Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell'uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting
April 10th, 2014
Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di estrarre proteine dal tessuto cerebrale umano e di topo per l'analisi proteomica. Ciò si ottiene utilizzando un tampone di lisi comune per ottenere la stessa estrazione proteica adattata per approcci di elettroforesi bidimensionale. Successivamente, l'elettroforesi su gel con differenza di fluorescenza bidimensionale viene utilizzata per separare le proteine per l'identificazione della spettrometria di massa.
Segue un'elettroforesi su gel 2D in miniatura con immunoblotting per identificare le modifiche post-traduzionali. I risultati possono mostrare l'espressione proteica globale. Modifiche traduzionali dell'ospite a tutti i prodotti legamentosi e catalitici in base alle differenze nel punto isoelettrico e nel peso molecolare.
La combinazione di trattino 2D e monolo 2D può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo della neuroproteomica fornendo contemporaneamente informazioni sui cambiamenti di espressione. Modificazione postale e catabolismo nei prodotti Iniziare con la raccolta e l'omogeneizzazione del tessuto cerebrale. Preparare il tessuto al 10% del peso in volume nel tampone di estrazione per il tessuto cerebrale umano.
Omogeneizzare il tessuto usando un pipettatore di vetro, tuttavia, utilizzare un omogeneizzatore in teflon per il tessuto dei roditori per disintegrare entrambi gli omogeneizzati. Sonicalo a 60 hertz utilizzando 30 impulsi di mezzo secondo. Successivamente, determinare la concentrazione proteica con un test Bradford utilizzando BSA come standard.
Raccogli ora le soluzioni per la precipitazione del metanolo al cloroformio in un secchiello per il ghiaccio. Pianifica di raccogliere circa 125 microgrammi per strisce IPG da 11 centimetri o circa 1,25 milligrammi per strisce IPG da 18 centimetri. Una volta che le soluzioni sono a quattro gradi Celsius, eseguire la precipitazione completamente su ghiaccio.
Per prima cosa, aggiungi tre volumi di metanolo, poi uno di cloroformio. Agitare questa miscela. Quindi, aggiungi tre volumi di acqua fredda.
Vortex, questa miscela per un minuto centrifuga la provetta del campione a 12.000 Gs per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare il surnatante. Quindi aggiungi tre volumi di vortice di metanolo e fai girare le proteine allo stesso modo.
Asciugare il pellet proteico raccolto sotto azoto gassoso prima del 2D DIGE. Risospendere la proteina in tampone 2D a 2,5 milligrammi per millilitro. Quindi sonicare i campioni come fatto in precedenza fino a quando non vengono utilizzati.
Conservali a meno 80 gradi Celsius prima di iniziare questo passaggio e dopo la precipitazione delle proteine. È necessario determinare ancora una volta la concentrazione proteica mediante il saggio di Bradford. Seguendo la stessa procedura mostrata in precedenza prima dell'etichettatura del colorante psy.
A tale scopo, la qualità del campione proteico è verificata dalla pagina SDS. Diluire 15 microgrammi di proteine in LDS e portarlo a 37 gradi Celsius in un bagno di calore o in un blocco. Quindi passarli su un gel di poliacrilammide, colorare il gel con una soluzione di blu di kumasi per almeno un'ora.
Quindi trattenere il gel per una notte in una soluzione di acido acetico al 7% e etanolo al 10%. Una volta stabilita la qualità del campione proteico, il giorno successivo viene avviata la procedura di marcatura SD. Per prima cosa misura il pH del lisato, che dovrebbe essere da basico a neutro.
Il pH ottimale è 8,6 per le reazioni successive. Successivamente, impostare le reazioni di coniugazione del colorante per ciascun campione proteico. Mescolare 50 microgrammi con 400 picomoli di colorante S3 e 50 microgrammi con 400 picomoli di colorante S five.
Eseguire questa operazione in quadruplex per un totale di otto reazioni di accoppiamento D per campione. Per ogni campione testato, effettuare una serie complementare di reazioni di accoppiamento DI utilizzando la proteina del controllo, ad esempio da un cervello malato. Quindi, per ogni coppia di reazioni, impostare una reazione di controllo interno con 400 picomoli di CY due e una rappresentazione uniforme di tutte le proteine per un totale di 250 microgrammi.
La marcatura SAI si ottiene incubando tutte le miscele di reazione a quattro gradi Celsius al buio per un'ora. Dopo l'incubazione, combinare tutte le serie di tre diverse reazioni ciano in volumi di 150 microlitri per ciascuna serie di reazioni a 200 microlitri di tampone 2D. Quindi procedi con i passaggi dell'elettroforesi 2D.
Iniziare con la preparazione di soluzioni proteiche non marcate per il gel preparativo da cui verranno asportate le macchie proteiche per ogni campione e per il controllo positivo. Aliquotare da 300 a 350 microgrammi di proteine non marcate in tampone 2D e lasciarle reidratare a contatto con la striscia IPG. Successivamente, le strisce IPG trasferiscono la proteina marcata e quella non marcata a una reidratazione.
Bene, quindi copri ogni pozzetto con una striscia di reazione IPG. Seguire questo con una sovrapposizione di olio minerale e lasciare che le strisce si reidratino passivamente e passivamente con la soluzione proteica durante la notte a non più di 25 gradi Celsius. Il giorno successivo, eseguire la messa a fuoco isoelettrica delle strisce IPG.
Quindi rimuovere l'olio e conservare le strisce IPG a meno 20 gradi Celsius per equilibrare le strisce IPG. Immergerli nel tampone di equilibratura per 15 minuti. Quindi trasferire le strisce in acetammide IDO al 4,7% in tampone di equilibrio, privo di DTT durante il bagno delle strisce.
Utilizza un ampio sistema di gel 2D per versare quattro gel di pagina 12% SDS per campione in lastre di vetro a bassa fluorescenza per le proteine marcate. Versare anche un gel per pagine SDS al 12% in lastre di vetro standard spesse 1,5 millimetri per ciascuna delle proteine non marcate. Questi sono i gel preparativi.
Quando i gel si sono raffreddati, trasferisci le strisce sulla parte superiore dei gel e sovrapponi le strisce con lo 0,5% di Aros una volta raffreddate, fai funzionare i gel a 2,5 watt a quattro gradi Celsius durante la notte e analizzali il giorno successivo. Molte reazioni 2D possono essere effettuate con campioni proteici utilizzati per i gel preparativi. Misurare meno di 100 microgrammi di campione in 200 microlitri di tampone 2D.
Quindi agitare energicamente le miscele di campioni e farle girare rapidamente. Caricare i campioni su strisce IPG da 11 centimetri e lasciarli reidratare passivamente durante la notte ricoperti di olio minerale il giorno successivo. Eseguire la messa a fuoco isoelettrica.
Quindi spostare le strisce attraverso tre bagni di tampone di equilibratura per 15 minuti per bagno. Le strisce vengono quindi eseguite su gel per pagine SDS 2D. Sovrapporre ogni striscia su un gel prefabbricato del peso molecolare appropriato.
Poliacrilammide per la proteina di interesse. Successivamente, trasferire i gel sulla membrana PVDF NITROCELLULOSA e analizzarli con gli anticorpi nello sviluppo di questo protocollo. Tre diverse lisi.
I tamponi sono stati testati. In primo luogo, un tampone biochimico e molecolare comune. Tris SDS è stato testato.
Tris SDS aveva una risoluzione scarsa rispetto a un altro UTS buffer testato. Il terzo tampone per de è stato escluso in quanto non è stato possibile preparare campioni testabili. Successivamente, sono stati studiati i proteomi cerebrali umani e di topo.
Sono stati confrontati campioni di corteccia di controllo umano e campioni di corteccia pubblicitaria. Dal campione umano sono state osservate anche proteine cerebrali di topo di topi con patologia tau simile all'AD. SCI due è stato esaminato in modo indipendente, così come S, SI tre e sci cinque per ogni D.L'alta risoluzione del punto ha reso facile l'allineamento.
L'analisi mini 2D qualitativa è stata utilizzata per studiare le modificazioni post-traduzionali e una ligamentizzazione alfa sinucleina nel tessuto AD è risultata avere un profilo normale, ma è stata anche trovata come un dimero contrassegnato da un asterisco. Le frecce segnavano il punto in cui è stata trovata l'alfa sinucleina. Anche la proteina precursore dell'amiloide ubiquitinata è stata osservata mediante mini 2D.
L'annuncio sporadico è stato confrontato con l'annuncio familiare. Nella famiglia ad beta, l'amiloide da uno a 42 e la varianza ISO sono più basse in concentrazione perché le forme di liga sono state trovate a otto kilodalton. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare il proteoma per confrontare campioni complessi misurando le modifiche dell'espressione proteica.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'estrazione di proteine dal tessuto cerebrale umano e di topo utilizzando un comune buffer di lisi per l'analisi proteomica. Il metodo consente l'identificazione e la caratterizzazione delle proteine attraverso tecniche avanzate di elettroforesi.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Proteomica
- Neuroscienza
- Biochimica
Contesto
- L'estrazione delle proteine è cruciale per comprendere la funzione cerebrale.
- Le tecniche di elettroforesi bidimensionale migliorano la separazione delle proteine.
- Le modifiche post-traduzionali possono influenzare significativamente la funzione delle proteine.
- Sono necessari metodi affidabili per ottenere risultati riproducibili in biopsie e modelli.
Obiettivo dello studio
- Esttrarre proteine dai tessuti cerebrali per l'analisi.
- Utilizzare l'elettroforesi bidimensionale a differenza di fluorescenza in gel.
- Identificare le modifiche post-traduzionali attraverso l'immunoblotting.
Metodi utilizzati
- Estrazione delle proteine utilizzando un buffer urea/tiourea/SDS.
- Elettroforesi bidimensionale a differenza di fluorescenza in gel (2D-DIGE).
- Mini elettroforesi bidimensionale in gel per immunoblotting.
- Spettrometria di massa per l'identificazione delle proteine.
Risultati principali
- Estrazione riuscita di proteine dai tessuti cerebrali umani e di topo.
- Identificazione delle proteine utilizzando la spettrometria di massa.
- Caratterizzazione delle modifiche post-traduzionali.
- Migliore riproducibilità dei risultati da biopsie e modelli.
Conclusioni
- Il metodo fornisce risultati affidabili per l'analisi proteomica.
- Facilita lo studio dell'espressione e delle modifiche delle proteine.
- Questo approccio può essere applicato a vari studi neurologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
