Chip microfluidico per la costruzione di modelli di lesioni assonali e l'abilitazione dell'analisi multi-omica

Abbiamo sviluppato chip microfluidici su larga scala per consentire l'analisi multiomica, con l'obiettivo di illustrare il meccanismo metabolico dei neuroni in seguito a danno assonale. Utilizziamo principalmente la tecnologia microfluidica, l'analisi del flusso metabolico e la trascrittomica per far progredire la ricerca sui meccanismi metabolici dei neuroni durante il danno assonale e la rigenerazione. Abbiamo scoperto che ci sono differenze metaboliche tra i neuroni corticali in diverse malattie dello sviluppo e che i giovani neuroni subiscono un rimodellamento metabolico dopo una lesione esterna.

Il vantaggio principale del nostro protocollo risiede nella progettazione della piattaforma microfluidica su larga scala e negli standard operativi, che consentono una multiomica accurata e dimensioni di milioni di cellule. Per iniziare, trasferire la base PDMS e l'agente indurente in una provetta da centrifuga. Mettere la provetta da centrifuga contenente la miscela in un agitatore centrifugo.

Centrifugare a 2.000 g per quattro minuti due volte per mescolare e degassare. Versare da 13 a 15 grammi di PDMS degasato nello stampo microfluidico, assicurandosi che il fondo dello stampo sia completamente coperto. Ora, posiziona lo stampo in un essiccatore a vuoto, quindi usa una pompa a vuoto per evacuare l'aria per cinque-10 minuti per rimuovere completamente le bolle dal PDMS.

Utilizzando un bulbo di gomma, picchiettare delicatamente la superficie del PDMS per rompere le bolle superficiali rimanenti. Trasferire lo stampo in un forno ventilato e infornare a 80 gradi Celsius per 100 minuti per polimerizzare il polidimetilsilossano. Una volta che il PDMS è completamente indurito, far scorrere delicatamente la punta di un bisturi sotto il bordo del PDMS per sollevarlo e separarlo con cautela dallo stampo.

Utilizzando un punzone per biopsia con un diametro compreso tra 2,0 e 2,5 millimetri, creare dei fori nel PDMS per l'infusione del terreno di coltura e il caricamento delle cellule. Rimuovere eventuali impurità superficiali dal PDMS utilizzando del nastro adesivo, quindi posizionarlo in un piatto di vetro pulito e avvolgerlo con un foglio di alluminio per la conservazione. Prima dell'esperimento, sterilizzare in autoclave il dispositivo microfluidico a 121 gradi Celsius e 101 kilopascal per cinque minuti per garantire la sterilità.

Posizionare un vetrino coprioggetto destinato ai dispositivi microfluidici convenzionali in un piatto di coltura da 35 millimetri. Aggiungere due millilitri di soluzione di poli-D-lisina da 0,1 milligrammi per millilitro al piatto. Incubare la capsula a 37 gradi Celsius per sei ore o durante la notte.

Dopo l'incubazione, recuperare con cura la soluzione di poli-D-lisina per il riutilizzo o il corretto smaltimento. Ora, aggiungi due millilitri di acqua ultrapura sterile al piatto. Ruotalo 50 volte in senso orario, seguito da 50 volte in senso antiorario.

Aspirare l'acqua utilizzando una pompa a vuoto collegata a un puntale per pipetta sterile, raccogliendo i rifiuti in un contenitore per rifiuti liquidi. Al termine di tutti i lavaggi, lasciare asciugare naturalmente i vetrini di copertura in una cabina di biosicurezza prima dell'uso. Utilizzando una pinza sterile a punta fine, posizionare il chip microfluidico autoclavato al centro della superficie del vetro con i microcanali rivolti verso il basso.

Premere delicatamente il chip sulla superficie del vetro utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri per garantire un'adesione completa. Quindi, segna la camera sinistra con un punto usando un pennarello indelebile per designare il compartimento del soma. Aspirare 10 microlitri di sospensione neuronale con una pipetta da 10 microlitri, quindi erogare lentamente la sospensione nella porta di caricamento sopra lo scomparto soma contrassegnato.

Verificare il corretto flusso del fluido nel serbatoio inferiore della camera sinistra. Trasferire il piatto di coltura in un'incubatrice umidificata impostata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 20 minuti. Dopo l'incubazione, posizionare la piastra sotto un microscopio 20X per confermare la profusione del terreno dal compartimento soma al compartimento assonale attraverso i microcanali.

Ora, pipettare 150 microlitri di terreno basale neuronale nella porta superiore del compartimento assonale. Allo stesso modo, aggiungere 150 microlitri di terreno neuronale completo alla porta superiore del compartimento del soma. Quindi, versare 20 millilitri di acqua ultrapura in un piatto di coltura da 150 millimetri per creare una camera di umidità.

Posizionare il piatto di coltura da 35 millimetri all'interno del piatto grande, quindi trasferire l'intero sistema di coltura nell'incubatrice e mantenere la manutenzione per la durata richiesta. Utilizzare una piastra di Petri larga 10 centimetri per il posizionamento del dispositivo microfluidico su larga scala. Scegli il canale completo o la semina del canale a intervalli in base alle esigenze sperimentali, poiché ogni metodo richiede diversi protocolli di lesione assonale.

Al termine della semina, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura neuronale completo alla piastra di Petri per mantenere la crescita dei neuroni. Trasferire una quantità appropriata di terreno basale neuronale in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri per un uso successivo. Posizionare un dispositivo microfluidico contenente neuroni corticali su un banco pulito.

Utilizzando carta priva di lanugine, asciugare il fondo del piatto di coltura da 35 millimetri, quindi utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aspirare il terreno dai due fori sul lato destro del dispositivo microfluidico. Quindi, collegare un tubo della pompa per vuoto a un puntale per pipetta sterile e senza filtro da 200 microlitri. Accendere la pompa del vuoto a una velocità di aspirazione di 60 litri al minuto e puntare la punta verso il punto di connessione tra il foro inferiore della camera terminale dell'assone e la camera per aspirare il vecchio fluido, causando la rottura dell'assone a causa della pressione negativa.

Riposizionare il puntale della pipetta e aspirare 150 microlitri di terreno basale neuronale, aggiungendolo lentamente attraverso il foro inferiore della camera destra. Dopo l'esecuzione dell'aggiunta e dell'aspirazione quattro volte, sostituire con un nuovo mezzo neuronale completo, quindi aspirare il vecchio mezzo dal foro laterale del corpo cellulare e aggiungere un nuovo mezzo neuronale completo contenente farmaci, se necessario. Posizionare il dispositivo microfluidico insieme alla piastra di coltura in una piastra di coltura da 150 millimetri e continuare la coltura per il tempo richiesto, ad esempio 24 ore.

Per la lesione assonale manuale, seminare i neuroni in tutte le camere del dispositivo microfluidico su larga scala. Incubare il dispositivo a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica per tre giorni. Il settimo giorno in vitro, rimuovere il piatto di coltura contenente il dispositivo microfluidico dall'incubatore e posizionarlo su un tavolino sterile.

Preparare un microscopio con ingrandimento 20X e sterilizzare l'area di lavoro utilizzando etanolo al 75%. Tenere in mano un puntale per pipetta filtrato sterile da 10 microlitri e identificare i fasci di assoni nei microcanali originali sotto la guida del microscopio. Eseguire graffi longitudinali lungo ciascun fascio di assoni utilizzando la punta della pipetta.

Osservare la rottura dell'assone al microscopio in tempo reale. I microcanali di un dispositivo microfluidico standard consentono la crescita degli assoni, ma non del soma, come confermato dalla colorazione con tubulina beta tre a sette giorni in vitro. La densità neuronale non ha mostrato differenze significative dopo la lesione assonale, indicando che non c'è morte neuronale osservabile.

Per le analisi multiomiche è stato sviluppato un dispositivo microfluidico su larga scala con un design tridimensionale espandibile. Sia le repliche PDMS non perforate che quelle perforate hanno aderito saldamente a piatti da 10 centimetri o schede PC. Il danno assonale indotto dal graffio della punta della pipetta ha portato a assoni chiaramente recisi con morfologia interrotta, in contrasto con gli assoni intatti prima della lesione.

La rigenerazione assonale è stata osservata sia a sei ore che a 24 ore dopo la lesione, mentre gli assoni illesi sono rimasti stabili. La concentrazione di proteine neuronali è aumentata significativamente da 1420,4 microgrammi per millilitro al basale a 1748,9 per millilitro a sei ore e 1823,7 microgrammi per millilitro a 24 ore dopo l'infortunio. Le rese di RNA dai gruppi di controllo e dai gruppi danneggiati dagli assoni erano quasi identiche.

Il sequenziamento dell'RNA ha rivelato 595 geni specifici per le lesioni e 609 geni specifici per il controllo, con 17.471 geni condivisi tra i gruppi. L'analisi del percorso KEGG ha identificato una significativa sovraregolazione della fosforilazione ossidativa, della risposta delle specie reattive dell'ossigeno, dell'autofagia e delle vie del ciclo del TCA dopo l'infortunio.