Utilizzando Chips microfluidica per l'imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in Drosophila Larve
7 febbraio 2014
Drosophila larve sono un sistema modello attraente per l'imaging dal vivo a causa della loro cuticola trasparente e potenti genetica. Questo protocollo descrive come utilizzare un dispositivo PDMS singolo strato, chiamato il 'chip di larva' per l'imaging dal vivo di processi cellulari all'interno dei neuroni di 3 ° instar larve di Drosophila.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di immobilizzare in modo non invasivo le larve di drosophila per l'imaging dal vivo utilizzando una camera microfluidica modificata. Un terzo nelle larve stellate è posizionato nel chip con un po' di olio per aiutare a sigillare le larve. Successivamente, il chip viene posizionato sopra le larve in modo tale che il suo corpo si adatti all'interno della camera.
Il chip è collegato a una siringa in modo che possa essere applicato un vuoto. La motilità delle larve si limita e le strutture nella parte ventrale dell'animale vengono spinte vicino al vetrino. Utilizzando un microscopio confocale, le strutture sono facilmente visualizzabili, come i dettagli dei terminali degli assoni dei neuroni sensoriali e la rigenerazione dei nervi segmentali dopo un danno nervoso indotto.
Altri metodi per immobilizzare Josepha per l'imaging dal vivo, l'etere di cloroformio enorme o gli anestetici ISO. Il vantaggio principale di questa tecnica è che evita l'enorme quantità di tali tossine, che interferiscono con la fisiologia dell'animale. E un ulteriore vantaggio dell'assenza di tossine è che la larva GB è sicura e con cui lavorare La robusta immobilizzazione consente l'imaging di eventi rapidi come un trasporto assonale più veloce e cambiamenti nel calcio intracellulare.
Una singola larva può essere immobilizzata e ripresa nel chip più volte. Ciò consente una vita nel tempo. Imaging dei processi che si svolgono nel corso di un massimo di 72 ore Inizia ottenendo un chip PDMS campione per provare questo protocollo.
Le istruzioni su come realizzare il chip A-P-D-M-S da uno stampo SU eight possono essere lette nel protocollo di testo utilizzando un ago di erogazione calibro 21. Praticare un foro nella porta del vuoto del chip PDMS per un microscopio invertito. Rimuovere un ago calibro 23 dalla sua base, il mozzo del blocco usando alcune rotazioni.
Quindi inserire la punta dell'ago in un piccolo pezzo di tubo di polietilene in modo che il tubo copra almeno un millimetro dell'ago. Usa una lama di rasoio per tagliare il tubo in eccesso. Questo lascia un anello di plastica che può creare un sigillo.
Inserire la punta dell'ago calibro 23 nel foro della porta del vuoto. Per un microscopio verticale, praticare un secondo foro sul lato del chip PDMS con un ago di erogazione calibro 21. Questo foro fornirà l'accesso al primo foro dal lato.
Quindi inserire la punta dell'ago calibro 23 e l'anello del tubo nel foro laterale. Posiziona un pezzo di nastro biadesivo sopra il chip PDMS per sigillare il foro superiore. Collegare un tubo di polietilene lungo 20 centimetri tra la punta dell'ago inserita nella porta del vuoto del chip e una delle porte di una valvola a tre vie.
Quindi collegare una siringa da 20 millilitri in una delle due porte rimanenti della valvola lasciando aperta l'ultima porta. Pulire il chip PDMS con nastro adesivo trasparente. Attacca un pezzo di nastro adesivo alla parte inferiore del chip.
Assicurarsi che il nastro tocchi l'intera superficie del PDMS, quindi staccare il nastro. Ripetere questo metodo di pulizia tre volte. Poiché il chip PDMS è riutilizzabile, è molto importante rimuovere i residui di olio in quanto possono influire sull'adesione del PDM al vetro Trasferimento precoce del foraggiamento.
Larve di terzo stadio dal cibo a una capsula di Petri contenente acqua. Deve essere lungo tra 3,5 e quattro millimetri per adattarsi correttamente al chip. Fare il bagno alle larve per rimuovere il terreno di coltura.
Successivamente, riproduce una piccola goccia di olio halo carbon 700 al centro di un vetrino coprioggetti utilizzando una pinza, raccoglie delicatamente una larva lavata. Posizionalo brevemente su una salvietta leggera per asciugarlo, quindi spostalo nell'olio per 10 secondi. La goccia dovrebbe essere abbastanza piccola in modo che la trachea delle larve non sia rivestita.
Quindi posizionare brevemente le larve su un vetrino di vetro pulito e spostarlo su un altro vetrino coprioggetti. Togliendo così un po' più di olio. Prestare attenzione all'orientamento delle larve per visualizzare il cordone neurale e i nervi segmentali.
Il lato ventrale dovrebbe essere rivolto verso il basso. I tubi tracheali prontamente identificabili devono essere rivolti verso l'alto. Ora posiziona delicatamente il chip PDMS sopra le larve.
Allineare le larve al centro della microcamera. Con la parte posteriore orientata verso la porta del vuoto, la larva non deve toccare i bordi della camera. Una volta allineato, spingere il chip PDMS contro il vetrino di copertura per ottenere una buona tenuta.
Quindi ricontrolla che le larve siano interamente racchiuse nella microcamera. Ora sposta la valvola a tre vie sulla siringa. Tenere fermo il gruppo PDMS e tirare lo stantuffo della siringa per aspirare da due a 2,5 millimetri di aria fino a quando non si avverte resistenza.
Creando così un vuoto. Quindi chiudere la valvola. Per mantenere il vuoto con attenzione, ricontrolla le larve.
Il suo corpo deve essere immobilizzato all'interno della microcamera e la trachea deve essere visibile. Il resto del chip PDMS dovrebbe essere a contatto con il vetrino coprioggetto Orientamenti come questi non sono corretti. Ora immagina le larve.
Se si utilizza un microscopio verticale, fissare il lato superiore del chip al tavolino con del nastro biadesivo. Al termine dell'imaging, rilasciare il vuoto. Quindi staccare il chip PDMS dal vetrino coprioggetto.
La larva deve essere immediatamente mobile usando il forcipe. Rimetti le larve su una piastra di agar per succo d'uva per il recupero. Metti una singola larva anestetizzata su una piastra di agar per succo d'uva.
Sotto lo stereomicroscopio, capovolgere l'animale con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Per visualizzare il cordone nervoso ventrale e i nervi segmentali, assicurarsi che la larva sia completamente immobile. Localizzare il cordone nervoso e le ghiandole salivari.
È importante non danneggiare queste strutture. Individua la fine del terzo segmento addominale. La ferita qui danneggia la maggior parte dei nervi ed è la più facile da riprodurre senza uccidere l'animale.
La lesione può anche essere condotta in più segmenti posteriori utilizzando un duo star numero cinque, il forcipe. Pizzica saldamente i nervi segmentali attraverso la cuticola per cinque-10 secondi. Se fatto correttamente, la cuticola rimane intatta e la parete del corpo non viene perforata.
La padronanza richiederà pratica dopo che l'infortunio ha posizionato l'animale con il lato ventrale rivolto verso il basso sul grande piatto. Dovrebbe essere in grado di muovere la testa e mangiare. Se la lesione ha avuto successo, la metà posteriore delle larve sarà paralizzata.
Il chip larvale è stato utilizzato per visualizzare il trasporto mediato dalla chinesina delle vescicole sinaptiche all'interno dei singoli assoni periferici. Il movimento di grado entero di queste vescicole è stato misurato a circa 1,0 micron al secondo. Il movimento retrogrado è stato cronometrato a 0,8 micron al secondo.
La tecnica di immobilizzazione è stata utilizzata per la microchirurgia laser utilizzando un laser a colorante UV pulsato. I livelli di calcio sono stati osservati in neuroni specifici grazie a un indicatore geneticamente codificato. Campo G 3.0 un picco di calcio viene rilevato dopo un neurone sensoriale.
Il dendrite è sezionato. Consentire all'animale di riposare tra le sessioni di imaging consente di visualizzare gli eventi cellulari nel tempo. Dopo aver frantumato gli assoni dei motoneuroni emerici, il moncone dell'assone prossimale ha subito una nuova germinazione.
Nel frattempo, gli assoni distali hanno formato varici e si sono frammentati attraverso il processo di degenerazione walleriana. È anche possibile utilizzare il tracciamento del chip larva di proteine fluorescenti fotoconvertite in vivo. Una proteina di fusione della tubulina alfa DRA due espressa nei neuroni sensoriali di quarta classe è stata fotoconvertita nei corpi cellulari.
Entro due giorni, una quantità significativa di proteina fotoconvertita è stata ricollocata ai terminali assonici dei neuroni sensoriali a circa un millimetro di distanza dalla posizione originale nel corpo cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il chip delle larve per l'imaging dal vivo delle larve di drosophila e come condurre una lesione da schiacciamento nervoso. Una volta padroneggiate queste tecniche, le larve possono essere posizionate al microscopio in pochi minuti.
Lo schiacciamento nervoso è altrettanto rapido. Pertanto, queste procedure possono essere utilizzate per esperimenti su larga scala, come i diplomi genetici. Il chip può essere utilizzato per visualizzare le strutture sul lato ventrale delle larve di drosophila.
Questi includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, i muscoli, le sinapsi della giunzione neuromuscolare, i neuroni sensoriali, i nervi periferici e il cordone nervoso ventrale. Questa procedura può essere utilizzata anche per condurre immagini dal vivo del cuore larvale, delle ghiandole salivari e della trachea. Il chip larvale utilizzato in questo video ha dimensioni comprese tra 3,5 e quattro millimetri di lunghezza.
Per l'imaging è più piccolo o più grande, è possibile realizzare facilmente chip per animali con una camera più piccola o più grande. Vedere il file di progettazione supplementare e le istruzioni per la realizzazione di chip PDMS. Le istruzioni per la realizzazione dei chip PDMS sono incluse nel protocollo scritto.
Possiamo inviarti un chip campione se ci contatti.
Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo per immobilizzare non invasivamente le larve di Drosophila per l'imaging in vivo utilizzando una camera microfluidica modificata. La tecnica permette l'osservazione dei processi cellulari all'interno dei neuroni, in particolare nel contesto del trasporto assonale e della rigenerazione nervosa.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Tecniche di imaging in vivo
Sfondo
- Le larve di Drosophila sono un modello prezioso per lo studio dei processi neuronali grazie alla loro trasparenza e trattabilità genetica.
- L'imaging in vivo può fornire informazioni su eventi cellulari dinamici in tempo reale.
- I metodi tradizionali di immobilizzazione spesso coinvolgono anestetici nocivi che possono influenzare la fisiologia.
- Questo protocollo mira a fornire un'alternativa più sicura per l'imaging senza sostanze tossiche.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo non invasivo per immobilizzare le larve di Drosophila per l'imaging.
- Facilitare l'osservazione delle strutture e dei processi neuronali.
- Consentire ripetute sessioni di imaging della stessa larva su periodi prolungati.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di un dispositivo microfluidico PDMS per immobilizzare le larve.
- Applicazione di un vuoto per limitare la motilità larvale.
- Imaging utilizzando un microscopio confocale per visualizzare le strutture neuronali.
- Preparazione dettagliata del chip PDMS e posizionamento larvale per un imaging ottimale.
Risultati principali
- Immobilizzazione con successo delle larve senza l'uso di anestetici tossici.
- Imaging chiaro dei terminali assonali dei neuroni sensoriali e della rigenerazione dei nervi segmentali.
- Capacità di condurre imaging time-lapse per 72 ore.
- Dimostrazione del trasporto mediato da cinesina delle vescicole sinaptiche.
Conclusioni
- La camera microfluidica modificata fornisce un metodo sicuro ed efficace per l'imaging in vivo delle larve di Drosophila.
- Questo approccio permette lo studio di eventi neuronali rapidi e processi di recupero.
- Il protocollo può essere adattato per varie applicazioni di imaging nella ricerca in neuroscienze.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Non-invasive immobilization of model organisms enables longitudinal imaging of dynamic cellular processes without pharmacological confounders, supporting mechanistic de-risking in target validation. The larva chip facilitates repeated imaging sessions over 72 hours, allowing assessment of axonal transport, injury responses, and regeneration in a physiologically relevant system. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving native biology during observation of neuronal dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of axonal transport and calcium signaling in neurons.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing repeated imaging of the same larva to assess target engagement and pathway modulation over time.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts of organelle trafficking and injury-induced responses, improving target confidence in neuroscience discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by immobilizing larvae for consistent, high-resolution imaging of ventral structures.
- Reproducibility: Enables standardized preparation and sealing of larvae in PDMS microchambers, reducing variability in live imaging assays.
- Scalability: Facilitates rapid immobilization and imaging cycles, supporting medium-throughput evaluation of genetic or pharmacological perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models axonal injury and regeneration processes relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery imaging with preclinical validation by enabling time-lapse studies of Wallerian degeneration and axonal sprouting.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying regenerative versus degenerative responses to nerve crush injury.
Pipeline & Workflow Integration
The larva chip integrates into early discovery workflows by enabling live imaging of neuronal processes prior to lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in Drosophila-based models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through direct imaging of kinesin-mediated vesicle transport and calcium fluxes in sensory neurons.
- Screening: Delivers assay readiness via reproducible immobilization and ventral-side proximity to coverslip for consistent imaging.
- Analytics: Enables quantitative measurement of axonal transport rates (1.0 µm/s anterograde, 0.8 µm/s retrograde) and calcium spike detection using genetically encoded indicators.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling axonal injury responses, including sprouting and fragmentation, over extended time courses.
- Enterprise Reuse: Positions the PDMS microfluidic chip as a reusable platform for longitudinal studies across multiple experimental sessions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enabling observation of rapid neuronal events without anesthetic-induced physiological disruption.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized chip preparation, vacuum-based immobilization, and cleaning protocols to prevent oil residue interference.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by allowing repeated use of single larvae, reducing animal numbers needed for longitudinal studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through quantifiable imaging of degeneration and regeneration metrics post-injury.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, vacuum system operation, and confocal microscopy for optimal imaging.
- Depends on access to PDMS molding tools, syringe-based vacuum ports, and polyethylene tubing for sealing and fluidic connections.
- Necessitates cross-team standardization of larval preparation, oil application, and chamber alignment to ensure consistent immobilization.
- Involves adaptation considerations for different larval sizes, requiring chip dimension adjustments based on body length (3.5–4 mm for standard chip).
- Includes practical limitations such as the need to avoid tracheal oil coating and ensure proper ventral-side orientation for nerve cord visualization.
