Name: Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Impara a etichettare proteine di superficie e internalizzate in neuroni vivi usando anticorpi differenziali. Questa tecnica di microscopia a immunofluorescenza distingue chiaramente le proteine esposte da quelle endocitizzate.

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Gli autori ringraziano Teele Palumaa per l&#39;assistenza con le figure. Finanziato dal progetto di Grant 1008046 dal National Health and Medical Research Council, Australia.

1. Dissociato ippocampale Neuron Cultura <ol><li> Preparare coprioggetto (vetro borosilicato): <ol><li> Lavare in etanolo al 100%. </li><li> Aria secca sotto irraggiamento UV. </li><li> Coat con poli-D-lisina (0,5 mg / ml in 0,15 M tampone borato, una notte a 4 ° C). </li><li> Il giorno successivo (il giorno della cultura) lavare 3 volte in PBS poi cappotto con laminina (2,5 mg / ml, mouse naturale laminina) 5% di siero di vitello + v / v di calore-inattivato fetale (FCS) diluito in PBS per 2 ore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Sezionare embrionali giorno 18 (E18) ippocampo di ratto e raccogliere in PBS contenente calcio e magnesio, refrigerati su ghiaccio. NOTA: tutti i protocolli sperimentali su animali sono stati approvati dal Comitato delle Università di Melbourne etico degli animali. </li><li> Preparare soluzioni di DNasi I papaina e dal kit di papaina dissociazione secondo le istruzioni del produttore. <ol><li> Aggiungere 50 microlitri soluzione di DNasi I per 1 ml di soluzione papaina. </li><li> NOTA: una voltaprima preparata, la soluzione papaina e le soluzioni di DNasi I possono essere somministrati separatamente in aliquote (0,5 ml e 25 microlitri aliquote di papaina e DNasi I, rispettivamente) e conservati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Rimuovere il più possibile PBS e incubare dell&#39;ippocampo (da una cucciolata di embrioni) con 1 ml papaina / DNasi soluzione a 37 ° C per 15-20 min. Flick delicatamente la provetta per mescolare il contenuto due volte durante il periodo di incubazione. </li><li> Triturare il tessuto dell&#39;ippocampo delicatamente (evitando la generazione di bolle) con una pipetta Pasteur siliconata 10-15x fiamma lucidata fino ad ottenere dispersione cellulare e poche, se del caso, pezzi di tessuto non dissociato rimangono. </li><li> Strato con cautela la sospensione cellulare dissociato su un cuscino 3 ml del 4% w / v albumina di siero bovino (BSA) in Hanks soluzione salina bilanciata più additivi (HBSS +; vedi Sezione 1.6.1). <ol><li> Preparare questa soluzione passo gradiente sciogliendo la BSA a temperatura ambiente senza agitazioneAnello in HBSS contenente 2 mM CaCl 2, 1 MgSO mm 4, 4 NaHCO mm 3 e glucosio mm 40 (HBSS +) poi filtro sterile e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Centrifuga, 100 xg, 7 min in una centrifuga da banco con rotore swing-out. </li><li> Rimuovere il surnatante facendo attenzione a non aspirare il pellet. </li><li> Risospendere le cellule pellet delicatamente con un lucido fiamma (siliconata) pipetta Pasteur (o 1 ml blu puntale) in 1 ml di mezzo completo Neurobasal (con il 2% B27, 0.5 mM L-glutammina integrato con 1% FCS). </li><li> Conta due aliquote 10 microlitri utilizzando un emocitometro (NB solo contare le celle in fase brillante come cellule &quot;live&quot;). </li><li> Piatto neuroni primari su vetrini rivestiti già predisposti (0,75-1 x 10 5/18 millimetri coprioggetto in 12-pozzetti). Immediatamente prima di placcatura, aspirare la soluzione laminina / siero in eccesso dal coprioggetto e sostituirlo con terreno di coltura neurone primario (vedi sotto). NB Il n necessariaumero di coprioggetto deve essere determinata in anticipo come preparazione vetrino è iniziata il giorno precedente alla cultura (vedi punto 1.1). </li><li> Cultura ratto primario E18 neuroni dell&#39;ippocampo per un massimo di 21 giorni in vitro (DIV) in Neurobasal medio, 2% B27, 0.5 mM L-glutammina supplementato con 1% FCS (inattivato con il calore). Eseguire un cambiamento mezza mezzo alle 7 DIV e poi settimanalmente. L&#39;anti-mitotico fluorodeossiuridina / uridina è aggiunto 7 DIV, 1/1, 000 diluizione di 10 stock mM di ciascun nucleoside) per prevenire la crescita eccessiva gliale. </li></ol> 2. Incubazione di Live neuroni <ol><li> Durante la prima settimana di cultura, i neuroni stanno sviluppando pergole dendritiche e per settimana 2-3, i neuroni hanno maturato sufficiente essere in fase di synaptogenesis 6,7. <ol><li> Al selezionati time sperimentale di punti / s, applicare l&#39;anticorpo primario di triplicare pozzetti contenenti neuroni embrionali primarie sul coprioggetto. Aggiungere un volume dell&#39;anticorpo direttamente nel mezzo di coltura dii neuroni primari alla diluizione finale desiderato Nota: In questo esempio, un antisiero policlonale di coniglio diretto contro una forma secreta della proteina ricombinante è stato diluito 1/500 con l&#39;aggiunta di 2 ml di 1 ml di terreno di coltura in bene; una centrifugazione per 10 min , 13.000 xg, RT può essere incorporato prima di prendere una aliquota di anticorpo come questo sarà rimuovere particelle e può aiutare a ridurre sfondo. </li><li> Per i controlli di siero preimmune, aggiungere una quantità equivalente di siero preimmune (alla stessa diluizione finale). Se nessun siero preimmune è disponibile, aggiungere il volume equivalente di Neurobasal media o PBS (senza controllo anticorpo primario). In alternativa, se un anticorpo primario adatto è disponibile che riconosce intracellulare regione / s della proteina, questo anticorpo può essere aggiunto a un controllo bene per testare specificità della colorazione superficiale. </li><li> Riportare le cellule per l&#39;incubatore culturale per 1-4 ore (il periodo di incubazione può essere determinato empiricamente). Nel nostro experimeNTS, l&#39;anticorpo era presente per l&#39;intero periodo anche se il disegno sperimentale potrebbe integrare un impulso di anticorpo seguito da un ulteriore periodo di incubazione dopo wash-out (un esperimento pulse-chase) per valutare l&#39;andamento temporale di internalizzazione. Passaggio facoltativo: Questo incubazione può essere eseguita a temperatura ambiente o anche su ghiaccio per rallentare il tasso di basale proteina interiorizzazione, se necessario. Se eseguita in un ambiente non controllato CO 2, il terreno deve essere cambiato in uno che non è bicarbonato buffer prima aggiunta di anticorpo / antisiero. ATTENZIONE: colture di neuroni maturi (&gt; 14 giorni, e in particolare colture di neuroni embrionali di topo) non tollerano i cambiamenti completi di medie bene. </li></ol></li><li> Abbiamo usato tempi di incubazione per questo anticorpo primario internalizzazione passo di 1 ora, 2 ore, 4 ore e con buoni risultati anche se il tempo ottimale dipenderà abbondanza della proteina di interesse e le dinamiche di traffico di proteine ​​nel cells in fase di studio. NOTA: Le immagini a due colori visualizzati in Risultati rappresentativi sono stati ottenuti con una incubazione di 1 ora a 37 ° C in un incubatore di coltura tissutale. </li><li> Dopo incubazione per il periodo desiderato, aspirare via il mezzo contenente anticorpi. Lavare i pozzetti delicatamente ma rapidamente una volta con PBS a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Anticorpo secondario Applicazione ai fissi, celle Unpermeabilized <ol><li> Fissare i neuroni con il 4% paraformaldeide in tampone fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente Nota: per i migliori risultati, utilizzare fissativo preparato al momento, in alternativa utilizzare correzione che è stata conservata a -20 ° C e completamente scongelati in modo che nessun paraformaldeide precipitato è evidente . ATTENZIONE: fissativo Paraformaldeide dovrebbe essere preparata e gestita in una cappa aspirante. </li><li> Rimuovere fix da pozzi (trasferimento nel contenitore rifiuti liquidi in cappa) e sciacquare 3x con PBS. <ol><li> PASSO OPTIONAL: Se lo si desidera, per risparmiare sui reagenti anticorpi, i coprioggetti puòessere accuratamente rimosso dalla piastra 12 pozzetti con una pinza e collocato cellula-side-up, su un foglio di Parafilm prevista sulla base di una piastra di coltura monouso. </li><li> Le soluzioni possono poi essere pipettati delicatamente sul coprioggetto in modo da essere completamente coperta senza inondazioni soluzione oltre il bordo del vetrino sul parafilm. </li><li> Questa tecnica è adatta per incubazioni breve termine (1-2 hr) tuttavia più incubazioni (ad esempio durante la notte) deve essere effettuata in una camera umidificata. In alternativa, i coprioggetti possono essere riposti nei pozzetti della piastra 12 pozzetti per la notte di incubazione e volume sufficiente devono essere aggiunti per garantire che i coprioggetti non si seccano. </li></ol></li><li> Blocco per 30 min a temperatura ambiente con il 5% BSA in PBS (Nota: non aggiungere detersivo per la soluzione di saturazione in questa fase, è importante che le cellule non sono permeabilizzate). </li><li> Per etichettare proteina di superficie prima di procedere con ricozione di proteine ​​interiorizzata, applicare il primo fluorescente 2 ° anticorpi di scelta. Nota: Nell&#39;esempio qui descritto, l&#39;antisiero primario è stata sollevata nel coniglio (anticorpo in-house) ad una isoforma secreta ricombinante 4. Così, per il primo anticorpo secondario per rilevare la regione extracellulare della isoforma transmembrana sulla superficie dei neuroni unpermeabilized, abbiamo usato asino anti-coniglio DyLight 649 (1/200 diluito in PBS contenente 5% BSA). Si consiglia di centrifugare soluzioni diluite di anticorpo secondario (10 min, 13.000 XG, RT) prima dell&#39;uso. </li><li> Incubare i coprioggetti per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare coprioggetto (in pozzi), 2x 5 minuti con PBS. </li></ol> 4. Blocco con eccesso Unlabeled 2 ° Antibody <ol><li> Bloccare i neuroni unpermeabilized ad alta concentrazione (&gt; 0,1 mg / ml) di anticorpo non marcato 2 °. <ol><li> L&#39;anticorpo non marcato ° 2 deve essere sollevata contro la specie in cuil&#39;anticorpo primario è stata sollevata (in questo caso coniglio) mediante incubazione per una notte a temperatura ambiente. </li><li> Per questo protocollo, AffiniPure F ab frammento IgG di capra anti-coniglio (H + L) è stato utilizzato ad una concentrazione di 0,13 mg / ml. NOTA: La notte di incubazione è risultato essere cruciale come un periodo di incubazione più breve (2 ore) era insufficiente per il completo blocco di anticorpo primario che non è stato completamente vincolata dalla anticorpo secondario marcato. </li></ol></li><li> Lavare coprioggetto (in pozzi), 2x 5 minuti con PBS. </li><li> Dopo questa fase di blocco, post-fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in tampone fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente. Risciacquare con PBS (2x) dopo la rimozione di fissativo (trasferimento fissativo al contenitore dei rifiuti liquidi in cappa). </li></ol> 5. Permeabilizzazione e applicazione della anticorpo Seconda fluorescenza coniugato 2 ° <ol><li> Permeabilize e bloccare le cellule con 5% BSA in PBS contenente 0,1% Triton-X-100 a camera temperatura per 30 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di saturazione (facendo attenzione che i vetrini non si seccano). Aggiungere il secondo fluorescente coniugato 2 ° anticorpo etichettato con un fluoroforo diverso. <ol><li> NOTA: Deve essere possibile distinguere questo tag fluoroforo da quello utilizzato in precedenza, a seconda dei filtri di eccitazione / emissione disponibili sul microscopio confocale (vedi sotto). </li><li> Per l&#39;esempio presentato in questo protocollo, un Alexa Fluor 488 asino coniugato anti-coniglio 2 ° anticorpo è stato usato (1/200 in PBS, 5% BSA e 0,1% Triton-X-100). Incubare 2 ore a temperatura ambiente, quindi rimuovere la soluzione di anticorpi 2 °. </li></ol></li><li> Lavare 3x coprioggetto 5 minuti con PBS e, infine, Lavare rapidamente con acqua deionizzata. </li></ol> 6. Montaggio e Imaging <ol><li> Mount coprioggetto su vetrini con un mezzo contenente il montaggio antifade acquosa (ad es Vectashield) e lasciare asciugare. Conservare al buio a 4 ° C per optimal conservazione della intensità del segnale fluorescente. </li><li> Immagine immunostained celle di un microscopio confocale. <ol><li> Opportuni filtri di eccitazione ed emissione per il rilevamento dei due segnali fluoroforo devono essere disponibili. </li><li> Se diverse condizioni sperimentali devono essere confrontati (per esempio, i tassi di internalizzazione sotto depolarizzati 8,9 o controllo condizioni), in modo che tutti replicano vetrini delle varie condizioni vengono esposte con gli stessi parametri di acquisizione dell&#39;immagine. La densità integrata delle regioni standard di interesse o attributi puncta (ad esempio, numero, dimensione) delle immagini risultanti possono quindi essere misurata utilizzando il software di analisi di immagine standard (ad esempio, Fiji / ImageJ, Metamorph). </li></ol></li></ol>

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<li>Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArancibia-C%C3%A1rcamo%2C+IL+%22The+Dynamic+Synapse%3A+Molecular+Methods+in+Ionotropic+Receptor+Biology%22">The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology</a>. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).</li>
<li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li>
<li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+adaptors+%E2%80%93+social+networking+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La tecnica qui descritta è complementare a quella di biotinylation superficie cellulare (valutato da Arancibia-Carcamo et al.) 12 ed è il metodo di scelta per conservare informazioni sulla localizzazione subcellulare della proteina internalizzato, disponibile un anticorpo primario adatto ad un epitopo extracellulare è disponibile. Inoltre, la quantificazione del traffico di proteine ​​/ internalizzazione nel tempo può essere eseguita (fissando coprioggetto in momenti diversi durante l&#39;incubazione...

Nello stabilire la funzione delle proteine ​​di nuova identificazione, indagine della localizzazione subcellulare e il traffico della proteina in questione può fornire importanti indizi circa il probabile ruolo / s del 1,2 proteine. L&#39;analisi bioinformatica del trascrittoma della neocorteccia di sviluppo 3 ci ha fornito una lista di geni che presentano espressione alterata durante il mouse corticogenesi cervello. Abbiamo quindi adottato un approccio del gene knockout per accertare che la proteina codificata da uno di questi geni, sez6, ha un ruolo chiave nello sviluppo del neurone. Abbiamo osservato che il gene sequestro legati 6, o Sez6, la proteina si trova a dendriti di sviluppo ed è presente anche nelle spine dendritiche, le strutture specializzate in dendriti che ricevono e integrano segnali eccitatori. Inoltre, quando questa proteina viene a mancare, dendriti e sinapsi eccitatorie non riescono a formare correttamente 4. L&#39;isoforma dominante probabile della proteina ha caratteristiche di un transmembrane recettore anche se, quando la distribuzione subcellulare di proteine ​​immunolabeled stata esaminata mediante microscopia confocale o mediante microscopia immunoelettronica maggior parte, se non tutti, del segnale apparso associato con piccole vescicole nel vano Somatodendritic con poca o nessuna, proteina marcata sulla membrana plasmatica sulla superficie cellulare. Per dimostrare definitivamente che questo recettore putativo con un grande dominio extracellulare predetto viene trafficata alla membrana plasmatica, abbiamo adottato un approccio live-cell usando l&#39;antisiero avevamo generato ad una porzione extracellulare della proteina di etichettare proteine ​​sulla superficie cellulare. Combinando questo approccio &quot;anticorpo alimentazione&quot; con due applicazioni di anticorpo secondario differenziale marcato separati da un ampio passo di blocco ed una fase di permeabilizzazione, siamo stati in grado di identificare due diverse piscine di proteine ​​distinte legandosi agli anticorpi secondari fluorescenti marcate cuscinetto diverso fltags ENT. Così, siamo stati in grado di distinguere proteina che era stato internalizzato per endocitosi in fase anticorpo incubazione da proteine ​​che sia rimasto sulla superficie cellulare o è stato oggetto di traffico alla superficie durante questo periodo. Usando questo metodo, abbiamo stabilito che la proteina di interesse viene trafficata da e superficie cellulare nei neuroni. Pertanto, questa tecnica relativamente veloce e semplice dimostrato più informativo rispetto ai metodi tradizionali immunocitochimica o pre-embedding microscopia elettronica immunogold, nonostante il fatto che abbiamo usato lo stesso antisiero policlonale di coniglio per tutte queste tecniche. Questa tecnica è generalmente applicabile a qualsiasi proteina transmembrana fornito una buona anticorpo che riconosce epitopi dominio extracellulare è disponibile. La tecnica è stata utilizzata in precedenza per studiare traffico recettore del recettore glutammato GluR1 subunità 5.

<table><tbody><tr><td>PBS con Ca e Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di dissociazione della papaina</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039; s soluzione salina bilanciata senza calcio, magnesio, rosso fenolo</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Lamina naturale di topo</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Scongelare su ghiaccio prima di fare aliquote</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino HyClone</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorodesossiuridina</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Vetrini coprioggetti rotondi</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>CB00180RA1</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD mezzo di montaggio acquoso</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1400</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio Dylight 649&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-495-152</td><td></td></tr><tr><td>Frammento AffiniPure Fab Capra anti-Coniglio 1gG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>P6148</td><td>TOSSICO - maniglia nella cappa aspirante</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-coniugato asino anticorpo 2&deg;</td><td>Invitrogen - Sonde molecolari</td><td>A21206</td><td></td></tr></tbody></table>

etichettatura differenziale di cell-superficie e interiorizzato proteine ​​dopo antibody alimentazione dal vivo colture di neuroni

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Per dimostrare la localizzazione superficie cellulare di un recettore transmembrana in neuroni in coltura, abbiamo etichettato la proteina sulla superficie dei neuroni vivi con un anticorpo primario specifico sollevato contro una porzione extracellulare della proteina. Dato che i recettori sono trafficate da e verso la superficie, se le cellule vengono permeabilizzate dopo fissazione quindi sia sulla superficie cellulare e proteine ​​interna verrà rilevato dal medesimo anticorpo secondario marcato. Qui, abbiamo adattato un metodo utilizzato per studiare traffico di proteine ​​(&quot;alimentazione anticorpo&quot;) per differenzialmente proteina etichetta che era stato internalizzato per endocitosi in fase di incubazione anticorpo e proteina che sia rimasto sulla superficie cellulare o è stato oggetto di traffico alla superficie durante questo periodo . La capacità di distinguere queste due piscine di proteine ​​è stato reso possibile attraverso l&#39;incorporazione di un passo di blocco durante la notte con l&#39;anticorpo secondario marcato altamente concentrato, dopo un iniziale incubation di neuroni unpermeabilized con un anticorpo secondario fluorescente marcato. Dopo il blocco, passo, permeabilizzazione dei neuroni consentiti rilevamento della piscina internalizzato con un anticorpo secondario fluorescente marcato con un fluoroforo diverso. Utilizzando questa tecnica siamo riusciti ad ottenere importanti informazioni circa la posizione subcellulare di questo recettore putativo, rivelando che si trattava, infatti, di tratta alla superficie cellulare nei neuroni. Questa tecnica è ampiamente applicabile ad una gamma di tipi di cellule e proteine ​​di superficie cellulare, fornendo un anticorpo adatto ad un epitopo extracellulare è disponibile.

Il bicolore tecnica immunoistochimica fluorescente qui presentato è utile per etichettare domini extracellulari di proteine ​​transmembrana in cellule viventi (mostrato schematicamente in figura 1). Durante il periodo di incubazione, le immunoglobuline si legano epitopi accessibili e una parte della popolazione di molecole proteiche, insieme con anticorpo legato, è endocitosi. Inoltre, le proteine ​​di nuova sintesi può raggiungere la superficie cellulare attraverso un traffico di andata e molecole prot...

Descriviamo un metodo per etichettare proteina sulla superficie dei neuroni viventi utilizzando un anticorpo policlonale specifico per epitopi extracellulari. Proteina legata per l&#39;anticorpo sulla superficie cellulare e successivamente internalizzato tramite endocitosi può essere distinta dalla proteina rimanente, o trafficate, la superficie durante l&#39;incubazione.

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare le proteine sulla superficie di neuroni viventi e successivamente distinguere le proteine di superficie da quelle internalizzate mediante un'etichettatura differenziale con anticorpi secondari. Per raggiungere questo scopo, neuroni primari coltivati su vetrini sono incubati con un anticorpo diretto contro un epitopo di superficie e successivamente lasciati in incubazione per permettere l'internalizzazione. Al termine dell'incubazione, viene aggiunto un anticorpo secondario marcato con un fluorocromo per identificare le proteine esposte sulla superficie.Successivamente, viene applicato un eccesso di anticorpo secondario non marcato per bloccare eventuali complessi rimanenti tra anticorpo primario e proteina di superficie. I neuroni in coltura vengono quindi permeabilizzati e viene applicato un anticorpo secondario di colore diverso per rilevare la proteina internalizzata. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano i livelli relativi di proteina internalizzata rispetto a quella di superficie mediante microscopia a immunofluorescenza.Seguendo questa procedura, è possibile ottenere un andamento temporale dell'internalizzazi

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Dimostriamo l'uso della pistola gene di introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni in fettine di cervello di roditori e primati non umani di età diverse. In questo caso particolare, noi usiamo topi adulti (3-6 mesi) e adulti scimmie cynomologus (9-15 anni). Questa tecnica, originariamente descritta dal laboratorio del Dr. Lichtman...

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

Un approccio rapido per investigare le interazioni e gli effetti sui meccanismi molecolari legati alla presenza di anticorpi in un ambiente intracellulare viene descritto. Il metodo comporta la transfezione di anticorpi nelle cellule vive utilizzando un non-covalente formazione del complesso basato su una formulazione lipidica. La tecnica è adattabile a linee cellulari immortalizzate e cellule primarie.

Trasfezione anticorpo in neuroni come strumento per studiare patogenesi della malattia

Presentiamo una tecnica per l'etichettatura singoli neuroni nel sistema nervoso centrale...

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) con una elevata capacità di fagocitare o fagocitare materiale nel loro ambiente extracellulare. Qui, un saggio largamente applicabile, affidabile e altamente quantitativa per la visualizzazione e la misurazione microglia-mediata fagocitazione dei componenti sinaptiche è descritto.

Un test Engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni

Forniamo una descrizione dettagliata di un protocollo per l'analisi citofluorimetrica di antigeni di superficie e/o antigeni intracellulari in tipi di cellule neurali. Vengono spiegati gli aspetti critici della pianificazione sperimentale, le procedure metodologiche passo-passo e i principi fondamentali della citometria a flusso al fine di consentire ai neurobiologi di sfruttare questa potente tecnologia.

Citometria a flusso Protocolli per superficie e intracellulare Antigen analisi di tipi di cellule neurali

Traffico Receptor modula la segnalazione e la cellula di risposta ai ligandi ed è, a sua volta, sensibile alle condizioni di cellulari, tra cui la segnalazione ligando-indotta. Qui, descriviamo una tecnica potente e flessibile per la valutazione quantitativa farmaco-indotta traffico recettoriale utilizzando immunomarcatura e analisi colocalizational.

Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational

L'indagine sul traffico di membrana è fondamentale per la comprensione delle funzioni neuronali. Qui introduciamo un metodo per quantificare la motilità della vescicola nei neuroni. Questo è un metodo conveniente che può essere adattato alla quantificazione del traffico di membrana nel sistema nervoso.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

Presentato qui è un protocollo che combina un sistema di cocoltura neurale-endoteliale in vitro e l'incorporazione metabolica di sialoglycan con gruppi funzionali bioortogonali per espandere le cellule staminali primarie e progenitrici ed etichettare la loro superficie sialoglycoproteins per l'imaging o l'analisi della spettrometria di massa dei marcatori di superficie cellulare.

Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan

Eccitabilità di un neurone può essere modulata attraverso un processo dinamico di endo - ed esocitosi dei ricevitori ionotropici eccitanti del glutammato. Descritto qui è un test accessibile, ad alto contenuto per la quantificazione del recettore di superficie e interno popolazione piscine.

Un'analisi ad alto contenuto per monitoraggio AMPA traffico recettoriale

Questo articolo presenta un metodo per studiare il recettore del glutammato (GluR) nel traffico di cellule ippocampali primarie dissociate. Utilizzando un approccio anticorpale-alimentazione per etichettare i recettori endogeni o sovraespressi in combinazione con approcci farmacologici, questo metodo consente l'identificazione di meccanismi molecolari che regolano l'espressione della superficie di GluR modulando processi di internalizzazione o riciclaggio.

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Il proteasoma della membrana neuronale (NMP) è stato recentemente identificato in un sottogruppo di neuroni somatosensoriali come regolatore chiave della percezione del tatto, del dolore e del prurito. Questo articolo presenta un solido flusso di lavoro per l'analisi dell'espressione e della funzione NMP specifica del tipo di cellula utilizzando la selezione cellulare, la profilazione del trascrittoma e le analisi immunofluorescenti basate su colture.

Analisi specifica del sottotipo cellulare del proteasoma della membrana neuronale nei neuroni somatosensoriali

Impara a etichettare proteine di superficie e internalizzate in neuroni vivi usando anticorpi differenziali. Questa tecnica di microscopia a immunofluorescenza distingue chiaramente le proteine esposte da quelle endocitizzate.

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni (Video) | JoVE Journal

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

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