Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di marcare le proteine sulla superficie dei neuroni viventi e di distinguere successivamente le proteine di superficie dalle proteine internalizzate utilizzando la marcatura differenziale degli anticorpi secondari. Per fare ciò, i neuroni primari coltivati su un vetro di copertura vengono incubati con un anticorpo diretto contro un epitopo di superficie e incubati per consentire l'internalizzazione. Dopo l'incubazione, viene applicato un anticorpo secondario marcato in fluorescenza per identificare le proteine esposte in superficie.

Quindi viene applicato un eccesso di anticorpi secondari non marcati per bloccare eventuali complessi di anticorpi primari proteici di superficie rimanenti. I neuroni in coltura vengono quindi permeati e viene applicato un anticorpo secondario di colore diverso per rilevare la proteina internalizzata. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i livelli relativi di proteine internalizzate rispetto a quelle di superficie attraverso la microscopia a immunofluorescenza.

Seguendo questa procedura, è possibile ottenere un andamento temporale dell'internalizzazione delle proteine di superficie di origine che fornisce informazioni sui tassi di traffico proteico in condizioni di basilico e stimolate. Iniziare questa procedura preparando i vetrini coprioggetti per il lavaggio delle colture cellulari Vetrini coprioggetti in vetro bolico da 18 millimetri rivestiti in polilisina preparati un giorno prima immergendoli in tre vaschette di risciacquo separate contenenti PBS Aggiungere 500 microlitri di soluzione laminata ai pozzetti di una piastra a 12 pozzetti, quindi utilizzando una pinza, posizionare i vetrini coprioggetti in ciascuno. Premere bene su ogni vetrino coprioggetti per assicurarsi che sia posizionato piatto alla base del pozzetto incubare per due ore a 37 gradi Celsius, questo protocollo può essere eseguito utilizzando cortecce di topo E 15 o ippopotamo di ratto E 18 Campi.

In questa dimostrazione, vengono utilizzate le cortecce topo. Mettere le cortecce di mezza cucciolata o di una cucciolata di embrioni sul ghiaccio in un einor da un millilitro contenente PBS con calcio e magnesio e metterle sul ghiaccio. Successivamente, utilizzando una micropipetta da un millilitro, rimuovere il PBS dal tessuto corticale.

Quindi aggiungere 500 microlitri di una soluzione di DNA Pappa al tessuto corticale di mezza cucciolata di embrioni. Incubare a 37 gradi Celsius per 15-20 minuti. Due volte durante il periodo di incubazione, muovere delicatamente la provetta per mescolare il contenuto dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta per pasta siliconata lucidata a fiamma per rivalutare delicatamente il tessuto da 10 a 15 volte fino a ottenere la dispersione cellulare.

Pochi, se non nessuno, pezzi di tessuto non dissociato dovrebbero rimanere, per evitare la generazione di bolle. Stratificare accuratamente la sospensione cellulare dissociata su un cuscino da tre millilitri di 4% BS, A nel BSS di Hank con additivi. Quindi in una centrifuga da banco con una centrifuga a rotore oscillante a 100 volte G per sette minuti.

Dopo la centrifuga, rimuovere con cura il surnatante facendo attenzione a non aspirare il pellet cellulare. Quindi aggiungere un millilitro di terreno neurobasale completo, pipettare delicatamente su e giù per risospendere le cellule pellettate. Successivamente, utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione di cellule vive.

Solo le celle lucide in fase devono essere considerate in tensione immediatamente prima della placcatura. Aspirare la soluzione di siero laminato in eccesso dai vetrini di copertura nei pozzetti e sostituirla con un terreno di coltura per neuroni primari. Quindi aggiungere da 75.000 a 100.000 neuroni primari a ciascun pozzetto.

Coltivare i neuroni per un massimo di 21 giorni in mezzo neuro basale a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica il settimo giorno e, successivamente, ogni settimana, aggiungere fluoro anti-mitotico, deossi uridina uridina per prevenire la crescita eccessiva gliale ed eseguire un mezzo cambio di mezzo. Durante la prima settimana di coltura, i neuroni hanno sviluppato pergole dendritiche come mostrato in questa immagine di una coltura di due giorni. Entro la seconda o la terza settimana, sono maturati e saranno sottoposti a sinaptogenesi.

Una vasta rete di proiezioni è illustrata in questa figura presa a 14 giorni in vitro per marcare le proteine esposte in superficie di interesse, aggiungere l'anticorpo primario direttamente al terreno condizionato alla concentrazione appropriata. Ogni condizione deve essere testata in triplice copia Quattro controlli, siero preimmune o anticorpi che riconoscono le regioni intracellulari della proteina che non sono esposte durante l'esocitosi possono essere utilizzati alla stessa diluizione dell'anticorpo primario del test. Rimettere le cellule nell'incubatore di coltura per una, due o quattro ore dopo l'incubazione, aspirare il terreno contenente anticorpi, lavare i pozzetti una volta delicatamente ma rapidamente con PBS.

Aggiungere la temperatura ambiente aggiungendo la soluzione ai pozzetti, quindi aspirando. Quindi aggiungere il 4% di formaldeide appena preparato e incubare per cinque minuti. Aggiungere la temperatura ambiente per fissare le celle dopo il fissaggio.

Rimuovere la soluzione di para formaldeide dai pozzetti e gettarla in un contenitore per rifiuti liquidi nella cappa aspirante. Quindi sciacquare rapidamente le cellule tre volte con PBS come prima. Lasciare il terzo lavaggio in posizione in modo che il vetrino coprioggetto possa essere facilmente rimosso.

Quindi, utilizzare una pinza per rimuovere con cura i vetrini coprioggetto dalla piastra e posizionarli con la cellula rivolta verso l'alto su un foglio di param sulla base o sul coperchio di una piastra di coltura monouso. Il resto del protocollo di colorazione verrà eseguito su questa superficie, pipettando delicatamente la soluzione bloccante di PBS 5%BSA sulle cellule per formare una goccia arrotondata a forma di bolla sul vetrino coprioggetti in modo che non si secchi. Incubare per 30 minuti.

È importante ricordare di non aggiungere detersivo alla soluzione bloccante. In questa fase, le cellule non devono essere permeate quando devono essere marcate solo le proteine della superficie cellulare. Dopo il blocco, aspirare la soluzione bloccante, quindi etichettare le proteine esposte in superficie, applicare un anticorpo secondario marcato in fluorescenza, quindi incubare per due ore a temperatura ambiente dopo l'incubazione, aspirare l'anticorpo secondario e lavare i vetrini coprioggetto due volte con PBS per cinque minuti ogni volta per bloccare qualsiasi proteina sulla superficie cellulare non legata dall'anticorpo secondario marcato.

Incubare i neuroni non permeabili con un'alta concentrazione di anticorpi secondari non marcati durante la notte. A temperatura ambiente. L'incubazione notturna è fondamentale.

Periodi di incubazione più brevi non bloccheranno completamente gli anticorpi primari che non sono completamente legati dall'anticorpo secondario marcato. Il giorno successivo, lavare i vetrini coprioggetto due volte per cinque minuti ciascuno con PBS come prima. Quindi postfissare le cellule con il 4% di para formaldeide in tampone fosfato per cinque minuti a temperatura ambiente dopo la rimozione del fissativo.

Sciacquare rapidamente le celle due volte con PBS. Successivamente, per la marcatura intracellulare, permeare e bloccare le cellule con PBS contenente il 5% di BSA e lo 0,1% di Triton X 100 a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo la permeazione, rimuovere la soluzione bloccante.

Fare attenzione che i vetrini coprioggetto non si secchino. Aggiungere un anticorpo secondario marcato in modo diverso e incubare per due ore a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il secondo anticorpo secondario, lavare i vetrini coprioggetto tre volte per cinque minuti con PBS.

Quindi lavarli brevemente con acqua deionizzata. Il coperchio scivola sui vetrini con un mezzo di montaggio acquoso contenente un agente anti-sbiadimento e consente loro di conservare a secco i vetrini al buio a quattro gradi Celsius per una conservazione ottimale del segnale fluorescente. Visualizzare le cellule immunocoloranti su un microscopio confocale utilizzando gli appropriati filtri di eccitazione ed emissione.

Utilizzare gli stessi parametri di acquisizione dell'imaging per tutte le repliche e le condizioni successive all'imaging. Utilizzare software standard di analisi delle immagini come Fiji Image J o metamorph per determinare la densità integrata delle regioni standard di interesse o gli attributi Punta, come il numero e le dimensioni, per determinare se il gene sei correlato alla crisi era presente e internalizzato dalla superficie del neurone. La marcatura a doppio colore dei neuroni ippocampali di ratto in coltura è stata eseguita come descritto in questo video.

In questa immagine, la proteina della superficie cellulare etichettata è mostrata in ciano e la proteina internalizzata è mostrata in verde. La doppia colorazione indicata dalla punta di freccia è stata osservata solo in una cellula che sembrava essere malsana per determinare se la proteina internalizzata durante l'incubazione dell'alimentazione degli antisomi localizzata negli endosomi i neuroni che esprimono il marcatore dell'endosoma di riciclaggio precoce transferrina mCherry erano immuno colorati dopo la permeazione come mostrato in questa regione dell'albero dendritico, c'era un'ampia sovrapposizione della colorazione puntata con la transferrina che confermava che la proteina internalizzata si localizzava negli endosomi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che un singolo anticorpo può essere utilizzato per distinguere tra la superficie cellulare e i pool proteici internalizzati.