Utilizzando Chips microfluidica per l'imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in
7 febbraio 2014
Drosophila larve sono un sistema modello attraente per l'imaging dal vivo a causa della loro cuticola trasparente e potenti genetica. Questo protocollo descrive come utilizzare un dispositivo PDMS singolo strato, chiamato il 'chip di larva' per l'imaging dal vivo di processi cellulari all'interno dei neuroni di 3 ° instar larve di Drosophila.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è immobilizzare in modo non invasivo larve di drosophila per l'analisi in vivo mediante una camera microfluidica modificata. Una larva di terzo stadio viene posizionata nel chip con un po' di olio per favorire la chiusura ermetica della larva. Successivamente, il chip viene posizionato sopra la larva in modo che il suo corpo si adatti all'interno della camera.
Il chip è collegato a una siringa in modo che possa essere applicato un vuoto. La motilità delle larve risulta limitata e le strutture nella parte ventrale dell'animale vengono spostate vicino al vetrino coprioggetto. Utilizzando un microscopio confocale, è possibile ottenere facilmente immagini di strutture come i dettagli dei terminali assonici dei neuroni sensoriali e la rigenerazione dei nervi segmentali dopo un danno nervoso indotto.
Altri metodi per immobilizzare josepha per l'immagine in tempo reale, grandi quantità di cloroformio etere o anestetici ISO. Il principale vantaggio di questa tecnica è che evita l'uso di queste tossine, che interferiscono con la fisiologia dell'animale. Un ulteriore beneficio derivante dall'assenza di tossine è che la larva GB è sicura da manipolare. L'immobilizzazione robusta permette l'acquisizione di eventi rapidi come il trasporto assonale veloce e i cambiamenti nel calcio intracellulare.
Un singolo larva può essere immobilizzato e visualizzato più volte all'interno del chip. Ciò consente l'acquisizione di sequenze temporali. Per l'immagine di processi che si svolgono nell'arco di un periodo fino a 72 ore, iniziare ottenendo un chip in PDMS per provare questo protocollo.
Istruzioni su come realizzare un chip A-P-D-M-S a partire da uno stampo SU otto sono disponibili nel protocollo testuale utilizzando un ago dispensatore da 21 gauge. Praticare un foro nella porta del vuoto del chip in PDMS per un microscopio invertito. Rimuovere un ago da 23 gauge dalla sua base, staccando il blocco del connettore con alcune rotazioni.
Quindi inserire la punta dell'ago in un piccolo pezzo di tubo di polietilene in modo che il tubo ricopra almeno un millimetro dell'ago. Utilizzare una lametta per tagliare l'eccesso di tubo. In questo modo si ottiene un anello di plastica che può creare una sigillatura.
Inserire la punta dell'ago da 23 gauge nel foro della porta del vuoto. Per un microscopio eretto, praticare un secondo foro sul lato del chip in PDMS utilizzando un ago dispensatore da 21 gauge. Questo foro permetterà l'accesso al primo foro dal lato.
Inserire quindi la punta dell'ago da 23 gauge e l'anello di tubo nel foro laterale. Posizionare un pezzo di nastro adesivo doppio sul lato superiore del chip in PDMS per sigillare il foro superiore. Collegare un tratto di tubo in polietilene lungo 20 centimetri tra la punta dell'ago inserita nel porto sottovuoto del chip e uno dei porti di una valvola a tre vie.
Quindi collegare una siringa da 20 millilitri a una delle due porte rimanenti della valvola, lasciando l'ultima porta aperta. Pulire il chip in PDMS con del nastro adesivo trasparente. Applicare un pezzo di nastro sulla parte inferiore del chip.
Assicurarsi che il nastro aderisca a tutta la superficie del PDMS, quindi rimuovere il nastro. Ripetere questo metodo di pulizia per tre volte. Poiché il chip in PDMS è riutilizzabile, è molto importante rimuovere i residui di olio perché possono compromettere l'adesione del PDMS al vetro durante il trasferimento del foraggiamento precoce.
Larve di terzo stadio prelevate dal mezzo di coltura e trasferite in una piastra di Petri contenente acqua. Devono avere una lunghezza compresa tra 3,5 e 4 millimetri per adattarsi correttamente al chip. Lavare le larve per rimuovere il mezzo di coltura.
Successivamente, posizionare una piccola goccia di olio halo carbon 700 al centro di un'immersione di vetro; con pinzette, prelevare delicatamente una larva lavata. Appoggiarla brevemente su un panno leggero per asciugarla, quindi trasferirla nell'olio per 10 secondi. La goccia deve essere abbastanza piccola da non ricoprire le trachee della larva.
Quindi posizionare brevemente i larve su un vetrino pulito e trasferirle su un altro vetrino, in modo da rimuovere ulteriore olio. Prestare attenzione all'orientamento della larva per ottenere un'immagine del cordone nervoso e dei nervi segmentali.
Il lato ventrale deve essere rivolto verso il basso. I tubi traqueali facilmente identificabili devono essere rivolti verso l'alto. Ora posizionare delicatamente il chip in PDMS sopra i larve.
Allineare i larvi al centro della microcamera. Con la parte posteriore orientata verso la porta del vuoto, il larva non deve toccare i bordi della camera. Una volta allineato, premere la chip in PDMS contro il vetrino di copertura per ottenere una buona tenuta.
Quindi verificare attentamente che la larva sia completamente racchiusa nella microcamera. Ora ruotare il rubinetto a tre vie verso la siringa. Tenere saldamente l'assemblaggio in PDMS e tirare lo stantuffo della siringa per aspirare due a 2,5 millimetri di aria finché non si avverte resistenza.
In questo modo si crea un vuoto. Quindi chiudere il rubinetto. Per mantenere il vuoto con attenzione, controllare due volte le larve.
Il suo corpo deve essere immobilizzato all'interno della microcamera, e la trachea deve essere visibile. Il resto del chip in PDMS deve essere a contatto con il vetrino. Orientamenti di questo tipo non sono corretti. Ora acquisire le immagini delle larve.
Se si utilizza un microscopio verticale, fissare il lato superiore del chip alla piastra con del nastro adesivo doppio. Al termine dell'acquisizione delle immagini, rilasciare il vuoto. Successivamente, staccare il chip in PDMS dal vetrino.
La larva dovrebbe essere immediatamente mobile utilizzando pinzette. Restituire le larve in una piastra con agar al succo d’uva per il recupero. Posizionare una singola larva anestetizzata su una piastra con agar al succo d’uva.
Sotto il microscopio stereoscopico, posizionare l'animale con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Per visualizzare il cordone nervoso ventrale e i nervi segmentali, assicurarsi che la larva sia completamente immobile. Individuare il cordone nervoso e le ghiandole salivari.
È importante non danneggiare queste strutture. Individuare l'estremità del terzo segmento addominale. Un danno in questa sede compromette il maggior numero di nervi ed è il più facile da riprodurre senza uccidere l'animale.
La lesione può essere eseguita anche in segmenti più posteriori utilizzando una pinza duo star numero cinque. Stringere saldamente i nervi segmentali attraverso il tegumento per cinque-dieci secondi. Se eseguita correttamente, la cuticola rimane integra e la parete corporea non viene perforata.
Il controllo richiederà pratica dopo la lesione, posizionando l'animale con il lato ventrale rivolto verso il basso sulla grande piastra. Dovrebbe essere in grado di muovere la testa e mangiare. Se la lesione è stata eseguita correttamente, la metà posteriore delle larve sarà paralizzata.
Il chip per larve è stato utilizzato per acquisire immagini del trasporto mediato da chinesina delle vescicole sinaptiche all'interno di singoli assoni periferici. Il movimento anterogrado di queste vescicole è stato misurato a circa 1,0 micrometri al secondo. Il movimento retrogrado è stato registrato a 0,8 micrometri al secondo.
La tecnica di immobilizzazione è stata utilizzata per la microchirurgia laser mediante un laser a colorante UV pulsato. I livelli di calcio sono stati osservati in specifici neuroni grazie a un indicatore codificato geneticamente. G camp 3.0 rivela un picco di calcio a seguito di un neurone sensoriale.
L’assone viene sezionato. Consentire all’animale di riposare tra le sessioni di imaging permette di osservare gli eventi cellulari nel tempo. Dopo la schiacciatura degli assoni dei motoneuroni emerici, il moncone prossimale dell’assone ha sviluppato nuovi germogli.
Nel frattempo, gli assoni distali hanno formato varicosità e si sono frammentati attraverso il processo di degenerazione walleriana. Utilizzando il larva chip, è inoltre possibile seguire in vivo le proteine fluorescenti fotoconvertite. Una proteina di fusione DRA due alfa tubulina espressa nei neuroni sensoriali di classe quattro è stata fotoconvertita nei corpi cellulari.
Entro due giorni, una quantità significativa della proteina fotoconvertita è stata traslocata nei terminali assonali dei neuroni sensoriali, a circa un millimetro di distanza dalla posizione originale nel corpo cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il chip per larve per l'immagine in tempo reale di larve di drosophila e di come eseguire una lesione da schiacciamento del nervo. Una volta acquisite queste tecniche, le larve possono essere posizionate sul microscopio in soli pochi minuti.
L'esperimento di schiacciamento del nervo è altrettanto rapido. Pertanto, queste procedure possono essere utilizzate per esperimenti su larga scala, come ad esempio analisi genetiche. Il chip può essere utilizzato per acquisire immagini di strutture sul lato ventrale delle larve di drosophila.
Questi includono, ma non si limitano a, muscoli, sinapsi della giunzione neuromuscolare, neuroni sensoriali, nervi periferici e il cordone nervoso ventrale. Questa procedura può inoltre essere utilizzata per effettuare imaging in tempo reale del cuore larvale, delle ghiandole salivari e della trachea. Il chip per larva utilizzato in questo video è dimensionato per animali compresi tra 3,5 e quattro millimetri di lunghezza.
Per l'imaging di animali più piccoli o più grandi, è possibile realizzare facilmente un chip con una camera più piccola o più grande. Consultare il file di progettazione supplementare e le istruzioni per la realizzazione di chip in PDMS. Le istruzioni per la fabbricazione dei chip in PDMS sono incluse nel protocollo scritto.
Possiamo inviarti un chip campione se ci contatti.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per immobilizzare in modo non invasivo larve di Drosophila per l'analisi in vivo mediante un dispositivo microfluidico modificato. La tecnica consente l'osservazione di processi cellulari all'interno dei neuroni, in particolare nel contesto del trasporto assonale e della rigenerazione nervosa.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecniche di imaging vitale
Sfondo
- I larve di Drosophila sono un modello prezioso per lo studio dei processi neuronali grazie alla loro trasparenza e alla facilità di manipolazione genetica.
- L'analisi in tempo reale su campioni vivi può fornire informazioni dettagliate sugli eventi cellulari dinamici in tempo reale.
- I metodi tradizionali di immobilizzazione spesso prevedono l'uso di anestetici dannosi che possono alterare la fisiologia.
- Questo protocollo ha lo scopo di fornire un'alternativa più sicura per l'analisi mediante imaging, senza l'impiego di sostanze tossiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo non invasivo per immobilizzare larve di Drosophila per l'acquisizione di immagini.
- Facilitare l'osservazione di strutture e processi neuronali.
- Permettere l'acquisizione ripetuta di immagini della stessa larva per periodi prolungati.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un dispositivo microfluidico in PDMS per immobilizzare le larve.
- Applicazione di un vuoto per limitare la motilità larvale.
- Acquisizione di immagini mediante microscopio confocale per visualizzare le strutture neuronali.
- Preparazione dettagliata del chip in PDMS e posizionamento delle larve per un'ottimale acquisizione delle immagini.
Risultati principali
- Immobilizzazione efficace delle larve senza l'uso di anestetici tossici.
- Visualizzazione chiara dei terminali assonali dei neuroni sensoriali e della rigenerazione dei nervi segmentali.
- Capacità di eseguire acquisizioni temporali in time-lapse per un periodo di 72 ore.
- Dimostrazione del trasporto mediato da chinesina delle vescicole sinaptiche.
Conclusioni
- La camera microfluidica modificata fornisce un metodo sicuro ed efficace per l'immagine in tempo reale di larve di Drosophila.
- Questo approccio consente lo studio di eventi neuronali rapidi e dei processi di recupero.
- Il protocollo può essere adattato per diverse applicazioni di imaging nella ricerca neuroscientifica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il fissaggio non invasivo di organismi modello consente l'acquisizione longitudinale di processi cellulari dinamici senza interferenze farmacologiche, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli. Il chip per larve facilita sessioni ripetute di acquisizione immagini per un periodo di 72 ore, permettendo la valutazione del trasporto assonale, delle risposte alla lesione e della rigenerazione in un sistema fisiologicamente rilevante. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici preservando la biologia nativa durante l'osservazione della dinamica neuronale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione diretta del trasporto assonale e della segnalazione del calcio nei neuroni.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio permettendo l'acquisizione ripetuta di immagini dello stesso larva per valutare l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso nel tempo.
- Valore predittivo: Fornisce letture quantitative del traffico degli organelli e delle risposte indotte da lesioni, migliorando la fiducia nel bersaglio nella scoperta nel campo delle neuroscienze.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive immobilizzando le larve al fine di ottenere immagini ad alta risoluzione di strutture ventrali in modo consistente.
- Riproducibilità: Permette una preparazione e sigillatura standardizzate delle larve in microcamere in PDMS, riducendo la variabilità nei saggi di imaging in vivo.
- Scalabilità: Facilita cicli rapidi di immobilizzazione e acquisizione delle immagini, consentendo la valutazione di perturbazioni genetiche o farmacologiche con una produttività media.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella i processi di danno assonale e rigenerazione rilevanti per i meccanismi delle malattie neurodegenerative.
- Continuità traslazionale: Collega l'imaging della scoperta alla validazione preclinica consentendo studi in time-lapse della degenerazione walleriana e della formazione di nuovi assoni.
- Progressione basata sul rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione quantificando le risposte rigenerative rispetto a quelle degenerative al danno da schiacciamento del nervo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il chip per larve si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo l'acquisizione di immagini in tempo reale di processi neuronali prima dell'identificazione del composto attivo, sostenendo la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei modelli basati su Drosophila.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi mediante imaging diretto del trasporto vescicolare mediato da chinesina e dei flussi di calcio nei neuroni sensoriali.
- Screening: Garantisce prontezza per saggi grazie all'immobilizzazione riproducibile e alla posizione ventrale ravvicinata alla lamella per un imaging costante.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa delle velocità di trasporto assonico (1,0 µm/s in senso anterogrado, 0,8 µm/s in senso retrogrado) e il rilevamento di picchi di calcio mediante indicatori codificati geneticamente.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici modellando le risposte all'infiammazione assonica, inclusi germogliamento e frammentazione, durante periodi prolungati.
- Riutilizzo aziendale: Propone il chip microfluidico in PDMS come piattaforma riutilizzabile per studi longitudinali in più sessioni sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva consentendo l'osservazione di eventi neuronali rapidi senza alterazioni fisiologiche indotte da anestetici.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso una preparazione standardizzata del chip, un'immobilizzazione basata sul vuoto e protocolli di pulizia per prevenire interferenze da residui di olio.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale permettendo il riutilizzo di singoli larve, riducendo il numero di animali necessari per studi longitudinali.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione aggiustata per il rischio grazie a un'immagine quantificabile dei parametri di degenerazione e rigenerazione dopo lesione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di dispositivi microfluidici, nell'uso di sistemi a vuoto e nella microscopia confocale per un'immagine ottimale.
- Presuppone l'accesso a strumenti per la stampatura di PDMS, a connessioni a vuoto con siringa e a tubi in polietilene per sigillare e realizzare collegamenti fluidici.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella preparazione delle larve, nell'applicazione dell'olio e nell'allineamento della camera, per garantire un'immobilizzazione costante.
- Richiede adattamenti per diverse dimensioni larvali, con modifiche alle dimensioni del chip in base alla lunghezza corporea (3,5–4 mm per il chip standard).
- Comprende limitazioni pratiche, come l'esigenza di evitare il rivestimento d'olio sulle trachee e di posizionare correttamente la larva con il lato ventrale verso il basso per visualizzare il cordone nervoso.
