Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell'uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting
10 aprile 2014
Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è estrarre le proteine da tessuto cerebrale umano e murino per l'analisi proteomica. Questo viene ottenuto utilizzando un comune buffer di lisi per ottenere un'estrazione proteica uniforme, adattata ad approcci di elettroforesi bidimensionale. Successivamente, l'elettroforesi bidimensionale con differenza di fluorescenza (2D-DIGE) viene utilizzata per separare le proteine in vista dell'identificazione mediante spettrometria di massa.
Successivamente viene eseguita un'elettroforesi bidimensionale in miniatura con immunoblotting per identificare le modifiche post-traduzionali. I risultati possono mostrare l'espressione proteica globale. Le variazioni traduzionali dell'ospite e tutti i prodotti legamentosi e catalitici si basano sulle differenze nel punto isoelettrico e nel peso molecolare.
La combinazione di 2D dash e 2D monolo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroproteomica fornendo contemporaneamente informazioni sulle variazioni di espressione. Modificazione post-traduzionale e catabolismo nei prodotti iniziano con il prelievo e l'omogeneizzazione del tessuto cerebrale. Preparare il tessuto al 10% in peso/volume in tampone di estrazione per tessuto cerebrale umano.
Omogeneizzare il tessuto utilizzando una pipetta in vetro, tuttavia utilizzare un omogeneizzatore in teflon per il tessuto di roditore al fine di disintegrare l'omogenato. Sottoporre a sonica a 60 hertz utilizzando 30 impulsi di mezzo secondo ciascuno. Successivamente, determinare la concentrazione proteica mediante saggio di Bradford utilizzando BSA come standard.
Ora raccogliere le soluzioni per la precipitazione con cloroformio-metanolo in un secchiello di ghiaccio. Prevedere di raccogliere circa 125 microgrammi per strisce IPG da 11 centimetri o circa 1,25 milligrammi per strisce IPG da 18 centimetri. Una volta che le soluzioni hanno raggiunto i quattro gradi Celsius, eseguire la precipitazione completamente sul ghiaccio.
Aggiungere prima tre volumi di metanolo, quindi uno di cloroformio. Agitare questa miscela. Successivamente, aggiungere tre volumi di acqua fredda.
Vortexare la miscela per un minuto, quindi centrifugare il tubo campione a 12.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare il soprannatante. Successivamente, aggiungere tre volumi di metanolo, vortexare e centrifugare le proteine nello stesso modo.
Asciugare il pellet proteico raccolto sotto flusso di gas azoto prima dell'elettroforesi 2D DIGE. Ri-sospendere la proteina nel buffer 2D a 2,5 milligrammi per millilitro. Successivamente, sottoporre i campioni a sonicazione come fatto in precedenza, fino al momento dell'utilizzo.
Conservarli a meno 80 gradi Celsius prima di iniziare questo passaggio e dopo la precipitazione delle proteine. È necessario determinare nuovamente la concentrazione proteica mediante saggio di Bradford. Seguire lo stesso procedimento mostrato in precedenza prima della marcatura con il colorante psy.
La qualità del campione proteico viene verificata mediante elettroforesi SDS-PAGE a tale scopo. Diluire 15 microgrammi di proteina in LDS e riscaldare a 37 gradi Celsius in un bagno termico o blocco riscaldante. Successivamente, eseguire l'elettroforesi su un gel di poliacrilamide e colorare il gel con soluzione di blu di Coomassie per almeno un'ora.
Quindi lasciare il gel in una soluzione di acido acetico al 7% e alcol etilico al 10% per tutta la notte. Una volta stabilita la qualità del campione proteico, il giorno successivo si inizia la procedura di marcatura con SD. Misurare innanzitutto il pH del lisato, che dovrebbe essere basico o neutro.
Il pH ottimale è 8,6 per le reazioni successive. Preparare quindi le reazioni di coniugazione con il colorante per ogni campione proteico. Mescolare 50 microgrammi con 400 picomoli di colorante S3 e 50 microgrammi con 400 picomoli di colorante S five.
Eseguire questa procedura in quadruplo, per un totale di otto reazioni di accoppiamento D per campione. Per ciascun campione testato, preparare un insieme complementare di reazioni di accoppiamento DI utilizzando proteine provenienti da un controllo, ad esempio da un cervello malato. Successivamente, per ogni coppia di reazioni, impostare una reazione di controllo interno con 400 picomoli di CY due e una rappresentazione equilibrata di tutte le proteine per un totale di 250 microgrammi.
L'etichettatura SAI si ottiene incubando tutte le miscele di reazione a quattro gradi Celsius al buio per un'ora. Dopo l'incubazione, combinare tutti i gruppi di tre reazioni ciano diverse in volumi di 150 microlitri, aggiungendo a ciascun gruppo di reazioni 200 microlitri di tampone 2D. Procedere quindi con i passaggi dell'elettroforesi bidimensionale.
Iniziare preparando soluzioni di proteine non marcate per il gel preparativo da cui verranno escisse le macchie proteiche per ogni campione e per il controllo positivo. Aliquotare da 300 a 350 microgrammi di proteina non marcata nel buffer 2D e lasciarle idratare a contatto con la striscia IPG. Successivamente, caricare le strisce IPG e trasferire le proteine marcate e quelle non marcate in un'idratazione.
Coprire quindi ogni pozzetto con una striscia reattiva IPG. Aggiungere un sovrastrato di olio minerale e lasciare che le strisce si riidratino passivamente con la soluzione proteica durante la notte a non più di 25 gradi Celsius. Il giorno successivo, eseguire la focalizzazione isoelettrica delle strisce IPG.
Quindi rimuovere l'olio e conservare le strisce IPG a meno 20 gradi Celsius per equilibrarle. Immergerle nel buffer di equilibrazione per 15 minuti. Successivamente trasferire le strisce in acetammide al 4,7% IDO nel buffer di equilibrazione, privo di DTT, mentre si immergono le strisce.
Utilizzare un sistema elettroforetico 2D di grandi dimensioni per preparare quattro gel SDS-PAGE al 12% per campione su lastre di vetro a bassa fluorescenza per le proteine marcate. Preparare inoltre un gel SDS-PAGE al 12% su lastre di vetro standard spesse 1,5 millimetri per ciascuna delle proteine non marcate. Questi sono i gel preparativi.
Una volta raffreddati i gel, trasferire le strisce sulla parte superiore dei gel e ricoprirle con Aros 0,5% dopo il raffreddamento; quindi far correre i gel a 2,5 watt a quattro gradi Celsius per tutta la notte e analizzarli il giorno successivo. Molte reazioni 2D possono essere eseguite con campioni proteici utilizzati per i gel preparativi. Misurare meno di 100 microgrammi di campione in 200 microlitri di buffer 2D.
Quindi vortexare vigorosamente le miscele campione e sottoporle a una breve centrifugazione. Caricare i campioni su strip IPG di 11 centimetri e lasciarle idratare passivamente tutta la notte, coperte con olio minerale, il giorno successivo. Eseguire la focalizzazione isoelettrica.
Quindi spostare le strisce attraverso tre bagni di tampone di equilibrazione per 15 minuti per ogni bagno. Le strisce vengono quindi elettroforese su gel SDS-PAGE 2D. Posizionare ogni striscia su un gel prefabbricato del peso molecolare appropriato.
Poliacrilamide per la proteina di interesse. Successivamente, trasferire i gel su membrana in nitrocellulosa PVDF e analizzarli con anticorpi nello sviluppo di questo protocollo. Tre diversi lisati.
Sono stati testati dei tamponi. In primo luogo, è stato testato un comune tampone utilizzato in biochimica e biologia molecolare: Tris SDS.
Il Tris SDS ha mostrato una risoluzione scarsa rispetto a un altro tampone testato, l'UTS. Il terzo tampone è stato escluso poiché non è stato possibile preparare campioni testabili con esso. Successivamente, sono stati analizzati i proteomi del cervello umano e murino.
Sono stati confrontati campioni umani di controllo della corteccia e campioni della corteccia AD. Le proteine cerebrali di topi con patologia tau simile all'AD sono state analizzate anche a partire dal campione umano. SCI due è stato esaminato in modo indipendente, così come S SI tre e sci cinque per ciascun D. L'elevata risoluzione del punto ha facilitato l'allineamento.
È stata utilizzata un'analisi qualitativa mini 2D per indagare le modifiche post-traduzionali e si è riscontrato che l'alfa-sinucleina nella legamentizzazione nel tessuto ad era presente con un profilo normale, ma è stata trovata anche come dimero indicato da un asterisco. Le frecce indicano i punti in cui è stata rilevata l'alfa-sinucleina. La proteina precursore dell'amiloide ubiquitinata è stata inoltre osservata mediante mini 2D.
L'AD sporadica è stata confrontata con l'AD familiare. Nell'AD familiare, l'amiloide beta da 1 a 42 e la varianza ISO sono presenti a concentrazioni inferiori poiché sono state riscontrate forme di ligatura a otto chilodalton. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare il proteoma al fine di confrontare campioni complessi misurando le modifiche nell'espressione proteica.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'estrazione di proteine da tessuto cerebrale umano e murino utilizzando un comune tampone di lisi per l'analisi proteomica. Il metodo consente l'identificazione e la caratterizzazione delle proteine mediante tecniche avanzate di elettroforesi.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Proteomica
- Neuroscienze
- Chimica biologica
Sfondo
- L'estrazione delle proteine è fondamentale per comprendere il funzionamento del cervello.
- Le tecniche di elettroforesi bidimensionale migliorano la separazione delle proteine.
- Le modifiche post-traduzionali possono influenzare significativamente la funzione proteica.
- Sono necessari metodi affidabili per ottenere risultati riproducibili in biopsie e modelli.
Scopo dello studio
- Estrarre le proteine dai tessuti cerebrali per l'analisi.
- Utilizzare l'elettroforesi bidimensionale con gel a fluorescenza differenziale.
- Identificare le modifiche post-traduzionali mediante immunoblotting.
Metodi Utilizzati
- Estrazione delle proteine utilizzando un tampone di urea/tiourea/SDS.
- Elettroforesi bidimensionale con differenza di fluorescenza (2D-DIGE).
- Elettroforesi su gel bidimensionale in mini-formato per immunoblotting.
- Spettrometria di massa per l'identificazione delle proteine.
Risultati principali
- Estrazione riuscita di proteine da tessuti cerebrali umani e murini.
- Identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa.
- Caratterizzazione delle modifiche post-traduzionali.
- Migliorata riproducibilità dei risultati ottenuti da biopsie e modelli.
Conclusioni
- Il metodo fornisce risultati affidabili per l'analisi proteomica.
- Facilita lo studio dell'espressione e delle modifiche delle proteine.
- Questo approccio può essere applicato a vari studi neurologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente un'estrazione standardizzata di proteine da quantità limitate di tessuto cerebrale umano post-mortem e murino, supportando un profilo proteomico riproducibile nei modelli di malattie neurodegenerative. Integrando la 2D-DIGE per l'analisi quantitativa dell'espressione e il dot blot immunochemico mini 2DE per la validazione delle modifiche post-traduzionali, il metodo aumenta la sicurezza nella validazione degli obiettivi e riduce i rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta. L'approccio facilita il confronto interspecie e la scoperta di biomarcatori rilevanti per le vie della malattia di Alzheimer e della demenza a corpi di Lewy.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il profilo globale dell'espressione proteica in tessuti cerebrali rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli rilevando modifiche post-traduzionali come l'ubiquitinazione e la dimerizzazione di proteine associate alla malattia, come l'alpha-sinucleina e la proteina precursore dell'amiloide.
- Valore predittivo: Migliora la selezione del portafoglio fornendo un confronto qualitativo delle modifiche proteiche tra diverse condizioni, facilitando la priorizzazione dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, producendo estratti proteici compatibili con piattaforme di elettroforesi differenziale in gel bidimensionale (2D-DIGE) e immunoblotting.
- Riproducibilità: Garantisce la standardizzazione del saggio mediante un buffer di lisi standardizzato e una precipitazione con cloroformio-metanolo, migliorando la coerenza tra campioni umani e murini.
- Output quantitativo: Permette una valutazione affidabile di composti attraverso l'elettroforesi differenziale in gel con marcatura fluorescente, supportando lo screening dell'espressione differenziale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Favorisce lo studio dei percorsi molecolari nelle malattie neurodegenerative consentendo l'analisi di aggregati proteici come l'amiloide-beta e l'alfa-sinucleina.
- Continuità traslazionale: Garantisce un percorso continuo dalla scoperta alla validazione preclinica permettendo il confronto parallelo dei proteomi cerebrali umani e murini.
- Progressione basata sul rischio: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo identificando modifiche proteiche associate alla malattia e variazioni nell'espressione in modelli di patologia tau.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test delle ipotesi all'identificazione di un composto promettente, in particolare nei programmi sulle malattie neurodegenerative che richiedono un'analisi meccanicistica e la riduzione del rischio associato al bersaglio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi analizzando le variazioni nell'espressione proteica e le modifiche post-traduzionali mediante separazione in base al punto isoelettrico e al peso molecolare.
- Screening: Fornisce prontezza per saggi e risultati quantitativi attraverso la 2D-DIGE, consentendo il confronto dell'espressione proteica tra campioni complessi.
- Analisi: Produce letture misurabili, tra cui intensità dei spot, spostamenti nella migrazione e modelli di modificazione, che aiutano i gruppi di lavoro a confrontare condizioni diverse e a individuare i bersagli prioritari.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo l'analisi di tessuto cerebrale umano e murino in condizioni comparabili, favorendo l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità proteomica riutilizzabile piuttosto che come tecnica monouso, applicabile a più bersagli e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso l'osservazione diretta delle modifiche proteiche e dei cambiamenti nell'espressione.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità grazie a protocolli standardizzati di lisi e precipitazione delle proteine, minimizzando la variabilità tra laboratori.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli obiettivi grazie a informazioni meccanicistiche, riducendo il rischio di fallimento nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio fornendo dati su biomarcatori proteici e stati di modificazione rilevanti per la progressione della malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in proteomica, biochimica delle proteine e tecniche elettroforetiche, inclusi 2D-DIGE e immunoblotting.
- È dipendente da strumentazioni come sistemi elettroforetici, sonicatori, centrifughe e piattaforme compatibili con la spettrometria di massa.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la gestione dei campioni, la quantificazione delle proteine e le procedure di etichettatura, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento nell’applicare il protocollo a diverse regioni cerebrali, modelli di malattia o quantità di campione.
- Include limitazioni pratiche, come la necessità di un’attenta manipolazione dei campioni per prevenire il degrado e la dipendenza da un rendimento proteico sufficiente ottenuto da quantità limitate di tessuto.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Extracting Total Protein
3:07
Quality Control and Dye Conjugation
5:28
Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2D-DIGE)
7:36
Mini-2DE for Quantitative Analysis
8:53
Proteomics of Human and Mouse Tissue with Alzheimer Disease
10:26
Conclusion
