescita e da mutazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Genetica
- Microbiologia
Sfondo
- Schizosaccharomyces pombe funge da organismo modello per lo studio dei processi cellulari.
- Comprendere l'organizzazione del genoma è fondamentale per ottenere informazioni sulla regolazione genica.
- Le tecniche di imaging su cellule vive possono rivelare strutture cellulari dinamiche.
- Le variazioni nelle condizioni di crescita possono influenzare l'organizzazione cellulare.
Scopo dello studio
- Misurare quantitativamente l'organizzazione subnucleare nelle cellule di lievito.
- Valutare l'impatto delle condizioni nutrizionali e delle mutazioni sull'organizzazione del genoma.
- Fornire un metodo per lo studio della dinamica della cromatina e della regolazione genica.
Metodi Utilizzati
- Le cellule di lievito vengono coltivate in un mezzo minimo fino alla fase logaritmica.
- Le cellule vengono preparate per l'analisi mediante microscopia confocale utilizzando una camera di crescita.
- Le strutture marcate con fluorescenza vengono analizzate per misurare le distanze tra di esse.
- Viene effettuata un'analisi statistica per confrontare le distanze in diverse condizioni.
Risultati principali
- Sono state osservate differenze significative nell'organizzazione subnucleare in condizioni di crescita variabili.
- Le misurazioni delle distanze tra i segnali fluorescenti hanno indicato cambiamenti nella posizione della cromatina.
- Test statistici hanno confermato la significatività delle differenze osservate.
- Il metodo fornisce informazioni sulla relazione tra organizzazione subnucleare ed espressione genica.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è efficace per lo studio dell'organizzazione del genoma nel lievito della fissione.
- I risultati evidenziano l'influenza dei fattori ambientali sulla dinamica della cromatina.
- Questo approccio può essere applicato per indagare ulteriormente i meccanismi di regolazione genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia a fluorescenza quantitativa su cellule vive nel lievito di fissione consente misurazioni precise dell'organizzazione subnucleare e della sua risposta dinamica ai cambiamenti ambientali. Questa capacità è fondamentale per ridurre i rischi associati alle ipotesi iniziali della scoperta riguardo l'architettura della cromatina e la regolazione genica. Il metodo fornisce un livello predittivo di affidabilità nella validazione degli obiettivi e orienta le decisioni di portafoglio all'intersezione tra biologia cellulare e genomica funzionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dell'organizzazione della cromatina e del suo impatto sulla regolazione genica in condizioni definite.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli quantificando la dinamica spaziale del genoma in risposta a perturbazioni.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica per ipotesi che collegano l'architettura nucleare a cambiamenti nell'espressione genica.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Stabilisce sistemi validati di imaging su cellule vive per la misurazione riproducibile di distanze subcellulari.
- Facilita la standardizzazione dei saggi attraverso output quantitativi e statisticamente analizzabili.
- Permette lo screening di modificatori genetici o ambientali che influenzano l'organizzazione nucleare.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i cambiamenti nella localizzazione subnucleare a eventi di induzione genica rilevanti per modelli di malattia.
- Supporta la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica collegando la dinamica della cromatina a letture funzionali.
- Fornisce una valutazione predittiva per la riduzione dei rischi nello sviluppo di biomarcatori traslazionali quando è implicata la posizione della cromatina.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di imaging quantitativo si integra nel percorso della scoperta, dal test iniziale delle ipotesi alla validazione di modelli preclinici, sostenendo sia studi meccanicistici che ricerche traslazionali.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi sulle relazioni tra organizzazione della cromatina e regolazione genica.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per confrontare condizioni genetiche o ambientali.
- Analisi dati: Offre misurazioni statisticamente solide (distanze medie, mediane) per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i cambiamenti nell'architettura nucleare all'induzione genica, rilevante per la modellizzazione delle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per l'analisi quantitativa e l'immagine in tempo reale di cellule vive in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla regolazione genica.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro di imaging su cellule vive e garantisce la riproducibilità dei risultati quantitativi.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati solidi sulle dinamiche della cromatina e sulle relazioni con l'espressione genica.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli e dei percorsi in base ai rischi, basandosi su dati quantitativi sull'organizzazione nucleare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging di cellule vive, nella microscopia a fluorescenza e nell'analisi quantitativa delle immagini.
- Richiede l'accesso a microscopia confocale e a software analitici compatibili per le misurazioni delle distanze.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di imaging e dei metodi di analisi statistica.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per ceppi di lievito diversi o per sistemi modello con background genetici differenti.
- I limiti pratici includono la gestione dell'autofluorescenza e la garanzia di una dimensione del campione sufficiente per ottenere potenza statistica.
