Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare le proteine sulla superficie di neuroni viventi e successivamente distinguere le proteine di superficie da quelle internalizzate mediante un'etichettatura differenziale con anticorpi secondari. Per raggiungere questo scopo, neuroni primari coltivati su vetrini sono incubati con un anticorpo diretto contro un epitopo di superficie e successivamente lasciati in incubazione per permettere l'internalizzazione. Al termine dell'incubazione, viene aggiunto un anticorpo secondario marcato con un fluorocromo per identificare le proteine esposte sulla superficie.

Successivamente, viene applicato un eccesso di anticorpo secondario non marcato per bloccare eventuali complessi rimanenti tra anticorpo primario e proteina di superficie. I neuroni in coltura vengono quindi permeabilizzati e viene applicato un anticorpo secondario di colore diverso per rilevare la proteina internalizzata. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano i livelli relativi di proteina internalizzata rispetto a quella di superficie mediante microscopia a immunofluorescenza.

Seguendo questa procedura, è possibile ottenere un andamento temporale dell'internalizzazione delle proteine di superficie della sorgente, fornendo informazioni sui tassi di traffico proteico in condizioni basilari e stimolate. Iniziare questa procedura preparando copriletto per la coltura cellulare: copriletto in vetro borosilicato da 18 millimetri rivestiti con polilisina, preparati il giorno precedente immergendoli in tre recipienti separati contenenti PBS. Aggiungere 500 microlitri di soluzione laminina nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti, quindi, utilizzando pinze, posizionare i copriletto in ciascun pozzetto. Premere delicatamente su ogni copriletto per assicurarsi che sia ben appiattito sul fondo del pozzetto e incubare per due ore a 37 gradi Celsius. Questo protocollo può essere eseguito utilizzando sia cortecce di topo E15 che ippocampi di ratto E18.

In questa dimostrazione, vengono utilizzate cortecce di topo. Posizionare le cortecce provenienti da metà di una cucciolata o da un'intera cucciolata di embrioni su ghiaccio in un eppendorf da un millilitro contenente PBS con calcio e magnesio e porre sul ghiaccio. Successivamente, utilizzando una micropipetta da un millilitro, rimuovere il PBS dal tessuto corticale.

Quindi aggiungere 500 microlitri di una soluzione Pappa DNA al tessuto corticale proveniente da metà di una cucciolata di embrioni. Incubare a 37 gradi Celsius per 15-20 minuti. Durante il periodo di incubazione, agitare delicatamente il tubo due volte per mescolare il contenuto; al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta Pasteur silanizzata e levigata alla fiamma per risospendere delicatamente il tessuto da 10 a 15 volte, fino a ottenere una dispersione cellulare.

Pochi, se non nessun frammento di tessuto non dissociato, dovrebbero rimanere; evitare la formazione di bolle. Stratificare con attenzione la sospensione cellulare dissociata sopra un cuscino di tre millilitri di BSA al 4% in Hank's BSS con additivi. Successivamente, in una centrifuga da banco con rotore a cestello oscillante, centrifugare a 100 × g per sette minuti.

Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il soprannatante avendo cura di non aspirare il pellet cellulare. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo neurobasale completo ed eseguire alcune pipettature delicate su e giù per risospendere le cellule pelletizzate. Successivamente, utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione di cellule vitali.

Subito prima della semina, si devono considerare vitali solo le cellule con fase luminosa. Aspirare la soluzione eccessiva di siero laminina dai coverslip nelle pozzette e sostituirla con mezzo di coltura per neuroni primari. Quindi aggiungere da 75.000 a 100.000 neuroni primari in ogni pozzetta.

Coltivare i neuroni fino a 21 giorni in mezzo basale per neuroni a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica; al settimo giorno e ogni settimana successiva, aggiungere fluorodesossiuridina anti-mitotica per prevenire la sovracrescita gliale ed effettuare un cambio parziale del mezzo. Durante la prima settimana di coltura, i neuroni sviluppano alberi dendritici come mostrato in questa immagine di una coltura di due giorni. Dalla seconda alla terza settimana, i neuroni maturano e iniziano la sinaptogenesi.

Una vasta rete di proiezioni è illustrata in questa figura ottenuta a 14 giorni in vitro per etichettare le proteine di interesse esposte sulla superficie, aggiungere l'anticorpo primario direttamente nel mezzo condizionato alla concentrazione appropriata. Ogni condizione deve essere testata in triplicato. Quattro controlli, siero pre-immune o anticorpi che riconoscono regioni intracellulari della proteina che non sono esposte durante l'esocitosi, possono essere utilizzati alla stessa diluizione dell'anticorpo primario in prova. Reintrodurre le cellule nell'incubatore di coltura per un, due o quattro ore; dopo l'incubazione, aspirare il mezzo contenente l'anticorpo e lavare i pozzetti una volta delicatamente ma rapidamente con PBS.

Aggiungere la soluzione a temperatura ambiente nei pozzetti, quindi aspirare. Poi aggiungere paraformaldeide al 4% appena preparata e incubare per cinque minuti. Aggiungere la temperatura ambiente per fissare le cellule dopo la fissazione.

Rimuovere la soluzione di paraformaldeide dalle pozzette e smaltirla in un contenitore per rifiuti liquidi all'interno della cappa. Quindi risciacquare rapidamente le cellule tre volte con PBS come in precedenza. Lasciare il terzo risciacquo in atto in modo che il coverslip possa essere facilmente rimosso.

Successivamente, utilizzare pinzette per rimuovere con attenzione i coprioggetti dalla piastra e posizionarli con il lato delle cellule rivolto verso l'alto su un foglio di parafilm situato sulla base o sul coperchio di una piastra per colture monouso. Il resto del protocollo di colorazione verrà eseguito su questa superficie: pipettare delicatamente la soluzione bloccante costituita da PBS 5% BSA sulle cellule, formando una goccia di forma sferica sul coprioggetto in modo che non si secchi. Incubare per 30 minuti.

È importante ricordare di non aggiungere detergente alla soluzione di blocco. A questo stadio, le cellule non devono essere rese permeabili quando si desidera etichettare solo le proteine della superficie cellulare. Dopo il blocco, aspirare la soluzione di blocco, quindi applicare un anticorpo secondario marcato con un fluorocromo per etichettare le proteine esposte sulla superficie, e incubare per due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aspirare l'anticorpo secondario e lavare le lamelle due volte con PBS, per cinque minuti ciascun lavaggio, al fine di bloccare qualsiasi proteina sulla superficie cellulare non legata dall'anticorpo secondario marcato.

Incubare i neuroni non permeabili con un'alta concentrazione di anticorpo secondario non marcato durante la notte. A temperatura ambiente. L'incubazione durante la notte è fondamentale.

Periodi di incubazione più brevi non bloccheranno completamente alcun anticorpo primario che non sia completamente legato dall'anticorpo secondario marcato. Il giorno successivo, lavare le lamelle due volte per cinque minuti ciascuna con PBS come in precedenza. Quindi fissare nuovamente le cellule con paraformaldeide al 4% nel tampone fosfato per cinque minuti a temperatura ambiente dopo la rimozione del fissativo.

Risciacquare rapidamente le cellule due volte con PBS. Successivamente, per l'etichettatura intracellulare, permeabilizzare e bloccare le cellule con PBS contenente 5% BSA e 0,1% Triton X-100 a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo la permeabilizzazione, rimuovere la soluzione di blocco.

Avendo cura che i vetrini non si secchino. Aggiungere un anticorpo secondario con marcatura diversa e incubare per due ore a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il secondo anticorpo secondario, lavare i vetrini tre volte per cinque minuti con PBS.

Quindi lavarli brevemente con acqua deionizzata. Montare i coprioggetti su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso contenente un agente anti-sfaldamento e lasciarli asciugare. Conservare i vetrini al buio a quattro gradi Celsius per una conservazione ottimale del segnale fluorescente. Acquisire le immagini delle cellule immuno marcate mediante microscopio confocale, utilizzando i filtri di eccitazione e di emissione appropriati.

Utilizzare gli stessi parametri di acquisizione delle immagini per tutti i replicati e le condizioni dopo l'acquisizione. Utilizzare un software standard di analisi delle immagini, come Fiji Image J o Metamorph, per determinare la densità integrata di regioni standard di interesse o gli attributi di Punta, come numero e dimensione, al fine di verificare la presenza e l'internalizzazione dalla superficie neuronale del gene correlato alle crisi sei o says sei. L'etichettatura a doppio colore di neuroni ippocampali di ratto in coltura è stata eseguita come descritto in questo video.

In questa immagine, la proteina della superficie cellulare marcata è mostrata in ciano e la proteina internalizzata è mostrata in verde. La doppia colorazione indicata dalla freccia è stata osservata soltanto in una cellula che appariva non sana. Per determinare se la proteina internalizzata durante l'incubazione con l'anticorpo si localizzasse negli endosomi, i neuroni esprimenti il marcatore degli endosomi di riciclo precoce transferrina mCherry sono stati sottoposti a immunomarcatura dopo permeabilizzazione. Come mostrato in questa regione dell'albero dendritico, si è osservato un ampio sovrapporsi della colorazione puntiforme con la transferrina, confermando che la proteina internalizzata si localizza negli endosomi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che un singolo anticorpo può essere utilizzato per distinguere tra le popolazioni di proteine sulla superficie cellulare e quelle internalizzate.