Analisi ottimizzata delle proteine di ovociti ed embrioni di Xenopus mediante immunoblotting

Nel corso della vita di un animale, si verificano continuamente decisioni sui solfati, che consentono il normale sviluppo e la salute di un organismo adulto. Queste decisioni dipendono da specifiche proteine riferite ai regolatori del solfato. L'obiettivo della nostra ricerca è quello di trovare i meccanismi che controllano la sintesi di questi regolatori critici.

Oltre a fornire una descrizione dettagliata dell'immunoblotting e degli ovociti e degli embrioni di Xenopus, il nostro protocollo fornisce informazioni sulle sfide comuni a questo organismo modello, come l'approvvigionamento di anticorpi. Attraverso uno studio approfondito dei meccanismi di legame e repressione della C bicaudale, la nostra ricerca ha contribuito a stabilire una base di informazioni con cui confrontare altri regolatori traslazionali. Per iniziare a processare le cellule per l'immunoblotting, aggiungere 10 microlitri di tampone di lisi cellulare refrigerato diluito a una concentrazione pari a una volta con doppia acqua deionizzata per embrione o ovocita.

Utilizzando un micropestello, omogeneizzare i campioni sul ghiaccio. Posizionare le provette in una centrifuga da banco e centrifugare i campioni a 5.000 g a quattro gradi Celsius per 10 minuti per ottenere detriti di pellet, inclusi tuorlo e pigmenti insolubili. Trasferire il surnatante in una provetta pulita da 1,5 millilitri, assicurandosi che il pellet non venga disturbato durante il trasferimento.

Aggiungere un volume uguale di tampone campione Laemmli due volte integrato con il 5% in peso per volume di 2-mercaptoetanolo al surnatante raccolto. Scaldare la miscela a 95-100 gradi Celsius per 10 minuti per denaturare le proteine. Ora, rimuovi un gel prefabbricato SDS dal 4 al 12% di bis-tris dalla sua confezione e stacca l'adesivo dal fondo del gel.

Inserire il gel nel gruppo elettrodo di fronte a una diga tampone e posizionare l'intero gruppo in un serbatoio di elettroforesi verticale. Quindi, riempire sia il gruppo elettrodo che il fondo del serbatoio con il tampone di corsa Tris-MOPS-SDS. Rimuovere delicatamente il pettine di gel e il tampone di scorrimento della pipetta nei pozzetti per eliminare le bolle ed equilibrare il tampone.

A questo punto, caricare cinque microlitri di standard proteici precolorati nel primo pozzetto e 10 microlitri di ciascun campione preparato nei pozzetti rimanenti. Posizionare il coperchio sul serbatoio dell'elettroforesi e collegarlo a un alimentatore. Quindi, impostare la tensione a 200 volt per avviare l'elettroforesi.

Interrompere l'elettroforesi una volta che il colorante campione-tampone esce dal gel. Prima del completamento dell'elettroforesi, iniziare a montare il sandwich di trasferimento nella clip di trasferimento. Riempire una teglia di vetro con un tampone di trasferimento freddo e immergere tutti i materiali di trasferimento in questo tampone durante il montaggio.

Posizionare la clip di trasferimento nel piatto con la metà nera appoggiata al fondo, la metà bianca rivolta verso l'alto e la clip aperta a sinistra. Appoggiare una o due spugne di fibre sulla metà nera della clip di trasferimento. Dopo aver tagliato a misura due pezzi di carta per cromatografia di cellulosa da 0,35 millimetri, posizionarne uno sopra le spugne.

Una volta completata l'elettroforesi, rimuovere il gel dal serbatoio dell'elettroforesi. Utilizzando la leva di apertura della cassetta del gel, sollevare con cautela le piastre di gel, assicurandosi che il gel rimanga attaccato a un lato. Taglia i pozzetti dalla parte superiore del gel usando il gel releaser.

Posiziona il gel, ancora attaccato a metà della cassetta di plastica, sulla carta da filtro e rimuovi la metà rimanente della cassetta in modo che il gel rimanga piatto sulla carta. Quindi, taglia un pezzo di membrana in nitrocellulosa da 0,45 micrometri in modo che corrisponda alle dimensioni del gel. Rimuovere la membrana dalla sua carta protettiva, bagnarla brevemente nel tampone di trasferimento e posizionarla con cura sopra il gel.

Quindi, stendere un secondo pezzo di carta da filtro sopra la membrana di nitrocellulosa. Con l'aiuto di un rullo, premere delicatamente ma con decisione tutte le bolle d'aria. Impila una o due spugne di fibre aggiuntive sopra la carta da filtro per completare il panino.

Chiudere la cassetta di trasferimento e agganciarla saldamente per sigillare il sandwich assemblato. Quindi, inserire il sandwich di trasferimento chiuso nell'anima di trasferimento con la clip rivolta verso l'alto e assicurarsi che il lato nero della clip sia rivolto verso il lato nero dell'anima. Posizionare il nucleo di trasferimento nel serbatoio dell'elettroforesi.

Aggiungere un impacco di ghiaccio e una barra di agitazione al serbatoio, assicurandosi che la barra di agitazione possa ruotare liberamente. Riempire il serbatoio con un tampone di trasferimento raffreddato fino a quando l'apparecchio non è completamente immerso e fissare il coperchio sulla parte superiore. Collegare l'apparecchio all'alimentazione, abbinare i colori degli elettrodi e impostare le condizioni a 100 volt per un'ora con l'ancoretta in rotazione.

Una volta completato il trasferimento, aprire con cautela la cassetta e smontare il panino. Rimuovere la membrana di nitrocellulosa e segnare il lato che era a contatto con il gel. Quindi, posizionare la membrana di nitrocellulosa in un piccolo contenitore in modo che sia piatta contro il fondo.

Coprire completamente la membrana con la macchia Ponceau e agitare delicatamente su un dondolo per 5-10 minuti. Dopo aver versato la macchia di Ponceau, sciacquare più volte la membrana con doppia acqua deionizzata fino a rimuovere la macchia in eccesso e le bande proteiche diventano visibili nelle corsie. Quindi, eseguire il blocco della membrana, l'incubazione degli anticorpi e le fasi di lavaggio come mostrato.

Una volta completati l'incubazione e il lavaggio degli anticorpi secondari, la membrana è pronta per l'imaging. In una stanza buia, accendi lo sviluppatore di pellicole e lascialo riscaldare. Tagliate due quadrati di pellicola trasparente abbastanza grandi da coprire completamente la membrana.

Usando una pinza, posiziona la membrana di nitrocellulosa a faccia in su sul primo quadrato di pellicola trasparente. In una provetta da 1,5 millilitri, mescolare volumi uguali di luminol a chemiluminescenza potenziato e reagenti potenziatori. Quindi, utilizzare circa un millilitro di miscela per coprire la maggior parte delle membrane.

Usando l'involucro di plastica, manipolare delicatamente la membrana per assicurarsi che l'intera superficie sia rivestita uniformemente e incubare per un minuto. Quindi, rimuovere il reagente ECL in eccesso afferrando la membrana con una pinza e scrollandosi leggermente di dosso il liquido. Posiziona la membrana a faccia in su sul secondo quadrato di pellicola trasparente, piegala liberamente sulla membrana e fissa saldamente l'involucro in una cassetta per autoradiografia.

Quindi, visualizza la membrana utilizzando una pellicola per autoradiografia in una camera oscura seguendo i passaggi mostrati. Dopo aver ottenuto la visualizzazione delle proteine desiderata, allineare la pellicola sviluppata con i marcatori fosforescenti e utilizzarli come guida per contrassegnare la posizione degli standard proteici precolorati sulla pellicola. Una volta completato l'imaging, rimuovere con cautela la membrana dall'involucro di plastica e immergerla in TBSTW per lavare via il reagente ECL residuo.

La colorazione di Ponceau della membrana ha confermato il successo del trasferimento proteico. La proteina B1 endogena non è stata rilevata nei campioni di ovociti, ma è stata chiaramente rilevata nei campioni di embrioni allo stadio sette e allo stadio 10,5 a circa 107 kilodalton. Una banda proteica più piccola di 70 kilodalton è stata rilevata in campioni iniettati in tutti gli stadi utilizzando l'anticorpo Bicc1, indicando un'espressione riuscita della fusione C-terminale HA-Bicc1.

L'anticorpo HA ha rilevato la stessa banda di 70 kilodalton solo in campioni iniettati, confermando la specificità dell'anticorpo Bicc1 per la proteina di fusione. Due bande ad alto peso molecolare, circa 250 e 270 kilodalton, sono state rilevate in tutti i campioni utilizzando l'anticorpo CNOT1. L'espressione della proteina DDX6 da 54 kilodalton è stata rilevata in tutti i campioni, ma è stata visibilmente ridotta negli embrioni allo stadio 10,5.