Name: Utilizzando Chips microfluidica per limaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in Drosophila Larve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Impara a immobilizzare larve di Drosophila per imaging dal vivo usando una camera microfluidica modificata. Questo metodo non invasivo consente di osservare il trasporto assonale e la rigenerazione dei nervi senza anestetici tossici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation, (codice di autorizzazione IOS-0.842.701 a CAC) e il National Institute of Health (R00MH080599 a DA, R21 NS062313 a NC, e NS069844 a CAC). Vorremmo riconoscere James Schutt, Emily Han, e Leni Truong per il supporto tecnico e il Bloomington Stock Center per linee di volo. Tutte le chips sono state realizzate presso l&#39;impianto di Lurie Nanofabrication presso l&#39;Università del Michigan.

1. Rendere il PDMS Chip Per fare un chip PDMS dallo stampo SU-8, seguire i passaggi 1,1-1,7. Se il chip è a portata di mano, ma deve assemblato per l&#39;uso, passare al punto 1.8. <ol><li> Mescolare 45 g di base di PDMS e 4.5 g di induritore (10:01 ratio) da un kit PDMS in un piccolo contenitore di plastica usa e getta e mescolare accuratamente con un bastoncino di plastica. </li><li> Mettere il recipiente in un contenitore vuoto (ad esempio un essiccatore) per 10 minuti per rimuovere eventuali bolle. </li><li> Collocare lo stampo SU-8 in fondo a 150 mm di diametro e piatto di plastica versare lentamente il composto PDMS sullo stampo. Fare attenzione a non generare bolle mentre versando il PDMS. </li><li> Curare le PDMS in un forno (o incubatore) a 650 ° C per 4 ore. </li><li> Togliere lo stampo PDMS/SU-8 curata dal forno e lasciate raffreddare per qualche minuto. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il PDMS vulcanizzati lungo il bordo della stampo SU-8 e staccarla dalla SU-8 stampo. </li><li> Dividere la lastra PDMSin singoli chip PDMS usando una lama di rasoio. </li><li> Utilizzando un ago di erogazione 21 G, fare un buco nella porta di aspirazione (illustrato nella Figura 1A) del chip PDMS. </li><li> Prendete una erogazione ago 23 G e ruotare la punta dell&#39;ago dalla sua base un paio di volte per rompere l&#39;ago punta fuori dal mozzo serratura. </li><li> Inserire la punta dell&#39;ago 23 G in un piccolo pezzo di tubo di polietilene in modo che il tubo copra almeno un millimetro dell&#39;ago. Quindi utilizzare una lama di rasoio per tagliare il tubo in eccesso lontano dall&#39;ago. Questo crea un anello di plastica intorno un&#39;estremità dell&#39;ago, che creerà una guarnizione quando inserito nella porta di aspirazione sotto vuoto. </li><li> Per l&#39;uso con un microscopio invertito (Figure 1B e 2A-B): inserire la punta dell&#39;ago 23 G nel foro della porta di aspirazione. Per l&#39;uso con un microscopio verticale (Figure 1C e 2C-D): colpire un secondo foro sul lato del chip PDMS con Vernice 21 Gnsing ago; questo foro fornirà accesso al primo foro dal lato. Quindi inserire la punta dell&#39;ago 23 G con l&#39;anello tubo nel foro laterale. Posizionare un pezzo di nastro biadesivo sopra la parte superiore del chip PDMS per sigillare il foro superiore (Figura 1C). </li><li> Prendete un pezzo di tubo in polietilene che è di circa 20 cm di lunghezza. Collegare un lato del tubo alla punta dell&#39;ago che viene inserito nella porta vuoto. </li><li> Collegare l&#39;altra estremità del tubo ad una delle porte di una valvola a 3 vie (vedi &#39;3 vie rubinetto &#39;nell&#39;elenco dei materiali) </li><li> Attaccare una siringa da 20 ml in una delle due porte rimanenti. L&#39;ultima porta è aperta per l&#39;ambiente. </li></ol> 2. Utilizzando la Larva Chip per Live Imaging <ol><li> Pulire il chip PDMS con nastro adesivo trasparente. Fissare un pezzo di nastro sul fondo del chip. Assicurarsi che il nastro sia a contatto con l&#39;intera superficie PDMS, e poi staccare il nastro. </li><li> Ripetere il passaggio precedente 2-3x per assicurarsi che nonsono particelle o olio (trattenuti dagli esperimenti precedenti) sulla superficie del chip PDMS. Poiché il chip PDMS è riutilizzabile, è molto importante rimuovere residui di olio in quanto può influenzare l&#39;adesione di PDMS al vetro e provocare tenuta insufficiente. </li><li> Trasferimento precoce (cioè di foraggiamento) 3 ° larve instar di una piastra di Petri contenente acqua. (Il foraggiamento 3 ° fase instar larve sono nel cibo, piuttosto che il lato del flaconcino cultura). Bagnare le larve in acqua per rimuovere terreno di coltura. </li><li> Prendete un bicchiere coprioggetto pulito e mettere una piccola goccia di Halocarbon 700 olio al suo centro. </li><li> Utilizzando pinze, delicatamente prendere un pulito, precoce messa in scena 3 ° instar larva dall&#39;acqua (la larva deve essere ~ 3,5-4 mm di lunghezza). Posizionare l&#39;animale brevemente un leggero pulire o tovagliolo di carta per rimuovere l&#39;acqua in eccesso e poi metterlo sulla goccia di petrolio. La goccia deve essere abbastanza piccolo tale che la trachea delle larve non sono rivestite. Lasciate che la sta larvay sulla goccia di olio per 10 sec. </li><li> Rimuovere la larva dalla goccia di olio e poi metterlo su un vetro coprioggetto pulito. </li><li> Trasferire la larva di un altro bicchiere coprioggetto pulito. Questo passaggio rimuove l&#39;olio in eccesso. </li><li> Prestare attenzione all&#39;orientamento larva. Per l&#39;imaging i nervi del midollo e segmentale neurali, il lato ventrale della larva dovrebbe sedersi sul vetrino. Il suo lato dorsale, caratterizzato da due tubi tracheali longitudinali, deve essere rivolto verso l&#39;alto. Nota: questo è l&#39;orientamento della larva preferisce naturalmente. </li><li> Posizionare delicatamente il chip PDMS sulla parte superiore della larva. La larva deve essere allineato al centro centro della microcamera, con la coda rivolta verso la porta di aspirazione. Fare attenzione che la larva non toccare i bordi della camera. Ciò è particolarmente importante per i terminali anteriori e posteriori tracheali. Nota: questo passaggio è meglio farlo sotto uno stereomicroscopio. </li><li> Spingere il circuito integrato PDMS contro il vetrino di vetro per ottenere una buona tenuta. Assicurarsi che la larva è interamentedelimitata dalla microcamera quando il chip PDMS è a contatto con il vetrino di vetro. </li><li> Commutare la valvola a 3 vie in modo che la siringa possa aspirare aria dalla microcamera PDMS (attraverso il tubo) per creare un vuoto. </li><li> Con una mano, tenere saldamente il vetrino chip di PDMS / vetro. Con l&#39;altra mano per tirare lo stantuffo della siringa. Prelevare 2-2,5 ml di aria, fino a sentire resistenza nel manico siringa, per creare il vuoto. Il vuoto produce una tenuta ottimale tra il chip PDMS, olio, e le interfacce coprioggetto e limita la mobilità della larva. </li><li> Commutare la valvola fuori tale che il chip di PDMS è isolato dalla siringa e dal contesto. Come risultato, un livello di vuoto relativamente stabile è mantenuta nella microcamera senza la necessità di tenere lo stantuffo della siringa. </li><li> Controllare la larva sotto lo stereoscopio per assicurarsi che l&#39;intero corpo animale viene posto all&#39;interno della microcamera, e che l&#39;animale è immobile. La trachea deve essere visibile. Il resto delChip PDMS dovrebbe essere in contatto con il coprioggetto. Nota: vedere le figure 2E e 2F esempi di animali immobilizzati correttamente nel chip. Alcuni orientamenti corretti sono riportati nelle figure 2G e 2H. </li><li> Posizionare il chip larva (chip di PDMS + vetrino di vetro) sul microscopio. Il chip larva, il tubo e la siringa deve essere maneggiato con cura per evitare il distacco del chip PDMS dal vetrino. Per un microscopio verticale, fissare il lato &#39;top&#39; del chip al palco microscopio con nastro biadesivo (Figura 1C). </li><li> Utilizzare un obiettivo ad alto ingrandimento (ad immersione in olio, 40-63X è raccomandato) per localizzare la struttura dell&#39;animale (s) di interesse ed eseguire imaging. In alcuni casi, un ingrandimento inferiore può essere necessarie per identificare la regione desiderata per l&#39;imaging prima di passare a maggiore ingrandimento. </li><li> Quando l&#39;imaging è completato, rilasciare il vuoto commutando la valvola nella posizioneche è aperta per l&#39;ambiente. </li><li> Staccare il chip PDMS dal vetrino. La larva deve essere immediatamente mobili. </li><li> Usare pinze per rimuovere la larva dalla microcamera e posizionare con cura la larva su una piastra di agar succo d&#39;uva per il recupero. </li></ol> 3. Indurre una lesione del nervo Crush di nervi larvale Segmentari <ol><li> Seguire passo 2.3 per isolare presto messo in scena 3 ° instar larve del genotipo desiderato. Come descritto al punto 2.3 bagnano le larve in acqua per rimuovere il cibo. </li><li> Utilizzare una stazione di anestesia norma fly di CO 2, con emissioni di CO 2 pad tenuto sotto uno stereomicroscopio dissezione, per sottomettere le larve. Le larve dovrebbe diventare immotile dopo il posizionamento di CO 2 pad per 1-2 min. </li><li> Ora posizionare un singolo larva anestetizzato su una piastra di agar succo d&#39;uva con lo stereomicroscopio. Girare il lato ventrale degli animali fino a visualizzare il cordone nervoso ventrale e segmentaria nervi attraverso la cuticola ( <strong&gt; Figura 3). Assicurarsi che la larva è completamente immotile. </li><li> Utilizzando Dumostar numero 5 pinze, pizzicare i nervi segmentali strettamente attraverso la cuticola per 5-10 sec. Quando questo è fatto correttamente, la cuticola rimane intatta e la parete del corpo non è forata. Nota: La lesione può essere condotta in diverse posizioni lungo l&#39;asse del corpo anteriore-posteriore, purché il cavo ventrale nervo, ghiandole salivari, intestino e non sono danneggiati. La posizione lesioni più efficace è verso la fine del segmento addominale 3a, come illustrato in Figura 3D. Infortunio in questa posizione danneggia la maggior parte dei nervi ed è il più facile da riprodurre senza uccidere l&#39;animale. </li><li> Dopo la lesione, ruotare l&#39;animale in modo che il suo lato ventrale sulla piastra uva. Dovrebbe essere in grado di muovere la testa e mangiare. Se l&#39;infortunio ha avuto successo, allora la parte posteriore della larva sarà paralizzato. </li><li> Mantenere gli animali feriti sulla piastra di agar succo d&#39;uva a 25 &amp;# 176, C per il tempo desiderato in base all&#39;obiettivo sperimentale. Per motoneuroni, il moncone prossimale comincia a germogliare entro 8-10 ore di lesioni 14, e il moncone distale inizia a degenerare entro 6-8 ore 15. Per la classe IV DA neuroni sensoriali, il moncone prossimale comincia a germogliare all&#39;interno di 4-6 ore, e l&#39;inizio moncone distale a degenerare entro 3-4 ore dopo l&#39;infortunio. Nota: con opportuni driver GAL4 e giornalisti fluorescenti, la germinazione e la degenerazione possono essere osservati nel chip larva (per esempio, vedere la Figura 6). </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Fare o di ottenere il chip larva: Il chip larva consiste in un blocco PDMS (la cosiddetta &#39;chip di PDMS&#39;) associato a un vetrino coprioggetto. Il protocollo al punto 1 descrive la procedura per effettuare e utilizzando chips larva, ipotizzando uno stampo SU-8 è disponibile. Lo stampo SU-8 è microfabbricati da fotolitograficamente patterning una spessa SU-8 strato fotosensibile 140 micron su un wafer di silicio (per i dettagli vedi Ghannad-Rezaie et al. 12). Come la microfabbricazione dello stampo SU-8 richiede l&#39;accesso ad attrezzature specializzate, si consiglia di ordinare da un impianto di microfabbricazione (ad es. L&#39;impianto LNF presso l&#39;Università del Michigan 14), o da una fonderia inviando loro la progettazione di chip che viene fornito come file supplementare. Se si vuole modificare la struttura del chip PDMS (ad esempio per l&#39;uso con larve di diverse dimensioni), con un programma CAD che gestisce i file DXF (es. Autocad) può essere utilizzato. Un SU-8 stampo può anche essere fatta in casa seguendo le istruzioni in Mondal et al. 27 Molti lettori potrebbero trovare conveniente di ottenere semplicemente un chip PDMS di esempio per provare la tecnica prima di fabbricare le proprie chips. Questo sarà reso liberamente disponibile su richiesta. L&#39;uso della microfluidica &#39;di chip larva&#39; per l&#39;imaging dal vivo: Il metodo di immobilizzazione nel chip larva evita l&#39;uso di anestetici, e invece coinvolge pressione, tramite l&#39;applicazione di un vuoto, per limitare i movimenti dell&#39;animale. Mentre gli animali possono sopravvivere immobilizzazione nel chip per più ore 12, un periodo di immobilizzazione più breve (5-15 min) è raccomandato. Questo è il tempo sufficiente per l&#39;imaging molti eventi cellulari di interesse, inclusi i cambiamenti nel calcio intracellulare, o trasporto assonale veloce. Questo è anche il tempo sufficiente per manipolazioni desiderati in animali vivi, come ad esempio a base di laser microchirurgia, photobleaching, e photoconverSion. Per studiare gli eventi longitudinalmente su un periodo di tempo più lungo in un singolo animale, gli animali possono essere inseriti nel chip e ripreso più volte, separati da periodi di riposo. Piastre di agar succo d&#39;uva sono ideali per il riposo tra le sessioni di imaging, in quanto forniscono una fonte di cibo semplice e umidità. Sessioni di imaging più influenzano la sopravvivenza delle larve a un certo punto, dal momento che ogni sessione comporta un certo rischio di danneggiare l&#39;animale (vedi parte 2 nella risoluzione dei problemi, qui di seguito). Gli animali possono essere ordinariamente ripreso&gt; 5 volte nel corso di due giorni con un tasso di sopravvivenza superiore al 50%. Poiché gli animali non sono anestetizzati, sono sani e mobili subito dopo il rilascio del vuoto nel chip. Non vi è quindi alcun bisogno di tempo di recupero tra le sessioni di imaging, così la spaziatura tempo tra le sessioni è flessibile e può essere regolato agli obiettivi dell&#39;esperimento. Risoluzione dei problemi: La tecnica più comune èfa causa con il circuito integrato larva e soluzioni consigliate sono le seguenti: (1) L&#39;animale si muove troppo. Troppo mobilità può interferire con gli obiettivi di imaging. I motivi più comuni per questo nel chip larva sono a) l&#39;animale è troppo piccolo per il chip, o b) la pressione di vuoto applicata durante la fase di immobilizzazione è compromessa. Il chip larva descritto in questo protocollo è stato progettato per l&#39;inizio graduale 3 ° instar larve. La dimensione ottimale per l&#39;animale è 3,5-4 mm di lunghezza (lungo l&#39;asse antero-posteriore). Per garantire che il livello di vuoto è sufficiente tirare la siringa 2-2,5 ml, o fino a sentire resistenza nel manico. Una indicazione che il vuoto sta lavorando è che piccole bolle nel canale perimetrale possono essere viste muoversi lentamente verso la sorgente di vuoto. Un&#39;altra indicazione è che il coprioggetto dovrebbe sempre viaggiare con il chip quando il chip viene sollevato dalla parte superiore (e questo è il metodo consigliato per trasportare la camerauna volta che le larve è posizionato e il vuoto è on). Il vuoto può essere compromessa se ci sono crepe nella tubazione, o in presenza di olio nel tubo. Questo può essere facilmente affrontata sostituendo il 23 G erogazione punta dell&#39;ago e tubo di polietilene-50 (da passaggi 1,6-1,14). (2) L&#39;animale muore dopo l&#39;imaging nel chip. La procedura è destinata a causare il minimo stress sulla animali, e gli animali di tipo selvatico genotipo hanno un tasso di sopravvivenza&gt; 90%, anche dopo un&#39;ora di immobilizzazione sul chip 12. Dal momento che alcuni genotipi possono essere meno resistenti allo stress del chip, prima verificare che tipo di animali selvatici (ad esempio, Cantone S) sopravvivono la tecnica di immobilizzazione. a) La causa più comune di letalità è corretto posizionamento della larva (vedi figure 2G-H). Se parti della cuticola, testa o trachea non sono del tutto all&#39;interno della camera, allora possono diventare danneggiati durante l&#39;immobilizzazione, e unlarva che è troppo grande per il chip (&gt; 4 mm) è meno probabilità di sopravvivere. b) Una causa meno comune per letalità è l&#39;uso di una pressione eccessiva o quando si carica il chip vuoto. Se correttamente posizionato nel chip, la pressione generata dal vuoto è ben tollerato. Tuttavia pressione eccessiva, sia dal vuoto o nella fase iniziale di posizionamento del animale può essere un problema. E &#39;meglio conoscere il grado di pressione necessaria empiricamente da prove di tipo selvaggio larve di dimensioni corrette. c) Se troppo olio Halocarbon copre trachea dell&#39;animale l&#39;animale può potenzialmente avere problemi con sopravvivenza a lungo termine. L&#39;olio svolge diversi ruoli importanti nel chip: è importante per la creazione del vuoto, l&#39;ottica durante l&#39;imaging, e contrasta essiccazione nel chip. Olio Tuttavia eccessivo dovrebbe essere evitato. (Questo può anche portare a olio nel tubo e siringa, compromettendo il vuoto). I cappotti protocollo proposti solo il lato ventrale della larva con l&#39;olio, poi removes olio in eccesso dal posizionamento della larva su un vetrino pulito prima del trasferimento al vetrino finale per l&#39;imaging. d) fototossicità può essere vissuta dalla sessione di imaging. Come con qualsiasi applicazione di imaging dal vivo, è ideale da utilizzare tempi di esposizione brevi con una bassa intensità di luce laser, che è meglio realizzato utilizzando una macchina fotografica ad alta sensibilità o rivelatore. Cercare di minimizzare l&#39;illuminazione con luce UV, inclusa la luce ad ampio spettro creato da sorgenti luminose Hg. Altre questioni e le direzioni future: Poiché questo metodo non utilizza anestetici, il cuore dell&#39;animale continua a battere. Questo crea una certa mobilità inevitabile, che colpisce l&#39;imaging in alcuni luoghi più di altri. Gli esempi qui dimostrano che il cordone ventrale dei nervi, i nervi segmentali, e la parete del corpo possono essere prontamente ripreso senza interferenze da parte battito cardiaco. Nei casi in cui il battito cardiaco colpisce di imaging, i movimenti regolari possono a volte essere corretti conin software di analisi (ad esempio, lo stabilizzatore plug per ImageJ). Questo funziona bene quando i singoli oggetti si muovono su una scala temporale veloce (per esempio ~ 1 micron / sec per il trasporto assonale veloce) o su una scala temporale molto lento (minuti o ore). Tuttavia, quando l&#39;oggetto (s) di interesse movimento con una gamma di velocità e direzioni, può essere più difficile da correggere i movimenti battito cardiaco indotto. Un altro problema è lieve variabilità in ottica da animale ad animale, o tra più sessioni di imaging dello stesso animale nel chip. Il più profondo l&#39;oggetto di interesse è dentro l&#39;animale, tanto maggiore sarà questa variazione. Nervi segmentale e il cordone nervoso ventrale sono normalmente troppo in profondità all&#39;interno quindi animale per essere ripreso su un microscopio normale. Tuttavia la pressione lieve sperimentato nel chip larva spinge queste strutture molto vicino alla cuticola e vetrino. La distanza esatta di queste strutture dal vetrino avrà piccole variazioni di trIAL a giudizio. La variazione per oggetti chiudere la cuticola, come i corpi cellulari dei neuroni sensoriali, è inferiore. È quindi importante, particolarmente per eseguire misurazioni di intensità, di utilizzare un gran numero di animali e prove indipendenti per conto della variabilità in ottica. Mentre gli esempi mostrati qui sono concentrati sui processi all&#39;interno dei neuroni, l&#39;approccio dovrebbe essere suscettibili di imaging di qualsiasi struttura in animale che può essere proposto entro la profondità di messa a fuoco dell&#39;obiettivo del microscopio. Ciò include la cuticola, muscoli della parete del corpo, e le loro NMJs. Trachea sul lato ventrale dell&#39;animale e potenzialmente parti del tubo digerente potrebbe anche essere ripreso. L&#39;animale può anche essere posizionato con il lato dorsale verso il coprioggetto per l&#39;imaging breve termine delle strutture in prossimità della superficie dorsale. La capacità di strutture dell&#39;immagine profondità dentro l&#39;animale è limitata dalla distanza di lavoro dell&#39;obiettivo microscopio utilizzato. Strutture come imI dischi aginal sono inaccessibili al più alto ingrandimento (ad esempio 40X) obiettivi. I chip larva descritti in questo protocollo sono progettati per le larve nei primi anni del 3 ° stadio instar (che variano nel formato 3,5-4 mm). Tuttavia molte domande interessanti richiedono l&#39;imaging a diversi stadi larvali. Chip più piccoli per ospitare 2 ° instar larve, o chip più grandi per ospitare stadi tardivi 3 ° possono essere facilmente progettati utilizzando lo stesso principio. (Figura complementare 1 contiene un file DXF facilmente modificabile per fare stampi in silicone con dimensioni delle camere alterati). Il semplice principio della tenuta reversibile potrebbe essere applicato anche ad altri microrganismi come C. elegans o zebrafish, con la variante principale è la dimensione della camera. Una direzione futura utile è quello di progettare un chip che può immobilizzare molti animali contemporaneamente, da utilizzare per scopi di screening. Tuttavia, per questo, il progetto avrebbe bisogno di essere significativamente diversadal dispositivo corrente, dove i problemi di posizionamento dell&#39;animale nel chip deve essere trattata per ogni animale in modo indipendente. La calca test nervo per studiare le risposte di pregiudizio nei nervi periferici larvali: Il test schiacciamento del nervo descritto qui per i nervi segmentale larvale è un metodo semplice per introdurre una lesione assoni periferici in Drosophila. I vantaggi di questo metodo sono: a) è semplice da condurre con gli strumenti standard che si trovano in un laboratorio di Drosophila (a CO 2 di origine e pinze stereomicroscopio), b) può essere condotta rapidamente per molti animali, rendendo l&#39;analisi biochimica dei cordoni nervosi dopo l&#39;infortunio fattibile 14; c) le risposte molecolari e cellulari a questa lesione sono altamente riproducibili 14,15,28 e possono essere usati per scoprire i processi che sono anche importanti in neuroni vertebrati 29,30. Metodi alternativi per ferire i neuroni è quello di focusa laser ad alta potenza, per esempio, un pulsato UV o laser a femtosecondi, di recidere un assone via laser microchirurgia 17,31-33. Il chip larva è un metodo ideale per posizionare l&#39;animale per tale microchirurgia. Tuttavia, a causa delle piccole differenze ottiche tra le prove, discusse sopra, il metodo basato sul laser può essere più difficile da riprodurre in larve, soprattutto nei nervi larvali segmentale. Inoltre, sulla base laser danno assonale richiede più tempo per posizionare ciascun animale, quindi è più difficile condurre su larga scala (con un grande numero di animali). Risoluzione dei problemi: Il problema tecnico più comunemente incontrati dalla schiacciamento del nervo è la morte da danni agli organi interni. Nel condurre la calca, è importante non schiacciare il cavo ventrale del nervo, ghiandole salivari, o l&#39;intestino. E &#39;anche importante non forare la cuticola. Questi problemi sono meglio evitare portando la pinza ad un angolo di 45 ° rispetto al tensioattivo cuticolae (vedi Figura 3). La qualità della pinza ha un grande impatto sulla efficacia della compressione e sopravvivenza dopo. Consigliamo numero Dumostar 5 pinze. Per mantenere la loro nitidezza, le pinze devono essere maneggiati con cura, non utilizzati per altri scopi, e sostituiti una volta che diventano smussato o piegato. La dimensione dell&#39;animale può anche influenzare l&#39;efficacia della cotta. Piccoli animali (meno di 3 millimetri di lunghezza) sono molto meno probabilità di sopravvivere il pregiudizio. Con grandi animali, (vagando 3 stadi rd), è più difficile individuare i nervi ed evitare danni alle grandi ghiandole salivari e intestino, e c&#39;è meno tempo per studiare le risposte del pregiudizio prima impupamento. Il schiacciamento del nervo è più efficace condotta nei primi mesi del 3 ° instar larve (che sono ~ 3-4,5 mm di lunghezza lungo l&#39;asse antero-posteriore). La fonte di cibo che l&#39;animale è sollevata sopra può influenzare laforza della cuticola e sopravvivenza dopo la calca. Si consiglia di allevare animali negli alimenti ottenuti da una ricetta standard lievito glucosio. Il metodo migliore per imparare a fare la calca in modo efficace è quello di praticare in molti animali, in primo luogo con l&#39;obiettivo primario di raggiungere la sopravvivenza (e non impupamento) 24 ore dopo la calca. I principianti normalmente hanno un basso tasso di sopravvivenza (ad esempio 10%), ma una volta che la tecnica è appreso, i tassi di sopravvivenza può raggiungere ~ 90%. Altre questioni e le direzioni future: Il saggio cotta fornisce un potente metodo per studiare la germinazione di assoni prossimale al sito di lesione e la degenerazione degli assoni e sinapsi distali al sito di lesione. Benché la percentuale di degenerazione variano tra i diversi tipi di neuroni, sono altamente riproducibili in un determinato tipo neurone, fornendo testimonianza della riproducibilità del dosaggio pregiudizio. Al contrario, la &#39;rigenerativa&#39; germinazionerisposta osservata negli assoni prossimali è più impegnativo di studio. Tutti gli assoni del nervo segmentale avviare vasta germinazione vicino al sito della lesione (per esempio, vedi Figura 6 e Figura 3). Tuttavia, l&#39;entità di germinazione può variare da neurone a neurone, ed è difficile da quantificare. Una misura analoga e la variabilità in germinazione possono essere osservati dopo lesioni più focali dei singoli motoneuroni nei nervi segmentale introdotti utilizzando un UV impulsi laser a colorante. Interpretiamo che la direzionalità nondiscriminate della germinazione è dovuta alla mancanza di spunti di orientamento nei nervi segmentali. Al contrario, gli assoni dei neuroni sensoriali ferite da laser vicino ai loro corpi cellulari subiscono nuova crescita assonale nella stessa direzione come l&#39;assone perduto 34. Assoni in questa regione dell&#39;animale sono probabilmente esposti alle informazioni di posizione più specifico per l&#39;orientamento degli assoni rigeneranti. L&#39;ambiente all&#39;interno di nervi segmentali è improbabile avere molto resemblance l&#39;ambiente che gli assoni originariamente navigati durante la loro guida nell&#39;embrione, quindi non si prevede di avere informazioni per guidare gli assoni rigeneranti. Un&#39;altra limitazione per studiare la rigenerazione utilizzando il segmentale test schiacciamento del nervo è che gli assoni sensoriali e del motoneurone feriti hanno ancora una distanza significativa per coprire (0,25-1 mm) per raggiungere il loro obiettivo, e un periodo di tempo limitato (&lt;3 giorni) prima che le subisce animali impupamento. Uno studio recente ha identificato una manipolazione genetica del recettore dell&#39;ormone prothoraciotropic che triplica la durata del 3 ° stadio larvale instar 35. Questa manipolazione estenderà il periodo di tempo per studiare il recupero e la degenerazione dei neuroni dopo lesione significativamente, a 9 invece di 3 giorni. Questo può essere abbastanza lungo da osservare nuovi eventi, come riconnessione di un assone feriti con il suo bersaglio postsinaptico, soprattutto se la lesione è indotta vicina al termine sinaptica.

Il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stata utilizzata come organismo modello per oltre 100 anni, e si è dimostrato determinante nella definizione di segnalazione fondamentale e percorsi di sviluppo che sono conservati dagli invertebrati per la salute umana. L&#39;imaging dal vivo è un approccio importante per studiare i meccanismi cellulari, e il semplice piano corpo e la cuticola traslucido della larva di Drosophila rende un interessante sistema per l&#39;imaging dal vivo, soprattutto perché ci sono molti strumenti genetici disponibili per esprimere le proteine ​​fluorescenti taggati in tipi cellulari specifici. Una sfida importante per le tecniche di imaging dal vivo è quello di immobilizzare e posizionare un animale per la microscopia in modo non invasivo. Approcci immobilizzazione convenzionali includono dissezione 1,2 o l&#39;uso di cloroformio, entrambi i quali la morte dell&#39;animale. Etere 4 e isofluorano 5-8 sono stati utilizzati anche gli anestetici. Mentre anestetici offrono molti vantaggi, Essi inibiscono anche attività neurale e fisiologia importante (compreso il battito cardiaco) 9-11, quindi può influenzare il processo studiato e creare stress sul animale. Ci sono anche problemi di sicurezza umani a lavorare con etere e isofluorane. Abbiamo sviluppato un metodo di drug-free per immobilizzare larve di Drosophila in un unico dispositivo microfluidica strato PDMS, che noi chiamiamo il &#39;chip di larva&#39; 12. Questo protocollo descrive come ottenere o fare il chip larva, e su come utilizzarlo per l&#39;imaging dal vivo nei primi mesi del-scenica 3 ° instar larve. Il chip comprende una microcamera-fasciante, che, a richiesta di un vuoto mediante una siringa, immobilizza l&#39;animale con forza meccanica delicata. Il metodo di immobilizzazione porta strutture ventrali come il cordone nervoso, i nervi segmentali e muscoli della parete del corpo, nelle immediate vicinanze di un coprioggetto di vetro. Questo permette di imaging ad alta risoluzione di tali strutture con elevato aper numericotura (ad alto ingrandimento) obiettivi. Vantaggi del chip larva rispetto ad altre tecniche convenzionali sono i seguenti: (i) uso di chip larva sostituisce l&#39;uso di prodotti chimici, consentendo immagini in vivo di animali non anestetizzati. (Ii) Larve recuperare subito dopo il rilascio del chip (a differenza di un periodo di recupero 2 ore per isofluorane 8,13). Questo permette l&#39;imaging su scale temporali ampi, che vanno da millisecondi a minuti, per ore e giorni. (Iii) L&#39;uso di PDMS, che è un materiale permeabile ai gas, consente di diffusione continuo di ossigeno / aria dall&#39;ambiente nel corpo larva. (Iv) Il chip è facile e sicuro da usare, e (v) è riutilizzabile, e può essere fabbricato ad un costo minimo. Oltre alle istruzioni per l&#39;uso del chip di larva, questo protocollo fornirà alcuni esempi del suo uso per studiare gli eventi neuronali in 3 ° instar larve. Questi includono l&#39;imaging dal vivo di Axonatrasporto l, risposte di calcio di lesioni, e gli studi time-lapse del traffico di proteine ​​foto-cabriolet su lunghe distanze e tempi. Un&#39;altra applicazione del chip è studiare risposte neuronali a danno assonale. Per questo una procedura aggiuntiva è descritta (parte 3) per ferire gli assoni all&#39;interno nervi periferici da uno schiacciamento del nervo segmentaria. Questa semplice analisi può essere eseguita sia rapida e riproducibile allo stereomicroscopio dissezione standard, che consente per molti animali da elaborare allo stesso tempo. Risposte cellulari al danno possono essere studiati da imaging dal vivo nel chip larva.

<table><tbody><tr><td>Tubo in polietilene da 0,5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>Tubo in polietilene, diametro interno = 0,023 in diametro esterno = 0,038 in</td></tr><tr><td>tubo in poliuretano da 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>BB521-63</td><td>Tubo in poliuretano, diametro interno = 0,063 pollici con diametro esterno = 0,125 in</td></tr><tr><td>Connettore da ardiglione a ardiglione</td><td>Bio Rad</td><td>732-8300</td><td>Connettore da ardiglione a innesto da 0,8 mm</td></tr><tr><td>Rubinetto a 3 vie Bio</td><td>Rad</td><td>732-8104</td><td>Valvola a vite per</td></tr><tr><td>siringa Siringa (20 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-33</td><td>Avvitare la siringa da 20 ml per generare</td></tr><tr><td>vuoto Aghi di erogazione, 23 G (0,4 mm I.D., 0,6 mm O.D.)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Ago per connessione di uscita</td></tr><tr><td>Aghi di erogazione, 21 G, (0,6 mm D.I.,&nbsp; 0,8 mm D.E.)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A679</td><td>Ago per connessione di uscita</td></tr><tr><td>Olio alocarbonico</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td>Olio alocarbonico 700</td></tr><tr><td>Dumostar Numero 5 Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-498</td><td>Per schiacciamento nervoso</td></tr><tr><td>Kit PDMS (Base e agente indurente)</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td>Dow Corning Sylgard 184 Incapsulante siliconico 0,5 kg Kit</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti in vetro</td> trasparente <td>Fisher Scientific</td><td>12-544-C</td><td>24 mm x 40 mm (spessore in base alle raccomandazioni per l'obiettivo del microscopio)</td></tr><tr><td>Bicchiere di plastica monouso (9 oz)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bastoncino</td><td></td><td></td><td></td>per agitatore da caffè in plastica</tr><tr><td>Lama</td><td></td><td></td><td></td>di rasoio</tr><tr><td>Piastre</td><td></td><td></td> <td>di agar per succo d'uvaVedi <a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925</a> per la ricetta</td></tr></tbody></table>

utilizzando chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; drosophila</em&gt; larve

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

L&#39;imaging dal vivo è una tecnica importante per lo studio dei processi biologici cellulari, ma questo può essere difficile in animali vivi. La cuticola traslucido della larva di Drosophila rende un interessante organismo modello per studi di imaging dal vivo. Tuttavia, una sfida importante per le tecniche di imaging dal vivo è quello di immobilizzare e posizionare un animale sulla microscopio in maniera non invasiva. Questo protocollo rappresenta un metodo semplice e facile da usare per immobilizzare e di imaging larve di Drosophila su un polidimetilsilossano (PDMS) dispositivo microfluidica, che noi chiamiamo il &#39;chip di larva&#39;. Il chip larva comprende un PDMS microcamera-fasciante che è collegato a un vetrino di vetro sottile, che, a richiesta di un vuoto mediante una siringa, immobilizza l&#39;animale e porta strutture ventrali come il cordone nervoso, nervi segmentali e corpo muscoli della parete, nelle immediate vicinanze di coprioggetto. Questo permette di immagini ad alta risoluzione, e soprattutto, evita l&#39;uso di anesthetics e sostanze chimiche, che facilita lo studio di una vasta gamma di processi fisiologici. Poiché larve correggere facilmente l&#39;immobilizzazione, possono essere facilmente sottoposti a più sessioni di imaging. Questo permette di studi longitudinali oltre l&#39;andamento nel tempo che vanno da ore a giorni. Questo protocollo descrive passo-passo come preparare il chip e come utilizzare il chip per l&#39;imaging dal vivo di eventi neuronali in 3 ° instar larve. Questi eventi includono il rapido trasporto di organelli negli assoni, le risposte di calcio al pregiudizio, e gli studi time-lapse del traffico di proteine ​​foto-cabriolet su lunghe distanze e tempi. Un&#39;altra applicazione del chip è studiare rigenerativa e risposte degenerative lesione assonale, così la seconda parte di questo protocollo descrive un nuovo e semplice procedura per ferire assoni all&#39;interno nervi periferici da schiacciamento del nervo segmentale.

Drosophila larve sono un sistema modello attraente per l&#39;imaging dal vivo a causa della loro cuticola trasparente e potenti genetica. Questo protocollo descrive come utilizzare un dispositivo PDMS singolo strato, chiamato il &#39;chip di larva&#39; per l&#39;imaging dal vivo di processi cellulari all&#39;interno dei neuroni di 3 ° instar larve di Drosophila.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è immobilizzare in modo non invasivo larve di drosophila per l'analisi in vivo mediante una camera microfluidica modificata. Una larva di terzo stadio viene posizionata nel chip con un po' di olio per favorire la chiusura ermetica della larva. Successivamente, il chip viene posizionato sopra la larva in modo che il suo corpo si adatti all'interno della camera.Il chip è collegato a una siringa in modo che possa essere applicato un vuoto. La motilità delle larve risulta limitata e le strutture nella parte ventrale dell'animale vengono spostate vicino al vetrino coprioggetto. Utilizzando un microscopio confocale, è possibile ottenere facilmente immagini di strutture come i dettagli dei terminali assonici dei neuroni sensoriali e la rigenerazione dei nervi segmentali dopo un danno nervoso indotto.Altri metodi per immobilizzare josepha per l'immagine in tempo reale, grandi quantità di cloroformio etere o anestetici ISO. Il principale vantaggio di questa tecnica è che evita l'uso di queste tossine, che interferiscono con la fisiologia dell'animale. Un ulteriore beneficio derivante dall'assenza di tossine è che la larva GB è sicura da manipolare. L'immobilizzazione robusta permette l'acquisizione di eventi rapidi come il trasporto assonale veloce e i cambiamenti nel calcio intracellulare.Un singolo larva può essere immobilizzato e visualizzato più volte all'interno del chip. Ciò consente l'acquisizione di sequenze temporali. Per l'immagine di processi che si svolgono nell'arco di un periodo fino a 72 ore, iniziare ottenendo un chip in PDMS per provare questo protocollo.Istruzioni su come realizzare un chip A-P-D-M-S a partire da uno stampo SU otto sono disponibili nel protocollo testuale utilizzando un ago dispensatore da 21 gauge. Praticare un foro nella porta del vuoto del chip in PDMS per un microscopio invertito. Rimuovere un ago da 23 gauge dalla sua base, staccando il blocco del connettore con alcune rotazioni.Quindi inserire la punta dell'ago in un piccolo pezzo di tubo di polietilene in modo che il tubo ricopra almeno un millimetro dell'ago. Utilizzare una lametta per tagliare l'eccesso di tubo. In questo modo si ottiene un anello di plastica che può creare una sigillatura.Inserire la punta dell'ago da 23 gauge nel foro della porta del vuoto. Per un microscopio eretto, praticare un secondo foro sul lato del chip in PDMS utilizzando un ago dispensatore da 21 gauge. Questo foro permetterà l'accesso al primo foro dal lato.Inserire quindi la punta dell'ago da 23 gauge e l'anello di tubo nel foro laterale. Posizionare un pezzo di nastro adesivo doppio sul lato superiore del chip in PDMS per sigillare il foro superiore. Collegare un tratto di tubo in polietilene lungo 20 centimetri tra la punta dell'ago inserita nel porto sottovuoto del chip e uno dei porti di una valvola a tre vie.Quindi collegare una siringa da 20 millilitri a una delle due porte rimanenti della valvola, lasciando l'ultima porta aperta. Pulire il chip in PDMS con del nastro adesivo trasparente. Applicare un pezzo di nastro sulla parte inferiore del chip.Assicurarsi che il nastro aderisca a tutta la superficie del PDMS, quindi rimuovere il nastro. Ripetere questo metodo di pulizia per tre volte. Poiché il chip in PDMS è riutilizzabile, è molto importante rimuovere i residui di olio perché possono compromettere l'adesione del PDMS al vetro durante il trasferimento del foraggiamento precoce.Larve di terzo stadio prelevate dal mezzo di coltura e trasferite in una piastra di Petri contenente acqua. Devono avere una lunghezza compresa tra 3,5 e 4 millimetri per adattarsi correttamente al chip. Lavare le larve per rimuovere il mezzo di coltura.Successivamente, posizionare una piccola goccia di olio halo carbon 700 al centro di un'immersione di vetro; con pinzette, prelevare delicatamente una larva lavata. Appoggiarla brevemente su un panno leggero per asciugarla, quindi trasferirla nell'olio per 10 secondi. La goccia deve essere abbastanza piccola da non ricoprire le trachee della larva.Quindi posizionare brevemente i larve su un vetrino pulito e trasferirle su un altro vetrino, in modo da rimuovere ulteriore olio. Prestare attenzione all'orientamento della larva per ottenere un'immagine del cordone nervoso e dei nervi segmentali.Il lato ventrale deve essere rivolto verso il basso. I tubi traqueali facilmente identificabili devono essere rivolti verso l'alto. Ora posizionare delicatamente il chip in PDMS sopra i larve.Allineare i larvi al centro della microcamera. Con la parte posteriore orientata verso la porta del vuoto, il larva non deve toccare i bordi della camera. Una volta allineato, premere la chip in PDMS contro il vetrino di copertura per ottenere una buona tenuta.Quindi verificare attentamente che la larva sia completamente racchiusa nella microcamera. Ora ruotare il rubinetto a tre vie verso la siringa. Tenere saldamente l'assemblaggio in PDMS e tirare lo stantuffo della siringa per aspirare due a 2,5 millimetri di aria finché non si avverte resistenza.In questo modo si crea un vuoto. Quindi chiudere il rubinetto. Per mantenere il vuoto con attenzione, controllare due volte le larve.Il suo corpo deve essere immobilizzato all'interno della microcamera, e la trachea deve essere visibile. Il resto del chip in PDMS deve essere a contatto con il vetrino. Orientamenti di questo tipo non sono corretti. Ora acquisire le immagini delle larve.Se si utilizza un microscopio verticale, fissare il lato superiore del chip alla piastra con del nastro adesivo doppio. Al termine dell'acquisizione delle immagini, rilasciare il vuoto. Successivamente, staccare il chip in PDMS dal vetrino.La larva dovrebbe essere immediatamente mobile utilizzando pinzette. Restituire le larve in una piastra con agar al succo d’uva per il recupero. Posizionare una singola larva anestetizzata su una piastra con agar al succo d’uva.Sotto il microscopio stereoscopico, posizionare l'animale con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Per visualizzare il cordone nervoso ventrale e i nervi segmentali, assicurarsi che la larva sia completamente immobile. Individuare il cordone nervoso e le ghiandole salivari.È importante non danneggiare queste strutture. Individuare l'estremità del terzo segmento addominale. Un danno in questa sede compromette il maggior numero di nervi ed è il più facile da riprodurre senza uccidere l'animale.La lesione può essere eseguita anche in segmenti più posteriori utilizzando una pinza duo star numero cinque. Stringere saldamente i nervi segmentali attraverso il tegumento per cinque-dieci secondi. Se eseguita correttamente, la cuticola rimane integra e la parete corporea non viene perforata.Il controllo richiederà pratica dopo la lesione, posizionando l'animale con il lato ventrale rivolto verso il basso sulla grande piastra. Dovrebbe essere in grado di muovere la testa e mangiare. Se la lesione è stata eseguita correttamente, la metà posteriore delle larve sarà paralizzata.Il chip per larve è stato utilizzato per acquisire immagini del trasporto mediato da chinesina delle vescicole sinaptiche all'interno di singoli assoni periferici. Il movimento anterogrado di queste vescicole è stato misurato a circa 1,0 micrometri al secondo. Il movimento retrogrado è stato registrato a 0,8 micrometri al secondo.La tecnica di immobilizzazione è stata utilizzata per la microchirurgia laser mediante un laser a colorante UV pulsato. I livelli di calcio sono stati osservati in specifici neuroni grazie a un indicatore codificato geneticamente. G camp 3.0 rivela un picco di calcio a seguito di un neurone sensoriale.L’assone viene sezionato. Consentire all’animale di riposare tra le sessioni di imaging permette di osservare gli eventi cellulari nel tempo. Dopo la schiacciatura degli assoni dei motoneuroni emerici, il moncone prossimale dell’assone ha sviluppato nuovi germogli.Nel frattempo, gli assoni distali hanno formato varicosità e si sono frammentati attraverso il processo di degenerazione walleriana. Utilizzando il larva chip, è inoltre possibile seguire in vivo le proteine fluorescenti fotoconvertite. Una proteina di fusione DRA due alfa tubulina espressa nei neuroni sensoriali di classe quattro è stata fotoconvertita nei corpi cellulari.Entro due giorni, una quantità significativa della proteina fotoconvertita è stata traslocata nei terminali assonali dei neuroni sensoriali, a circa un millimetro di distanza dalla posizione originale nel corpo cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il chip per larve per l'immagine in tempo reale di larve di drosophila e di come eseguire una lesione da schiacciamento del nervo. Una volta acquisite queste tecniche, le larve possono essere posizionate sul microscopio in soli pochi minuti.L&#39;esperimento di schiacciamento del nervo è altrettanto rapido. Pertanto, queste procedure possono essere utilizzate per esperimenti su larga scala, come ad esempio analisi genetiche. Il chip può essere utilizzato per acquisire immagini di strutture sul lato ventrale delle larve di drosophila.Questi includono, ma non si limitano a, muscoli, sinapsi della giunzione neuromuscolare, neuroni sensoriali, nervi periferici e il cordone nervoso ventrale. Questa procedura può inoltre essere utilizzata per effettuare imaging in tempo reale del cuore larvale, delle ghiandole salivari e della trachea. Il chip per larva utilizzato in questo video è dimensionato per animali compresi tra 3,5 e quattro millimetri di lunghezza.Per l'imaging di animali più piccoli o più grandi, è possibile realizzare facilmente un chip con una camera più piccola o più grande. Consultare il file di progettazione supplementare e le istruzioni per la realizzazione di chip in PDMS. Le istruzioni per la fabbricazione dei chip in PDMS sono incluse nel protocollo scritto.Possiamo inviarti un chip campione se ci contatti.

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