Analisi specifica del sottotipo cellulare del proteasoma della membrana neuronale nei neuroni somatosensoriali

Stiamo studiando i meccanismi di come i neuroni somatosensoriali comunicano attraverso il proteasoma della membrana neuronale recentemente scoperto o NNP per modulare il modo in cui percepiamo il tatto, il prurito e il dolore. Di recente abbiamo scoperto il proteasoma della membrana neuronale, un complesso specializzato nella degradazione delle proteine che si trova in alcuni neuroni sensoriali, che funziona per modulare la sensibilità al tatto, al prurito e al dolore. Con questo protocollo, saremo in grado di studiare l'espressione e la dinamica di modulazione dell'NMP in modo specifico per tipo di cellula in condizioni di salute e malattia.

Il nostro protocollo consente l'isolamento dei neuroni che esprimono NMP dai neuroni che non esprimono NMP per poter studiare la loro funzione con la specificità del tipo di cellula. È importante sottolineare che queste popolazioni neuronali isolate rimangono vitali per le analisi a valle. Con questi protocolli, inizieremo a studiare come diverse condizioni neuropatiche influenzano l'espressione e la funzione dell'NMP e come questo contribuisce all'alterazione del tatto, del prurito e della sensazione di dolore.

Per iniziare, trasferisci i gangli della radice dorsale raccolti in un tubo conico da 15 millilitri. Utilizzando una pipetta, aggiungere sette millilitri di soluzione di lavoro della miscela di enzimi di dissociazione tissutale alla provetta e incubare a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione per 20 minuti. Mettere la provetta in una centrifuga e centrifugare i gangli a 120 g per due minuti.

Aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere i gangli in sette millilitri di miscela di enzima di dissociazione tissutale a bassa triturazione con papaina. Dopo aver centrifugato nuovamente la provetta, aspirare ed eliminare il surnatante.

Quindi risospendere i gangli in 500 microlitri di soluzione BSA, TI e DMEM. Utilizzando una pipetta da pascolo in vetro lucidato a fuoco da un millilitro, triturare i gangli da 12 a 16 volte. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri per filtrare i detriti cellulari.

Lavare il colino con un millilitro di soluzione di BSA, TI e DMEM per raccogliere i neuroni rimanenti dei gangli della radice dorsale. Trasferire la sospensione cellulare filtrata in una provetta conica da 15 millilitri. Preparare un vassoio di colorazione per immunofluorescenza foderandolo con un grosso pezzo di parafilm.

Utilizzando una pinza sterile da 5 a 45, trasferire i vetrini coprioggetti dal piatto di coltura tissutale sul parafilm, assicurandosi che il lato contenente i neuroni dei gangli della radice dorsale sia rivolto verso l'alto. Pipettare lentamente 100 microlitri di terreno dei gangli della radice dorsale su ciascun vetrino coprioggetti per evitare che le cellule si secchino. Quindi diluire l'anticorpo primario go anti PSM alpha two nei gangli della radice dorsale caldi per ottenere una diluizione da uno a 20.

Utilizzando un aspiratore dotato di punta P10 non filtrata, rimuovere lentamente il supporto dal bordo di ciascun vetrino coprioggetto. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpi go anti PSM alpha two a ciascun vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti. Successivamente, aspirare con cura la soluzione di anticorpi primari da ciascun vetrino coprioggetti.

Aggiungere 100 microlitri di PBS a temperatura ambiente alle cellule e incubare a temperatura ambiente per tre minuti per lavare. Ora, per preparare l'anticorpo secondario anti go, diluirlo in un terreno caldo dei gangli della radice dorsale con una diluizione da uno a 250. Dopo aver completato il terzo lavaggio, aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpi secondari diluita a ciascun vetrino coprioggetti.

Incubare i vetrini coprioggetto a temperatura ambiente per 40 minuti proteggendo le cellule dalla luce. Quindi aspirare la soluzione di anticorpi secondari dai vetrini coprioggetti e lavare le cellule tre volte, utilizzando il PBS come descritto in precedenza. Dopo il lavaggio finale con PBS, aggiungere 100 microlitri di soluzione fissativa contenente il 4% di para formaldeide e il 4% di saccarosio in PBS.

Una volta che le cellule sono state incubate a temperatura ambiente per 10 minuti, aspirare il fissativo da ciascun vetrino coprioggetti. Quindi lavare le celle tre volte con PBS come descritto in precedenza. Per permeabolizzare le cellule, aggiungere 100 microlitri di detergente non ionico allo 0,1% in PBS.

Incubare i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aspirare la soluzione permeabile dai vetrini coprioggetti e lavare le celle tre volte, utilizzando PBS come descritto in precedenza. Aggiungere 100 microlitri di soluzione bloccante composta dal 5% di siero fetale bovino e dal 5% di siero d'asino in PBS a ciascun vetrino coprioggetti.

Successivamente, diluire l'anti CGRP di coniglio, il coniugato di biotina A selectina B e l'anti NFH di pollo nella soluzione bloccante per preparare la miscela di anticorpi primari specifica per il tipo di cellula del neurone del ganglio della radice dorsale. Aspirare la soluzione bloccante dai vetrini coprioggetti, quindi aggiungere 100 microlitri della miscela di anticorpi primari preparata a ciascun vetrino coprioggetti. Incubare i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente per 45 minuti proteggendoli dalla luce.

Successivamente, rimuovere la soluzione di anticorpi primari dai vetrini coprioggetti e lavare le cellule tre volte, utilizzando il PBS come descritto in precedenza. Ora prepara la miscela di anticorpi secondari diluendo la streptavidina, l'asino anti coniglio e l'asino anti pollo da uno a 500 ciascuno in soluzione bloccante. Aspirare il lavaggio finale con PBS da ciascun vetrino coprioggetti, quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpi secondari preparata.

Incubare i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente per 45 minuti al buio. Aspirare il lavaggio finale dal vetrino coprioggetto. Utilizzando una pinza a punta sottile, sollevare ciascun vetrino coprioggetto dal parafilm e asciugare delicatamente il liquido in eccesso toccando il bordo del vetrino coprioggetti su un fazzoletto privo di lanugine.

Posizionare una goccia di sette microlitri di terreno di montaggio su un vetrino da microscopio. Abbassare con cautela il vetrino coprioggetto sul supporto di montaggio con il lato della cella rivolto verso il basso, assicurandosi del pieno contatto con il fluido. Metti i vetrini preparati in un cassetto buio e asciutto o in una scatola ad asciugare per almeno un'ora.

Sigillare il bordo del vetrino coprioggetto con smalto ad asciugatura rapida e attendere da 10 a 15 minuti prima dell'imaging. Gli anticorpi che si nutrono di neuroni vivi del ganglio della radice dorsale hanno rivelato una sottopopolazione di neuroni con proteosomi accessibili in superficie, mentre i campioni di controllo privi di anticorpi primari non hanno mostrato alcuna marcatura in superficie. La citometria a flusso ha identificato due popolazioni distinte di neuroni gangliari della radice dorsale, in base all'intensità della fluorescenza, separando le cellule NMP positive da quelle NMP negative con chiare regioni di gating stabilite, utilizzando i controlli.

La quantificazione delle popolazioni ordinate a flusso ha mostrato che circa il 4% dei neuroni gangliari della radice dorsale erano NMP positivi, mentre la restante maggioranza era NMP negativa. I neuroni NMP positivi e NMP negativi selezionati hanno mantenuto la vitalità ed espresso i marcatori specifici del tipo di cellula NFH, IB four e CGRP, confermando l'idoneità del flusso di lavoro per l'analisi molecolare a valle.