Name: Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti delluomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Impara a estrarre proteine da tessuti cerebrali umani e murini per analisi proteomica. Questo metodo utilizza 2D-DIGE e mini 2DE con immunoblotting per identificare modificazioni post-traduzionali e caratterizzare il proteoma cerebrale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Inserm, dell&#39;Università di Lille 2, MEDIALZ, LABEX (laboratorio di eccellenza, programma di investire per il futuro) e DISTALZ (sviluppo di strategie innovative per un approccio transdisciplinare alla malattia di Alzheimer). FJ.FG è attualmente una borsa destinatario di ANR (francese Agenzia Nazionale di Ricerca / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), ma questo lavoro è stato anche sotto il supporto di una sovvenzione da parte del JCCM (Spagna).

1. Omogeneizzazione e Total estrazione di proteine ​​da umano e mouse tessuto cerebrale <ol><li> Cervello omogeneizzazione del tessuto. Omogeneizzare il tessuto cerebrale 10% (w / v) in 8 M urea, 2 M tiourea e 1% w / v tampone SDS (UTS) utilizzando una lente potter (per campioni umani) o Teflon omogeneizzatore (per topi campioni). Ultrasuoni a 60 Hz 30 impulsi con un generatore di ultrasuoni applicazione 0.5 sec per la disintegrazione del tessuto totale 13, 14. <ol><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​con saggio Bradford, utilizzando BSA come standard. Questo UTS estrazione buffer è completamente compatibile con una dimensione SDS-PAGE purché non lisati sono sovra-riscaldato per evitare carbamilazione 15. </li><li> Aggiungere 1% (w / v) di Amberlite e incubare con miscelazione delicata per 10 min a temperatura ambiente. Successivamente filtrare su 0.22 micron filtri per siringa e infine aggiungere la SDS per la soluzione di urea / tiourea. Questo passaggio riduce la quantità di acido urico e acido isocianico, che sono in equilibrIUM con urea in soluzione e facilitare la sua degradazione. </li></ol></li><li> Cloroformio / metanolo precipitazione delle proteine. Precipitare tra 100-150 mg di proteine ​​per 11 centimetri strisce IPG e 1-1,5 mg per 18 centimetri quelli (indipendentemente sulla gamma pH selezionato per eseguire l&#39;IEF). <ol><li> Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio oppure a 4 ° C. Fresco cloroformio e metanolo a 4 ° C per 30 min prima di iniziare la procedura di precipitazione. </li><li> Aggiungere tre volumi di metanolo e un volume di cloroformio per un volume di UTS lisato. Agitare manualmente la miscela e aggiungere tre volumi di acqua fredda. Vortex per 1 min e agglomerare le proteine ​​mediante centrifugazione a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur e aggiungere tre volumi di freddo MeOH. Nuovamente Vortex e centrifugare a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C. Infine, scartare il surnatante e asciugare il pellet sotto N 2. </li></ol></li><li> Preparazione di proteine ​​per analisi 2D.Risospendere il pellet di proteine-essiccati in 2D-buffer (8 M urea, 2 M tiourea integrato con 4% CHAPS). Lavare la soluzione con Amberlite come indicato sopra e cercare di mantenere la proporzione di 500 mcg di proteine ​​per 200 ml di tampone per 2D 2D-DIGE. Nota: tampone 2D può essere conservato a -80 ° C o mantenuta a 4 ° C per una settimana (per evitare degradazione dell&#39;urea). <ol><li> Sonicare e conservare i campioni a -80 ° C fino effettuare il passaggio seguente. Degno di nota, questo protocollo può essere usato dopo solubilizzazione di acido formico di proteine ​​aggregati 10. In breve, far evaporare l&#39;acido formico sotto N 2 e risospendere il pellet come descritto. </li></ol></li></ol> 2. 2D-DIGE <ol><li> Campioni di prova di qualità. Campioni di dose ancora utilizzando il metodo di Bradford. Diluire 15 pg di proteine ​​in tampone campione LDS, riscaldare a 37 ° C e 15 caricare sul 4-12% gel di poliacrilammide. </li><li> Colorazione con Coomassie. Macchiare gel di poliacrilammide con 0.1% (w / v) CoomassieBlu G-250, 50% EtOH e 10% (v / v) di acido acetico per almeno 1 ora. Sia sfondo Destain notte in 7% di acido acetico e 10% (v / v) di etanolo. </li><li> Etichettatura pre-elettroforetica dei campioni. Prima di eseguire l&#39;etichettatura colorante cianina, verificare il pH del campione, che dovrebbe essere di base o anche neutro poiché la sostituzione N-idrossisuccinimmide è più efficiente a pH basico e somministrato essere ottimale a pH 8,6. <ol><li> Etichettare minimamente i due campioni di studio con coloranti fluorescenti Cy3 o Cy5 con un rapporto di 50 ug protein/400 pmol colorante e mantenere per 1 ora a 4 ° C al buio per facilitare il gruppo estere attivo NHS delle cianine con l&#39;ammina senza protoni gruppi di lisine. </li><li> Ridurre le variazioni di esempio facendo un cross-etichettatura con Cy3 e Cy5 coloranti, evitando un accoppiamento preferenziale di un campione a un particolare cianina. Si noti che il cianina-colorante marcatura minima può essere adattato per piccole quantità di proteine ​​con mantenere la proporzione di 1 ug protein per 8 pmol Cyanine-dye. Se è così, il sistema mini-2DE può essere usata al posto della grande sistema gel 2D. Ciò consentirà l&#39;analisi 2D-DIGE per una piccola quantità di tessuto cerebrale. </li><li> Etichettare un pool di entrambi i campioni con la stessa quantità di proteina (50 mg in totale) con colorante fluorescente Cy2 e usato come standard interno. Utilizzare le stesse condizioni come precedentemente indicato. </li><li> Completa in un volume totale di 350 microlitri di tampone 2D contenente 1,1% di reagente Destreak, 1,2% di tampone IPG e tracce di blu di bromofenolo totale 150 mcg di proteine ​​marcate (50 mg di Cy2, 50 mg di Cy3 e 50 ug di Cy2). Eseguire questo passaggio in quadruplice copia utilizzando quattro strisce indipendenti. Inoltre, preparare due ulteriori strisce non etichettati (uno per ogni campione) con 350-450 mg di proteine ​​per i gel preparative. </li><li> Lasciare le sei strisce cariche ricoperte di pernottamento oli minerali per la reidratazione passiva. </li></ol></li><li> Isoelettrofocalizzazione. Effettuare la IEF a 206; C. Per un pH 3-11NL, 18 centimetri striscia il protocollo è: l&#39;impostazione corrente massima è di 50 ìA / strip durante le 8 tappe: 1) 150 V step per 1 ora, 2) 200 V fase per 5 ore, 3) 500 V con pendenza 2 ore, 4) gradiente di 1,000 V per 2 ore, 5) 2,000 V pendenza per 2 ore, 6) 4,000 V pendenza per 2 ore, 7) 8,000 V pendenza per 2 ore e 8) per un totale di 24.000 V · h passo . Dopo IEF, inviare l&#39;eccesso di olio minerale con carta cromatografica e memorizzare le strisce a -20 ° C fino alla seconda dimensione. </li><li> IPG Strips equilibratura. Equilibrare strisce in 6 M urea, 2% SDS, 30% glicerolo, 50 mM Tris-HCl pH 8,6 tampone con 1% di DTT durante e dopo 15 min con 4,7% di iodoacetamide nello stesso tampone ma senza DTT. </li><li> Seconda dimensione o SDS-PAGE elettroforesi. Effettuare le sei 12% gel SDS-PAGE (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% di acrilammide / bisacrylamide, 0.1% (w / v) di SDS, 0,072% (w / v) APS e 0,1% (v / v) TEMED ) Allo stesso tempo utilizzando un grande sistema 2D, con quattro lastre di vetro a bassa fluorescenza per la strips con campioni di fluorescenza e altri due lastre di vetro con 1,5 mm di spessore per i gel preparative, al fine di asportare le macchie proteiche. <ol><li> Caricare i sei IPG strisce sulla cima dei gel e più strati con 0,5% (w / v) di agarosio. Tampone di corsa è composta da 25 mM Tris, glicina 192 mM e 0,1% (w / v) di SDS. Eseguire la migrazione a 2,5 W / gel durante la notte con un sistema di refrigerazione impostato a 4 ° C 16,17. </li></ol></li><li> Immagini di fluorescenza acquisizione e l&#39;analisi. Utilizzare uno scanner Typhoon 9400 per ottenere le immagini gel di fluorescenza (12 immagini per un esperimento). Scan Cy2, Cy3 e Cy5 immagini per ogni gel a 488/520 nm, 532/580 nm e 630/670 nm di eccitazione / lunghezze d&#39;onda, rispettivamente. Utilizzare il software informatico per analizzare le immagini. I dati sono rappresentativi delle variazioni di volume posto associati alla distribuzione del segnale di tutti i quattro gel tra i due campioni studiati. </li><li> Coomassie colorazione per i grandi gel. Fissare il gel di preparazione in 50% (v / v) EtOH e 3% (v / v) di acido ortofosforico per almeno 24 ore. Poi, dopo, lavare due volte con acqua ultra pura per 20 min. Eseguire colorazione in 34% (v / v) metanolo, 17% (w / v) di solfato di ammonio e acido ortofosforico 2% per 1 ora prima di aggiungere 0,1% (w / v) Coomassie Blu G-250. Tenere i gel nella colorazione per almeno 48 ore e decolorati in acqua ultra pura. <ol><li> Spot per l&#39;identificazione MS. Una volta che le immagini di fluorescenza vengono analizzate, il software fornisce un elenco di punti la cui espressione è statisticamente diverso. Asportare manualmente queste macchie dai gel di preparazione. Questa procedura richiede pratica e una certa destrezza manuale per evitare contaminazione cheratina. Poi i campioni possono essere mantenuti in acqua a -20 ° C fino invio di MS. Identificazione Spot è perfettamente compatibile con spettrometria di massa tandem (MS / MS) e la rilevanza delle identità di proteine ​​è giudicata in base al punteggio Mowse basato calcolato con un p-value di 0,05 (p &lt;0,05) 18 probabilità. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Qualitativa Mini-2DE Assay <ol><li> Risospendere massimo 100 pg di proteina in tampone campione 2D fino a un volume finale di 200 microlitri di una striscia IPG 11 cm. Nel caso di sistema sovraespressione o proteina purificata, l&#39;importo di partenza può essere abbassata a 20 mg. </li><li> Aggiungere 1,1% (v / v) Destreak reagente, 0,55% (v / v) di tampone di IPG e tracce di blu di bromofenolo in un volume finale di 200 microlitri. Poi, vortice, fare un giro veloce e caricare in una striscia IPG per la reidratazione passiva (per portare il nastro al suo spessore originale) durante la notte coperto con olio minerale. Nota: la percentuale di buffer di IPG è la stessa per tutti l&#39;intervallo di pH desiderato (pH 3-11, 4-7, 7-11, ecc), ma la sua composizione varia in funzione del campo di pH selezionato. </li><li> Isoelectrofocalisation. Eseguire IEF a 20 ° C. La durata del programma dipende dall&#39;intervallo di pH selezionato. Degno di nota, parametri come elettroendosmosi possono disturbare il profilo IEF e in questi casi,ottimizzazione in tempo electrofocalisation è necessaria 19. Nota: non è necessariamente un IEF più che fornisce risultati migliori ma accorciare il tempo di IEF può anche migliorare la risoluzione. Dopo IEF, strisce IPG possono essere conservati a -20 ° C per mesi. </li><li> IPG strisce di equilibrio. Equilibrare le strisce in un tampone contenente 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% glicerolo, 5% SDS, 0,05% blu di bromofenolo. Fai tre equilibratura bagna per 15 minuti con il cambiamento la soluzione tampone tra ogni bagno. </li><li> SDS-PAGE. Strato strip IPG su gel prefabbricato (IPG +1 ben 11 centimetri striscia IPG) con una percentuale di poliacrilammide scelto a seconda del MW della proteina di interesse. Poi, asciugare il gel su una membrana di nitrocellulosa / PVDF a 100 mV durante 33 min. </li><li> Incubare per una notte con l&#39;anticorpo richiesta e visualizzare per attività perossidasi. Eseguire gli allineamenti di immunoblots usando polipeptidi indipendenti rivelate dal anticorpo secondario. Raggiungere un semi-quantitative analisi densitometria del volume e l&#39;intensità delle tracce / spot con il software ImageJ. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Scoprire cambiamenti di espressione di proteine ​​patologiche, la ricerca dei biomarcatori e la modulazione dei potenziali percorsi di bersagli farmacologici sono tra gli obiettivi delle neuroproteomics avvicina 30. Tra gli strumenti emergenti, il campo 2DE aggiunge un expectative promettente. Tuttavia, un consenso dovrebbe essere raggiunto per minimizzare la variabilità e aumentare la riproducibilità negli esperimenti. In linea di questa idea un protocollo standardizzato effettuare 2D-DIGE (Figura 2)...

Disturbi mentali e neurologici rappresentano il 13% del carico globale di malattia, nuove sfide come meccanismi fisiopatologici, fattori di rischio e biomarcatori prodromici devono essere esplorate 1. In linea con questo obiettivo, proteomica studi del cervello umano diventano indispensabili per scoprire i meccanismi molecolari coinvolti nei processi come la memoria, il comportamento, le emozioni e la plasticità neuronale per esempio, non solo per motivi fisiologici, ma anche per le condizioni patologiche. Pertanto, l&#39;uso di modelli animali e più specificamente i topi transgenici, porta una vasta gamma di possibilità di imitare l&#39;eziologia delle malattie neurodegenerative umane 2. Proteomica approcci sono oggi disponibili per realizzare queste nuove prospettive nel campo delle neuroscienze. Gel elettroforesi bidimensionale (2DE) è un metodo semplice e potente probabile che permette di confrontare il proteoma di una vasta gamma di campioni. Inoltre, è anche unpotente metodo per isolare una proteina da una miscela complessa al fine di identificare e analizzare ulteriormente mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consiste essenzialmente in due fasi successive: 1) la separazione delle proteine ​​in base al loro punto isoelettrico (pI) da isoelettrofocalizzazione (IEF). Più precisamente, un potenziale elettrico viene applicato attraverso le strisce di acrilammide Immobiline tra un gradiente di pH e quindi proteine ​​migreranno e concentrarsi su un pI determinata in funzione della loro carica netta globale. 2) proteine ​​Isoelectrically focalizzati sono denaturati e caricati negativamente con l&#39;aggiunta di sodio dodecil solfato (SDS), in tal modo le proteine ​​nella loro prima struttura sono separati in funzione del loro peso molecolare apparente (MW) mediante SDS-PAGE 3. Queste due proprietà distinte ci permettono di affrontare un valore doppio di andare oltre nello studio del proteoma. Da un lato questo approccio offre la possibilità di effettuare una analisi quantitativa utilizzando coloranti minime metodo 2D-DIGE, e dall&#39;altro un qualitative analisi mini-2DE accoppiato al western blotting. Analisi quantitativa da 2D-DIGE conferisce espressione della proteina cambia tutto il proteoma del campione. In breve, i campioni vengono etichettati con tre cianine (CY2, Cy3 e Cy5) che emettono a tre lunghezze d&#39;onda distinte (blu, verde e rosso). Questi coloranti minime fluor contenenti N-idrossi gruppo estere succinimidyl reagiscono con il gruppo ε-amminico lysines residui di proteine ​​conseguente covalenti legami ammidici 4. Residui di lisina sono etichettati solo tra 1-3% e impedendo così più etichette, oltre a proteine ​​e importanti modifiche di carica al netto 5, 6. Cy3 e Cy5 sono spesso utilizzati per etichettare due campioni indipendenti mentre Cy2 tag un mix di uguale percentuale dei campioni da confrontare. I due vantaggi principali sono che tutti i campioni etichettati sono miscelati e IEF e SDS-PAGE sono svolte in un gel in una sola volta per ogni passo, evitando l&#39;inter variabilità tra esperimenti a causa di gel confronto. Inoltre, presenta una soglia alta rilevamento di circa 1 femtomole di proteine ​​7. Gel vengono analizzati e software 2D a confronto le immagini 2D fluorescenza gel, dove Cy2 serve come standard interno consentendo l&#39;identificazione delle differenze statistiche tra i punti per la loro identificazione posteriore mediante spettrometria di massa. Il software di analisi 2D utilizzando lo standard interno raggiunge un rilevamento rapido di meno del 10% delle differenze tra i campioni con più del 95% di confidenza statistica 8. Analisi qualitativa da mini-2DE è un passo cruciale per la caratterizzazione delle proteine. Il principio è lo stesso come precedentemente descritto per pI e separazione MW, ma in questo caso le proteine ​​vengono trasferite da una piccola gel di poliacrilammide ad una membrana e immunoblotting viene eseguita dopo. Mentre una elettroforesi su gel di dimensione fornisce cambiamenti nell&#39;espressione di proteine ​​per uno o più epitopi proteici in funzione della anticorpo, il information di mini-2DE dota di due parametri aggiuntivi. In primo luogo, le isovariants proteine ​​cambiano in funzione del pI, indicando che modificazioni post-traduzionali potrebbero aver luogo. In secondo luogo, l&#39;identificazione spettrometria di massa può essere indicativo di zimogeni plausibili e prodotti catabolici di proteine. Pertanto, le modifiche osservate da 2D-DIGE sono probabilmente indicativi dei meccanismi alla base cambiamenti nel profilo proteoma globale. Allineamenti di immunoblots tra i diversi campioni per la stessa proteina epitopo / s in mini-2DE possono riflettere i cambiamenti di acidità che faccia luce sulle variazioni post-traslazionali leggermente osservate o addirittura non da immunoblotting monodimensionale 9, 10. Inoltre, questa analisi informa circa i potenziali siti di taglio dovuti alla conoscenza del pI e MW dei residui metabolici 11,12. La combinazione di queste due tecniche fornisce un complementare analisi proteomica. Da un lato 2D-DIGE offre un tipicoe di differenze che permettono un isolamento precisa di polipeptidi la cui espressione è diversa. Queste differenze consistono essenzialmente nella comparsa o scomparsa di un punto o di aumento / diminuzione dell&#39;intensità di un dato da una analisi software dei gel fluorescenti. Tuttavia, queste osservazioni da soli sono difficilmente spiegare la natura della modifica osservato. Per queste ragioni, una volta che il polipeptide è isolato e identificato mediante spettrometria di massa, l&#39;uso di mini-2DE permette di confermare precisamente 1) l&#39;identità della proteina isolata e 2) la natura della differenza: variazione del livello isovariant / isoforma espressione, modificazioni post-traslazionali e processi di scissione per esempio. Tuttavia, è necessario sviluppare un tampone di lisi a partire sia compatibile con 2D-DIGE e mini-2DE per limitare i potenziali dispersioni derivanti dall&#39;uso di protocolli di estrazione che sono molto dissimili. Nel presente articolo, DEdescritto un protocollo adattato per la preparazione, estrazione e prestazioni delle tecniche mini-2DE per proteine ​​cerebrali provenienti da tessuti umani e mouse 2D-DIGE e.

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo</td><td>GE Healtcare</td><td>25-8010-65</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Reference in funzione dell'intervallo di pH/dimensione</td></tr><tr><td>IPG Buffer, pH X-X</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Reference in funzione dell'intervallo di pH desiderato</td></tr><tr><td>AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&nbsp;</td><td>GE Healtcare</td><td>551797N</td><td></td></tr><tr><td>DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td><td>GE Healtcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td><td>GE Healtcare</td><td>28-9334-92</td><td>Scatola di plastica per effettuare la reidratazione passiva</td></tr><tr><td>Filtro MILLEX GS</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Criterion XT Gel prefabbricati 13,3 x 8,7 cm (L x L)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Riferimento in funzione del MW per separare</td></tr><tr><td>l'unità di messa a fuoco isoelettrica IPGphor III</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td><td>GE Healtcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 mm&nbsp;</td><td>Azienda di gel</td><td>P2D1.5</td><td></td></tr></tbody></table>

protein consenso brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini cervello proteome uso sia 2d-dige e mini 2de immunoblotting

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Gel elettroforesi bidimensionale (2DE) è un potente strumento per scoprire le modifiche del proteoma potenzialmente correlati alle diverse condizioni fisiologiche o patologiche. Fondamentalmente, questa tecnica si basa sulla separazione delle proteine ​​in base al loro punto isoelettrico in una prima fase, e in secondo luogo in base al loro peso molecolare mediante SDS elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). In questo rapporto viene descritto un protocollo di preparazione del campione ottimizzato per la piccola quantità di tessuto post mortem e di cervello di topo umano. Questo metodo consente di eseguire sia l&#39;elettroforesi bidimensionale differenza di fluorescenza gel (2D-DIGE) e mini 2DE immunoblotting. La combinazione di questi approcci permette non solo di trovare nuove proteine ​​e / o modifiche proteine ​​nella loro espressione grazie alla compatibilità con rilevazione spettrometria di massa, ma anche una nuova comprensione convalida marcatori. Quindi, mini-2DE accoppiato ai permessi di Western blotting per identificare e convalidare postale-Traduzionali modifiche, proteine ​​catabolismo e fornisce un confronto qualitativo tra condizioni e / o trattamenti diversi. Qui, forniamo un metodo per studiare i componenti di aggregati proteici presenti in AD e demenza Lewy, come il peptide beta-amiloide e l&#39;alfa-sinucleina. Il nostro metodo può quindi essere adattato per l&#39;analisi del proteoma e proteine ​​insolubili estrarre dai modelli di tessuto cerebrale e topi umani. Parallelamente, essa può fornire informazioni utili per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nelle malattie neurodegenerative, nonché i potenziali nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici.

Proteomica sul tessuto cerebrale rimane difficile poiché nessun tampone ideale esiste per recuperare il 100% di proteine, proteine ​​del citoscheletro soprattutto associata alla membrana o. La prima serie di esperimenti si sono concentrati sulla ricerca di un tampone di lisi adatto compatibile con i due approcci e che consente di recuperare un grande pannello di proteine. Così, tre buffer di lisi sono stati analizzati per determinare la più appropriata. In primo luogo, è stato utilizzato il buffer comune biologia moleco...

Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine ​​da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è estrarre le proteine da tessuto cerebrale umano e murino per l'analisi proteomica. Questo viene ottenuto utilizzando un comune buffer di lisi per ottenere un'estrazione proteica uniforme, adattata ad approcci di elettroforesi bidimensionale. Successivamente, l'elettroforesi bidimensionale con differenza di fluorescenza (2D-DIGE) viene utilizzata per separare le proteine in vista dell'identificazione mediante spettrometria di massa.Successivamente viene eseguita un'elettroforesi bidimensionale in miniatura con immunoblotting per identificare le modifiche post-traduzionali. I risultati possono mostrare l'espressione proteica globale. Le variazioni traduzionali dell'ospite e tutti i prodotti legamentosi e catalitici si basano sulle differenze nel punto isoelettrico e nel peso molecolare.La combinazione di 2D dash e 2D monolo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroproteomica fornendo contemporaneamente informazioni sulle variazioni di espressione. Modificazione post-traduzionale e catabolismo nei prodotti iniziano con il prelievo e l'omogeneizzazione del tessuto cerebrale. Preparare il tessuto al 10% in peso/volume in tampone di estrazione per tessuto cerebrale umano.Omogeneizzare il tessuto utilizzando una pipetta in vetro, tuttavia utilizzare un omogeneizzatore in teflon per il tessuto di roditore al fine di disintegrare l'omogenato. Sottoporre a sonica a 60 hertz utilizzando 30 impulsi di mezzo secondo ciascuno. Successivamente, determinare la concentrazione proteica mediante saggio di Bradford utilizzando BSA come standard.Ora raccogliere le soluzioni per la precipitazione con cloroformio-metanolo in un secchiello di ghiaccio. Prevedere di raccogliere circa 125 microgrammi per strisce IPG da 11 centimetri o circa 1,25 milligrammi per strisce IPG da 18 centimetri. Una volta che le soluzioni hanno raggiunto i quattro gradi Celsius, eseguire la precipitazione completamente sul ghiaccio.Aggiungere prima tre volumi di metanolo, quindi uno di cloroformio. Agitare questa miscela. Successivamente, aggiungere tre volumi di acqua fredda.Vortexare la miscela per un minuto, quindi centrifugare il tubo campione a 12.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare il soprannatante. Successivamente, aggiungere tre volumi di metanolo, vortexare e centrifugare le proteine nello stesso modo.Asciugare il pellet proteico raccolto sotto flusso di gas azoto prima dell'elettroforesi 2D DIGE. Ri-sospendere la proteina nel buffer 2D a 2,5 milligrammi per millilitro. Successivamente, sottoporre i campioni a sonicazione come fatto in precedenza, fino al momento dell'utilizzo.Conservarli a meno 80 gradi Celsius prima di iniziare questo passaggio e dopo la precipitazione delle proteine. È necessario determinare nuovamente la concentrazione proteica mediante saggio di Bradford. Seguire lo stesso procedimento mostrato in precedenza prima della marcatura con il colorante psy.La qualità del campione proteico viene verificata mediante elettroforesi SDS-PAGE a tale scopo. Diluire 15 microgrammi di proteina in LDS e riscaldare a 37 gradi Celsius in un bagno termico o blocco riscaldante. Successivamente, eseguire l'elettroforesi su un gel di poliacrilamide e colorare il gel con soluzione di blu di Coomassie per almeno un'ora.Quindi lasciare il gel in una soluzione di acido acetico al 7% e alcol etilico al 10% per tutta la notte. Una volta stabilita la qualità del campione proteico, il giorno successivo si inizia la procedura di marcatura con SD. Misurare innanzitutto il pH del lisato, che dovrebbe essere basico o neutro.Il pH ottimale è 8,6 per le reazioni successive. Preparare quindi le reazioni di coniugazione con il colorante per ogni campione proteico. Mescolare 50 microgrammi con 400 picomoli di colorante S3 e 50 microgrammi con 400 picomoli di colorante S five.Eseguire questa procedura in quadruplo, per un totale di otto reazioni di accoppiamento D per campione. Per ciascun campione testato, preparare un insieme complementare di reazioni di accoppiamento DI utilizzando proteine provenienti da un controllo, ad esempio da un cervello malato. Successivamente, per ogni coppia di reazioni, impostare una reazione di controllo interno con 400 picomoli di CY due e una rappresentazione equilibrata di tutte le proteine per un totale di 250 microgrammi.L'etichettatura SAI si ottiene incubando tutte le miscele di reazione a quattro gradi Celsius al buio per un'ora. Dopo l'incubazione, combinare tutti i gruppi di tre reazioni ciano diverse in volumi di 150 microlitri, aggiungendo a ciascun gruppo di reazioni 200 microlitri di tampone 2D. Procedere quindi con i passaggi dell'elettroforesi bidimensionale.Iniziare preparando soluzioni di proteine non marcate per il gel preparativo da cui verranno escisse le macchie proteiche per ogni campione e per il controllo positivo. Aliquotare da 300 a 350 microgrammi di proteina non marcata nel buffer 2D e lasciarle idratare a contatto con la striscia IPG. Successivamente, caricare le strisce IPG e trasferire le proteine marcate e quelle non marcate in un'idratazione.Coprire quindi ogni pozzetto con una striscia reattiva IPG. Aggiungere un sovrastrato di olio minerale e lasciare che le strisce si riidratino passivamente con la soluzione proteica durante la notte a non più di 25 gradi Celsius. Il giorno successivo, eseguire la focalizzazione isoelettrica delle strisce IPG.Quindi rimuovere l'olio e conservare le strisce IPG a meno 20 gradi Celsius per equilibrarle. Immergerle nel buffer di equilibrazione per 15 minuti. Successivamente trasferire le strisce in acetammide al 4,7% IDO nel buffer di equilibrazione, privo di DTT, mentre si immergono le strisce.Utilizzare un sistema elettroforetico 2D di grandi dimensioni per preparare quattro gel SDS-PAGE al 12% per campione su lastre di vetro a bassa fluorescenza per le proteine marcate. Preparare inoltre un gel SDS-PAGE al 12% su lastre di vetro standard spesse 1,5 millimetri per ciascuna delle proteine non marcate. Questi sono i gel preparativi.Una volta raffreddati i gel, trasferire le strisce sulla parte superiore dei gel e ricoprirle con Aros 0,5% dopo il raffreddamento; quindi far correre i gel a 2,5 watt a quattro gradi Celsius per tutta la notte e analizzarli il giorno successivo. Molte reazioni 2D possono essere eseguite con campioni proteici utilizzati per i gel preparativi. Misurare meno di 100 microgrammi di campione in 200 microlitri di buffer 2D.Quindi vortexare vigorosamente le miscele campione e sottoporle a una breve centrifugazione. Caricare i campioni su strip IPG di 11 centimetri e lasciarle idratare passivamente tutta la notte, coperte con olio minerale, il giorno successivo. Eseguire la focalizzazione isoelettrica.Quindi spostare le strisce attraverso tre bagni di tampone di equilibrazione per 15 minuti per ogni bagno. Le strisce vengono quindi elettroforese su gel SDS-PAGE 2D. Posizionare ogni striscia su un gel prefabbricato del peso molecolare appropriato.Poliacrilamide per la proteina di interesse. Successivamente, trasferire i gel su membrana in nitrocellulosa PVDF e analizzarli con anticorpi nello sviluppo di questo protocollo. Tre diversi lisati.Sono stati testati dei tamponi. In primo luogo, è stato testato un comune tampone utilizzato in biochimica e biologia molecolare: Tris SDS.Il Tris SDS ha mostrato una risoluzione scarsa rispetto a un altro tampone testato, l'UTS. Il terzo tampone è stato escluso poiché non è stato possibile preparare campioni testabili con esso. Successivamente, sono stati analizzati i proteomi del cervello umano e murino.Sono stati confrontati campioni umani di controllo della corteccia e campioni della corteccia AD. Le proteine cerebrali di topi con patologia tau simile all'AD sono state analizzate anche a partire dal campione umano. SCI due è stato esaminato in modo indipendente, così come S SI tre e sci cinque per ciascun D. L'elevata risoluzione del punto ha facilitato l'allineamento.È stata utilizzata un'analisi qualitativa mini 2D per indagare le modifiche post-traduzionali e si è riscontrato che l'alfa-sinucleina nella legamentizzazione nel tessuto ad era presente con un profilo normale, ma è stata trovata anche come dimero indicato da un asterisco. Le frecce indicano i punti in cui è stata rilevata l'alfa-sinucleina. La proteina precursore dell'amiloide ubiquitinata è stata inoltre osservata mediante mini 2D.L'AD sporadica è stata confrontata con l'AD familiare. Nell'AD familiare, l'amiloide beta da 1 a 42 e la varianza ISO sono presenti a concentrazioni inferiori poiché sono state riscontrate forme di ligatura a otto chilodalton. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare il proteoma al fine di confrontare campioni complessi misurando le modifiche nell'espressione proteica.

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Qui, presentiamo un'elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per separare e identificare adenoma pituitario umano tessuto proteoma, che presenta un modello 2DE buona e riproducibili. Molte proteine sono osservati in ogni spot 2DE analizzando nel complesso cancro proteoma con l'uso di MS ad alta sensibilità.

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In questo articolo esaminiamo gli effetti di Theta Burst stimolazione TMS sulla plasticità corticale in soggetti affetti da sindrome dell'X fragile e gli individui nello spettro autistico.

TMS: Utilizzo del Theta Burst protocollo Esplora Mechasnism di plasticità in individui con Sindrome X Fragile e autismo

Impara a estrarre proteine da tessuti cerebrali umani e murini per analisi proteomica. Questo metodo utilizza 2D-DIGE e mini 2DE con immunoblotting per identificare modificazioni post-traduzionali e caratterizzare il proteoma cerebrale.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti delluomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting (Video) | JoVE Journal

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell'uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

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